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1、土壤有机农药污染微生物修复及降解菌基因工程研究进展,摘要,农药是一类重要的环境污染物，给全球生态环境带来严重问题。微生物修复技术是利用微生物的生命活动对有机农药的降解作用使受污染土壤恢复到健康状态的过程。本文综述了微生物强化修复的研究热点问题及农药降解菌筛选和降解途径的研究，并阐述了农药降解基因工程菌构建研究中所存在的问题。,引言,有机农药是人们主动投放于环境中数量最大、毒性最广的一类化学物质。许多农药对人和非靶动物具有内分泌干扰作用、“三致”作用（致癌、致畸和致突变）或潜在“三致”作用。无论采用什么方式施药，大部分有机农药都直接进入土壤，农药的长期施用已使土壤环境受到普遍污染。在生态系统中，
2、微生物对环境中残留农药的降解起着重要的作用。从自然环境中驯化和筛选出来的土著微生物对农药有一定的降解作用，但是其降解效率受微生物对污染物降解能力和诸多环境条件的限制。因而，人们引入一项新兴的生物技术构建高效基因工程菌，来提高对污染物的降解效率和适应各种环境条件。,1 有机农药污染土壤的微生物修复概述,1.1 微生物修复概述微生物修复是利用微生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度，使受污染土壤恢复到健康状态的过程。微生物修复技术可分为：原位修复、现场修复和异位修复,1.2 生物强化技术在具体修复工程中，如果土壤中的土著微生物不能满足要求(如降解效率太低等)，就要采用生物强化技术。生物强
3、化技术就是用改良微生物组成来改善对污染物的处理效果。,目前的生物强化技术主要是指在生物处理系统中投加具有特定功能的微生物来改善原有系统的处理效果。一般投加到处理系统中的微生物可以是原处理体系的，经驯化、富集、筛选、培养使原系统的微生物组成形成对某些难降解有机物有更强去除效果的稳定微生物体系。另一种方式是向处理系统中投加原来不存在的外源微生物，使体系原本无法处理的污染物得到有效去除。通常这2种强化方法在实际应用中都有采用，这主要取决于原有处理系统中的微生物组成和所处的环境。,1.3存在的问题,首先，虽然已经筛选到许多有机农药降解菌，但高效菌种不多；其次，降解菌的降解谱不够广，不能完全代谢有机农药
4、中各组分；另外，许多实验室得到的高效降解菌在实际应用中效率不高，修复效果不理想。,分子生物学的发展为人们提供了修饰微生物遗传组成的技术，可构建新的微生物。这些新的微生物具有现有微生物不具备的分解代谢能力，或者能在现有微生物不适合的条件下进行分解活动。这对于提高降解速率、增强生物修复效果是非常重要的。,2.有机农药微生物降解机理,构建高效降解菌的基本策略可从优化污染物的降解途径、提高污染物的生物可利用性和增强降解菌的环境适应性等方面考虑。基本思路有重组互补代谢途径及改变污染物代谢产物流向、重组表面活性剂编码基因、重组污染物跨膜转运基因等。主要构建技术有基因工程技术、细胞工程技术等，其中细胞工程技
5、术主要是细胞融合技术。,农药的生物降解性研究是构建基因工程菌的前提和基础，主要包括农药降解菌株的筛选及其降解特性研究和农药降解途径与降解酶的研究。,2.1 农药降解菌的筛选及其降解特性的研究,为获取降解农药的微生物菌株，可以从现已收藏的菌种中筛选，亦可以从污染环境中直接筛选或经富集培养获得。降解菌的富集培养方法主要有：液体培养法、土壤环流法、连续流动法。通常是从长期被某种农药污染的土壤、水体或底泥中取样经富集培养，再经固体培养分离纯化得到所需菌株。,2.2 农药降解途径和降解酶的研究综合来说，农药微生物降解的途径包括氧化、还原、水解、脱卤、缩合、脱羧、异构化等过程。大多数农药的微生物降解途径已
6、经比较清楚。,农药的微生物降解难易程度取决于其化学结构的复杂性和降解酶的适应性。研究表明，微生物降解农药一般有 2 种方式：一种是以农药作为唯一碳源和能源，对于含氮或磷的农药，有的微生物也能以农药为唯一氮源或磷源进行代谢；另一种是将农药与其它有机质进行共代谢。,3 农药降解基因工程菌的构建,3.1 农药降解基因工程菌的构建策略构建高效的基因工程菌可以显著地提高对污染物的降解效率。环境微生物中污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供可能。,3 个角度来构建高效基因工程菌：一是通过重组互补代谢途径、改变污染物代谢产物流向和同源基因体外随机拼
7、接来优化污染物的降解途径；二是通过重组表面活性剂编码基因和重组污染物跨膜转运基因来提高污染物的生物可利用性；三是通过重组微生物抗性机制相关编码基因来增强降解性微生物的环境适应性。,3.2农药降解菌基因工程的研究概况,研究表明，污染物降解酶由降解质粒或染色体基因编码。降解质粒和染色体基因可能分别编码某一污染物不同降解途径的酶，两者相互补充。利用降解质粒的相容性，能将降解不同污染物的高效专一的质粒组合到一个菌株，组建成一个多质粒的可同时降解多种不同污染物或能够完成某一污染物降解过程的多个环节的新菌株。新菌株不仅效率高、功能多、对温度和 pH 值的适应范围广，而且生长条件可以根据使用条件的不同进行调
8、整，甚至可以成为极端菌以适应极其恶劣的自然环境。,3.3 农药降解基因工程菌构建中存在的问题,利用降解质粒的相容性和自由转移性，可以使一个菌株内存在许多具高效降解能力的质粒。但是，过多的质粒存在于同一菌株细胞中将会增大细胞的负担，从而使菌株生长和繁殖速度在一定程度上减慢，这就不利于污染物的高效处理。还一个问题是由于质粒容易在微生物的繁殖过程中遗失，这对微生物降解能力的长期稳定性非常不利。,质粒本身除了相容性外，还具不相容性，这样使得质粒的一些好的性状不能够通过质粒转移而组合到同一菌株细胞中，给构建多质粒的工程菌带来一定困难。再者，质粒很容易受外界因子的影响，使得它的降解能力下降，甚至丧失，并且
9、降解性质粒除了编码已知的降解能力外，还可能编码一些目前已知或未知的与降解能力无关或不利降解的功能，它们的存在和表达不利于菌株高效地降解污染物。,利用原生质体融合技术进行降解工程菌育种的研究取得很好的成绩，但是，利用此技术最主要的困难是便于检测的遗传标记的寻找。常规的遗传标记如抗药性等通过诱变后可得到，但细胞降解酶活性通过诱变作用后可能会降低，甚至丧失，这样合适的遗传标记很难找到。另一个问题是原生质体融合技术在构建工程菌过程中使得不必要或对降解能力不利的基因整合到菌株中，使得其降解能力有所下降。,通过生物工程技术构建的具有高效降解能力的工程菌进入自然环境后，存在着很大的安全隐患，可能对人类自身的生存和生态环境的平衡造成不利影响。所以，用于环境污染物处理的工程菌应用的安全性问题是人类最关注的问题，它对环境和人类造成的影响是长期的，不是在很短的时间内就能检测到的，并且也没有一个很有效的手段和方法对其进行预测。,有机农药污染微生物修复是一种高效、经济和生态可承受的清洁技术，值得大力推广。在农药降解菌的筛选和农药降解机理与途径的探索方面，关于降解性质粒和降解基因的研究工作还有待进一步开展。随着基因工程技术的发展，工程菌的构建和应用为保护生态环境和人类健康提供了一条可行的途径。在不久的将来有望出现更多更高效的降解基因工程菌，为生态修复和 GAP 生产起到积极的作用。,谢谢观赏,
