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1、胚胎干细胞的来源和培养的技术和条件体外受精会产生多个胚胎。这会产生一些过剩的胚胎不用于临床或不适合植入患者体内，因此可以在征得供体同意的情况下可能获得捐赠。人类胚胎干细胞可以从这些捐赠的胚胎中获得，或者还可以使用患者的细胞和捐赠的卵子从克隆的胚胎中提取。胚胎囊胚期的内细胞团（感兴趣的细胞）与滋养层细胞分离，滋养层细胞将来分化为胚外组织。从免疫外科来说，通过抗体结合到滋养层细胞并且被另一种溶液去除，与此同时进行机械解剖以实现（内细胞团的）分离。获得的内部细胞团细胞被接种到提供支持的细胞上。内部细胞团细胞附着在一起并进一步扩张形成未分化的人胚胎细胞系。每天需给这些细胞提供养分，而且每四至七天需通过
2、酶解或机械分离一次。为了发生分化，将人胚胎干细胞系从支持细胞中取出以形成胚状体，然后与含有必要信号分子的血清共培养，或者移植到三维支架中以产生。胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团，这些细胞团是从供体雌性动物身上获得的。马丁,埃文斯和马修考夫曼报道了一种延迟胚胎植入的技术，该技术允许内细胞团数量增加。这个过程包括摘除捐献者母亲的卵巢，给她注射黄体酮以改变激素环境，从而使胚胎在子宫中保持自由。在子宫内培养4-6天后，胚胎即被收获并在体外培养至内细胞团形成卵圆筒状结构，此时内细胞团分离成单细胞，并铺在用丝裂霉素C处理的成纤维细胞上（以防止成纤维细胞进行有丝分裂）。克隆的细胞系是由单个细胞生长而成的。
3、埃文斯和考夫曼表明，从这些培养物中生长出来的细胞可以形成畸胎瘤和胚状体，以及可以在体外分化，以上结果表明这些细胞具有多能性。盖尔马丁以不同的方式获得和培养她的胚胎干细胞。她从交配后大约76小时的捐献者母亲身上取出胚胎，并在含血清的培养基中培养过夜。第二天，她通过显微外科手术从晚期胚泡剥离出内细胞团。提取的内细胞团在含有血清的培养基并用丝裂霉素C处理的成纤维细胞上培养，并根据胚胎干细胞的状态作调节。大约一周后，细胞系形成。这些细胞在培养物中生长并表现出多能特性，如形成畸胎瘤、进行体外分化和形成胚状体的能力。马丁称这些细胞为胚胎干细胞。目前已知饲养细胞提供的白血病抑制因子（LIF）和血清中提供的骨形态发生蛋白（BMPs）对于阻止胚胎干细胞的分化是必需的。这些因子对胚胎干细胞的衍生效率极其重要。此外，研究表明不同的小鼠品系具有不同的分离胚胎干细胞的效率。58小鼠胚胎干细胞目前的用途包括制备转基因小鼠，包括基因敲除小鼠。对于人类治疗，需要具有患者特异性多能细胞。人类胚胎干细胞的生成产生更加困难，并面临伦理问题。因此，除了人类胚胎干细胞研究之外，许多团队更关注于诱导多能干细胞（iPScel的产生。
