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1、HCV分子分型方法,丙肝病毒HCV,1975年,英国Lancet杂志首次使用非甲非乙型肝炎这个名词1989 年,HCV cDNA 克隆成功,并正式命名HCV1991年国际病毒命名委员会(ICTV)将HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属,HCV全球分布情况,HCV基因,其基因组为单股正链RNA,易变异。全长9.6 kb341 b的5非编码区(5NTR,NCR,UTR)27b的3非编码区(3NRT)。在病毒复制中,氨基酸有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)羧基端有4个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5),HCV 基因分型分类系统,不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系统主要的命名系统有:Chan
2、系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名系统第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上,制定了统一的命名系统-Simmonds系统,目前认为主要有6种HCV基因型及不同亚型,以阿拉伯数字表示HCV 基因型,以小写的英文字母表示基因的亚型(如1 a、2 b、3 c等)。,HCV 基因型分布,北美:1,3,2南美:1,2,3欧洲:1,3,2非洲:2,1,3,4,5,6亚洲:2,1,3,4,6中东:4中国：1b，2，6,HCV 基因分型区域的选择,最准确的方法就是对基因组的某个区进行PCR 扩增、测序及进化树分析,选择的区有NS5、Core、E1和5UTR通常建立在5
3、 UTR,因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域,基因分型的分子学方法,（1）测序法：测全长或片段 金标准 费时费力 不适于临床,（2）基因型特异性引物PCR法,Okamoto等首先采用分型的效果仍比较差需使用7对引物,Okamoto H et al.J Gen Virol.(1992)Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers:application to clinical surveys and tracing infectious sources.,(3)型特异性探
4、针杂交(LIPA),将生物素或荧光素标记型特异性探针固化相化在膜或芯片与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交是建立在5非编码区基础上有5%10%的1 a、1 b 型不能鉴别,也不能区别2 a 和2 c 型。,Stuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al.Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping Jjourhal of Clinical Microbiology，1996；34：2259,HCV genotypes in Northern Italy:a survey of 1368
5、histologically proven chronic hepatitis C patients,(4)限制性片段长度多态性分析(RFLP)法:,用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段该方法常用的酶为HaeIII、RsaI、Mva I、Hinf I、Scrf I该方法检测基因型的精确度为97不能区分所有的HCV基因亚型也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型，,Davidson F,Simmonds P,Ferguson JC,et al.Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus
6、 using RFLP of sequences amplified from the 5non-coding region.J Gen Virol,1995,76:1197-1204.,(5)遗传发育关系进化树,对一定区域的样本测序结束后可将序列互相比较分析样本间序列的进化距离,画出该区域内HCV 流行的关系进化树,观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点,（6）特异引物错配延伸法(PSMEA)：,利用taq酶在引物3末端发生错配时无法继续延伸借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达到分型目的该方法成为检测混合HCV基因型感染的方法比直接测序灵敏度高20倍,Antonishyn NA,Ast V
7、M,McDonald RR.et al.Rap id genotyping of hepatitis C virus by primer-specific extension analysis J.Clin Microbio,l 2005,43:5158-5563.,（7）异源分子迁移率法（HMA）：,用已知不同型的HCV 参比DNA 与未知基因型的HCV 的DNA 分子混合、变性、退火,形成同源、异源分子,这些分子在PA GE 中迁移率不同,并同异源DNA 中不同碱基的数目成比例,来鉴定基因型 王林,徐东平,张灵霞.丙型肝炎病毒基因型分型及临床意义 J.肝脏2006,12:416-417.,
8、（8）COMA基因分型法：,原理是基于长异源双链的解链特性不同用已知的序列顺序的参考DNA捕获液相中未知的DNA两者形成异源双链杂交体，由这个杂交体的两条单链间解链曲线的差异可以推断出其序列差异,Genotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay(COMA).Kostrikis LG et al.Mol Med.(1998),（9）Taqman探针实时PCR测试法,这一方法用到了Taqman探针(针对5 UTR)结合荧光实时PCR,M Lindh，Harmoun CGenotyping of hepatitis C virus by Taqman realtime PCIKJournal of Clinical Virology，2005；34：108,（10）应用DNA芯片技术,指将成千上万种核酸探针固定在一块指甲大小的支持物上通过分析待测样品与芯片的杂交信号可得到大量遗传信息,施英娟基因芯片检测血清标本的丙型肝炎病毒基因型南通大学学报(医学版)，2005；25(2)：92,谢谢！,
