植物离体细胞发育的细胞学基础.ppt

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1、第三章植物离体细胞发育的细胞学基础,3-1 植物细胞的离体发育,一.花粉小孢子离体发育途径,花粉孢子体的发育途径可主要归纳为为A,B,C三条(Sunderland，1974)：（一）A 途径(A route)：特点：小孢子第一次有丝分裂仍按配子体方式进行：即非均等有丝分裂，形成一个营养核（v）和一个生殖核（g），并经不同分裂形成多细胞花粉粒和多细胞团。,A-V 途径：营养细胞发育成单倍性胚状体，生殖细胞退化消失。在烟草、颠茄、大麦、黑麦、小麦、水稻、玉米等中存在。A-G 途径：生殖细胞发育成单倍性胚状体，营养细胞退化消失。在天仙子中发现此途径。,（二）C 途径(C route)：,生殖细胞和营

2、养细胞先融合后分裂，共同形成多细胞花粉，产生非单倍体植株。在此途径中，常会发生生殖核的核内复制（Endoreduplication of generator）。在毛叶蔓陀罗和小麦中发现此途径。,（三）B 途径（B route）,特点：花粉单核小孢子第一次核内有丝分裂为均等分裂。即小孢子分裂成两个大致相等、类似分生细胞的营养型细胞，并连续不同分裂，形成不同倍性的多细胞花粉。其典型作物是毛叶曼陀罗，在小麦、小黑麦、水稻、橡胶、杨树、玉米等植物中已见到这种发育途径。大概有三种方式：,B-1 形成的两个营养型细胞在以后的几次分裂中是同步的，则大多数以胚状体的形式形成花粉胚。B-2 形成的两个营养型细胞

3、在以后的几次分裂中是不同步的，其中一个停止分裂，或快或慢分裂，并存在于花粉的一侧。另一个经过相当长时间的持续分裂，则形成愈伤组织。B-3 形成的两个营养型细胞在不同时期发生核融合或核内复制，结果产生不同倍性的花粉胚。,（四）E 途径（E route）,特点：花粉内的营养核和生殖核独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似于其母细胞。,近年来在蔓陀罗、水稻、玉米中发现了此途径。,研究花粉发育途径的意义:,研究花粉孢子体启动第一次分裂的条件，揭示小孢子发育过程中各种诱导因子对离体花药(花粉)培养的必要性。如2,4-D对对愈伤组织的形成是必需的，而胚状体的形成不是必需的；有利于研究花粉毡绒层细胞等

4、其他花药组织细胞的作用，研制大幅度提高花粉胚诱导频率的新技术：,如Nitsch曾经计算过烟草一个花药具有产生1440棵植株的潜力，而实际上只能形成30多个植物体；了解不同倍性花粉植株的来源，为杂交育种提供原始材料：只有纯合二倍体植株，才是育种的最理想的和需要的；研究细胞分化和胚胎发生规律。花粉发育是从单细胞开始的，追踪研究从单细胞到完整植物体的全过程，有利于研究胚胎发育中的调控机理。,二.胚珠和雌核的发育途径,大孢子母细胞(胚囊母细胞),单倍性的四分体,减数分裂,只有远离珠孔端的一个细胞发育,胚囊细胞,8细胞胚囊,3次有丝分裂,1.雌核发育,由单核至成熟胚囊时期均能诱导雌配子体的细胞发育成愈伤

5、组织。但直到形成成熟胚囊时，才启动向愈伤组织发育。2.子房和胚珠培养中的胚胎发生 在子房和胚珠培养中，除胚囊细胞发形成再生植株外，胚囊以外的珠柄、珠被和子房壁细胞均有可能发育形成不定胚而产生二倍体再生株。,由未授粉的胚囊形成愈伤组织大致有两种可能：孤雌生殖：由未授精的卵细胞单倍体无融合生殖 形成单倍体胚（减数的胚囊）无胚子生殖：由助细胞、反足 细胞发育成单倍体胚 二倍体无融合生殖：由胚囊中未经减数分裂的孢 原细胞形成二倍体胚。,水稻未授粉子房培养中发现，再生的单倍体小植株来自于助细胞无胚子生殖(周嫦等，1981；黄群飞等，1982)。大米胚囊中的卵细胞、反足细胞、助细胞都可能产生胚，并认为,卵

6、细胞和反足细胞起源的原胚再生植株较好，助细胞仅产生愈伤组织。,3-2 体细胞离体再生的基本类型及特点,一.不定芽型(Adventitous bud type)芽外植体 不定芽 再生植株。特点:利用外植体原有的芽，不仅繁殖率高,而且能保持该植物和的遗传稳定性。,芽-芽型,大蒜茎尖培养,二.直胚型（embryo）,特点：遗传性一致，但繁殖率低。,种子或胚 芽（带芽原球茎)植株。,桃幼胚培养,直胚型（embryo）,桃儿七幼胚培养,三.器官型(Organ type),器官外植体 不定芽 再生植株。如石龙芮、烟草、水仙、百合、风信子、贝母的鳞片培养诱导不定芽等；特点：遗传性较稳定，繁殖速度较快。,非芽

7、-芽型,石龙芮下胚轴胚状体的发生A、培养一个月的幼苗，下胚轴上产生许多胚状体；B、下胚轴部分放大；C、两个表皮细胞；DG 原胚发生过程；J、心形胚状体；H、I 已分化子叶、胚根及原维管束的胚状体。,器官外植体 愈伤组织 分化再生植株。特点：繁殖速度快，但遗传性不稳定。,四.器官发生型（Organogenesis),叶片、花药茎尖、根,五.类胚体发生型(Embryogenesis),植物器官、组织和细胞 胚状体 再生成苗。特点：遗传性一致，有些植物繁殖率较高。如胡萝卜1 L培养基有10万个以上的胚状体。,未授粉胚珠,植株,3-3 离体细胞胚胎发育的细胞学基础,一.体细胞胚发生的细胞胚胎学过程,(

8、一）单子叶植物的胚胎发生,1.合子胚发生的基本特点 植物有性繁殖中,卵细胞受精后称为合子(zygote),它经预定的发育方式产生胚(embryo),故胚的发育是从合子开始。在胚发育早期,从二细胞胚至器官分化之前的胚胎发育阶段称为原胚(proembryo)时期。合子的第一次分裂为不均等分裂。,2.体细胞胚发生的基本特点,1）发生过程与合子相似:在离体条件下诱导体细胞胚胎发生与相应的合子胚发生过程大同小异：,2、体细胞胚的第一次分裂虽多为不均等分裂，但也有近似的均等分裂。,3、胚性细胞发生具有不同步性,胚性细胞的继续分裂形成多细胞原胚。由于胚性细胞分裂是不同步的,因此在同一张切片上既可看到单个的胚

9、性细胞,又可见到二细胞,三细胞和四细胞，以致多细胞原胚并存的多样化原胚细胞群体。,不同步产生的原因：,从脱分化形成愈伤组织后,再转移诱导分化胚性细胞时,细胞状态和启动分裂的不一致,而存在多样化的原胚细胞群。在某些条件下,体细胞胚发生是有先后或反复进行的,新的胚胎发生中心有可能从原胚细胞群中或从胚体中产生。,克服不同步的可能方法,提高接种物的均匀性：在培养基中加入DNA合成抑制剂 转移培养时过筛分离；通过在含2%蔗糖的16%Ficoll溶液中离心过滤 将分离物转至无激素培养基上即可同步；抑制额外或次生胚的产生：使用ABA。有实验证明，ABA在控制“重复胚胎发生”或“畸形胚”的形成是有效的。,（二

10、）双子叶植物的胚胎发生,1.合子胚的发生特点 双子叶植物与单子叶植物之间有相似的发育形态：成熟胚都包含一个具子叶的胚轴(embryonal axis)，分为上胚轴(epicotyl),和下胚轴(hypocotyl)。最下端产生胚根(radicle)。被子植物中单子叶植物一片子叶,双子叶植物两片子叶。,双子叶植物胚胎发生的细胞学特征（拟南芥）不同线条表示胚胎与幼苗之间结构上的对应关系,2.体细胞胚发生的基本特点,与合子胚相似，仍存在不同步问题等。胚性细胞多由愈伤组织表层或近表层的薄壁细胞分化而来：其核大，位于细胞中央，质浓，第一次有丝分裂既可不均等分裂，也可为均等分裂：,二.体细胞胚发生的超微结

11、构与生物化学,（一）胚性细胞的超微结构 1、核增大，细胞器数量增多：特别是线粒体(mitochondrion)数量明显增加。,愈伤组织圆形薄壁细胞的核增大,核仁着色深,一般具 有两个以上的核仁，大液泡消失，细胞质电子密度明显加强，质体plastid),核糖体(ribosome)，特别是线 粒体(mitochondrion)数 量明显增加,同时核糖体不仅数量增加,而且聚集成多聚核糖体(polyri-Bosome or polysome)。,2.广泛存在着胞间连丝(plasmodesmata)：,早期胚性细胞与周围细胞间还存在广泛的胞间连丝通过胞间连丝传递物质和信号，为胚性细胞的进一步分化与发育奠

12、定了基础。,3.细胞膜上有分泌泡的形成：,其内含一些被消化的细胞器和残渣。,4.细胞拉长，核偏移,细胞壁加厚，细胞器持续增加：,随着胚性细胞的发育,细胞拉长，核偏移,细胞壁加厚，线粒体（M）数目进一步增加,常连片分布于细胞质中,既有大量游离核糖体,又有多聚核糖体存在,并出现高尔基体(golgibody)和微管(microtu-bule)等。,小麦体细胞胚微结构的变化,小结,体细胞胚胎发生的脱分化与再分化。体细胞胚胎发生过程与合子胚类似，第一次分裂多为不均等分裂，也有近似的均等分裂。但胚性细胞发生具有明显的不同步性。胚性细胞核增大，偏移,细胞器数量增多，特别是线粒体 数量明显增加。细胞壁加厚，且

13、存在着胞间连丝。,（二）体细胞胚发生的生物化学,1、ATPase增高并逐渐由质膜转入细胞内,推测：胚性细胞是通过外源激素的诱导而启动的。因为外源激素作用的部位是质膜，首先诱导膜蛋白的合成，于是导致膜ATP酶活性提高。,后期：ATP酶活性从细胞质膜逐渐转入细胞内，并在细胞壁的加厚处也出现ATP酶活性反应的沉积物。,推测：处于“生理隔离”晚期的胚性细胞或胚性细胞团一直处于一个厚壁包围之中，与其周围细胞之间的胞间连丝也消失。ATP酶的广泛存在和保持较高活性为胚性细胞或原胚的一系列代谢提供了能量保证。,2.蛋白质含量升高,胚性愈伤组织蛋白质含量远高于非胚性愈伤组织；体细胞胚的可溶性蛋白质含量高于胚性愈

14、伤组织；体细胞胚发育过程中，蛋白质含量高低依次为：（g）以成熟胚为单位,可溶性蛋白质含量随胚体的增加而升高。,3.淀粉含量有所增加,淀 粉 粒 初期 发育中的 二细胞 多细胞 球形胚 成熟胚 胚性细胞 胚性细胞 原胚 原胚,小麦体细胞胚发生过程中淀粉粒消长动态与小麦合子胚基本一致；单子叶与双子叶植物体细胞胚发生过程中淀粉粒消长动态趋势相似；,4.DNA含量增加明显,应用3H-胸苷(3H-dT)标记,放射自显影方法研究表明:愈伤组织转入“胚发生培养”4h后，标记的细胞数和标记量逐渐增加，到“球形胚”时DNA合成速率达到最高峰.,随着体细胞胚的发育,DNA合成明显增加:,8822,5.内源激素含量

15、升高,(1)胚性愈伤组织(EC)的内源激素含量远高于非胚性愈伤组织(NEC)；(2)胚性细胞中内源GA水平较低，非胚性细胞中较高。GA可能对体细胞胚发生有负作用；,(3)ABA/IAA和ABA/GA的比值一直是EC高于NEC，显然丰富的内源激素含量，可能是体细胞脱分化并形成胚性细胞和保持胚胎发生能力不可缺少的因素；(4)补加适量的外源ABA（4molL-1），可明显提高体细胞胚发生的频率与质量（促进发生和抑制畸形胚）。(5)ABA合成抑制剂不仅降低内源ABA 含量,而且抑制体细胞胚胎发生。,3-4 体细胞胚的起源与遗传稳定性,一.体细胞胚的起源 1.绝大多数体细胞胚是起源于单细胞，证据：从多种

16、植物中都观察到单个的胚性细胞、均等分裂的和不均等分裂的二细胞原胚；在一块愈伤组织中或一张切片上可观察到多个不同发育时期的体细胞胚。,在红豆草单细胞悬浮培养中也观察到单个胚性细胞具有明显极性，第一次分裂多为不等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。在石防风悬浮培养的体细胞中也观察到无丝分裂，其中多为缢缩分裂，形成两个细胞核；,3H-胸苷(3H-dT)标记实验表明,开始是愈伤组织外层少数细胞被标记。接着另一些薄壁细胞被标记，这部分的细胞从形态上相继转变为胚性细胞。,2.关于来源于多细胞的问题,用同位素脉冲标记实验可以证明，一些形成的胚性细胞团也是由一个单细胞连续分裂而

17、形成的。当然也不排除有些植物的体细胞胚的确是起源于多细胞的，有待深入研究。,3.体细胞转化为胚性细胞的渐变理论,即一个细胞系的发生与形成是一个特定基因组中基因活化的结果：一是预定阶段，即细胞在脱分化时基因所处的特殊状态（预定性）；二是表达阶段，在适合的诱导条件下,预定的细胞发生一系列的生理生化和形态上的变化,表现出分化的特性。这一特性是不稳定的。,通过调节培养基成分、激素组成与配比继续进行诱导,二.极性与生理隔离,1.体细胞胚胎发生的“双极性(double polarity)”：垂周分裂和平周分裂 极性分化的诱导因素：植物激素和外界刺激引起不均等分裂和基因表达产物的不均匀分布：合子在休眠期中，

18、细胞质和细胞核都集中在一端,形态发生显著的变化。,小麦的胚性细胞的细胞核和质向一端偏移,细胞器、核糖体和质体等都有区域性集中分布现象,并和细胞核偏移的方向一致。红豆草体细胞胚、胡萝卜体细胞胚发生中，DNA和RNA的合成同样具有极性化集中区域。,2.生理隔离(physiological isolation)：,即胚性细胞与周围细胞或组织形成明显界限的现象。“细胞生理隔离”与“组织生理隔离”？合子胚：被子植物的胚囊减数分裂后,形成的大孢子是与周围细胞处于分开的状态。在小孢子发生时,小孢子母细胞在减数分裂前期也与绒毡层的细胞间没有联系。,体细胞胚：,Steward从胡萝卜体细胞胚胎发生中同样观察到与

19、母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于相对独立的状态。多种植物中都观察到,早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝,但随着胚性细胞的发育,细胞壁加厚,胞间连丝消失或被堵塞。胚性细胞开始分裂,从二细胞原胚到多细胞原胚始终被厚壁所包围,与周围细胞形成明显的界限。,3.发育竟争现象,胚性细胞形成后，并不是所有的都能进一步发育成体细胞胚，这里除了培养诱导条件外，细胞间的相互作用与竞争是重要的因素。只有那些从周围细胞获得能量、物质的那些胚性细胞才可继续分裂和分化：,证据：在这些胚胎迅速发育过程中，相邻细胞逐渐处于解体状态，以致在体细胞胚周围出现较大的缝隙，与其邻近细胞隔离开处于相对独立的情况。因而如

20、何改善条件,减少细胞间相互竞争作用是提高体细胞胚发生频率的重要途径。,由此推测,在胚性细胞的发生与发育过程中处于相对独立状态,有利于胚胎发生潜力的表达。但生理隔离也只是相对的,并不意味着它们与周围组织在生理上完全隔离开,在体细胞胚发生与发育过程中,必须从周围细胞中取得营养、能量和激素等,不仅有相互依存关系,而且有相互竞争的关系。生理隔离可能是营养竞争的结果。,三.遗传稳定性与变异性,1.遗传稳定性：一般认为,通过体细胞胚发生途径形成再生植株是相对稳定的。理论依据是：只有那些未经过畸变的细胞才有可能形成体细胞胚。人工种子的制作,优良种质的保存和无性系繁殖等,正是基于体细胞胚的基因型与原亲本的相同

21、性。,2.变异性发生的普遍性,小麦幼胚作为外植体,通过体细胞胚发生途径建立体细胞无性系,在其后代中出现广泛的变异,包括单基因控制的质量性状变异,如粒色、蜡性和颖色变异;多基因控制的数量性状变异,如株高、抽穗期变异等。宁夏枸杞叶片离体培养形成的再生植株根尖细胞染色体发生明显变异。,60.64,64.30,无性系的变异是极其广泛的：,五种不同愈伤组织的染色体变异 愈伤组织来源 观察细胞数 变异细胞数 变异频率(%)变异范围 烟草叶片(n=24)127 98 77.2 896 枸杞叶片(2n=24)126 81 64.3 648 伊贝母鳞茎(2n=24)64 39 60.9 1360 白兰瓜子叶(2

22、n=24)217 166 76.5 8162 山黧豆胚根(2n=14)211 155 73.5 6140,3.染色体数量与结构变异的原因：,数量变异：如核融合、核内有丝分裂、核内染色体复制等产生整倍多倍体；一些不正常的有丝分裂则导致产生非整倍体，如多极分裂、落后染色体、染色体后期桥等；结构变异：分裂过程中染色体的重复、缺失、易位和倒位等。,易位,2n14,4.外源植物激素在染色体变异中的作用,激素成分对贝母鳞茎离体培养中染色体变异的影响 激素组合 观察细胞数 变异细胞数 变异频率(%)变异范围 2,4-D 55 19 34.5 1242 IAA 63 17 27.4 541 NAA 51 12

23、 23.5 738 2.4-D+KT 64 39 60.9 2260 IAA+KT 69 36 52.2 2148 NAA+KT 73 23 31.5 1241 2,4-D、IAA、NAA各lmg/L 2,4-D+KT,IAA+KT和NAA+KT,KT的浓度均为0.1 mg/L，20天后进行检查。,5.继代培养时间对培养细胞染色体变异的影响,愈伤组织继代培养的次数与细胞染色体变异的频率呈正相关，即细胞倍性混乱程度增大，异形核细胞比 例增加。,伊贝母愈伤组织继代培养对染色体变异的影响 继代 培养 观 察 变异 变异频率 非整倍体 非整倍体 次数 天数 细胞数 细胞数(%)细胞数 细胞频率(%)1

24、 43 82 52 63.4 50 61.0 3 122 112 74 66.1 74 66.1 5 203 77 53 68.8 51 66.2 7 279 85 69 81.2 66 77.6 9 427 71 63 88.7 63 88.7,3-5 离体培养器官发生的调控机制,在合适的培养条件下，离体的组织或细胞可以脱分化、再分化形成任何我们所需的芽、根、叶、花，并逐步发育成完整的植株。植物器官再生的种类受内、外两种因素控制，即外植体的来源和所处生理状态与培养时使用的激素种类和浓度。,一.离体培养过程中的发育事件,感受（competence）：某些细胞对激素的诱导产生反应。应答（comm

25、timent）：产生反应的细胞发生特异的细胞分裂，向形成器 官原基发育。发育（development）：发生特异分裂的细胞进入不定芽再生的发育路径。,经历第一、第二个阶段后，一些细胞己经获得了某种“决定”(determination)，沿着这一决定了的特定路线进入确定发育路径。现有的研究主要集中在两个方面:一是从解剖学角度说明其形态发生过程；另一个是寻找参与调控器官原基发生和表达的基因与蛋白。,二.离体培养中芽的起源及参与其发生的基因,（一）关于芽的起源：源于茎尖分生组织（shoot apical meristem,SAM）的一部分细胞并始终保持其自主性的“detached meristem”

26、理论（马铃薯）。源于茎尖分生组织中的某些新细胞，即“de novol cells”理论（拟南芥）。,（二）调控腋芽和茎尖分生组织发育的基因,1.通过调节植物体内激素的分布和时间来影响腋芽和茎尖分生组织发育的时间和腋芽形成数目的基因:AXR（AUXIN-INSENSITIVE）,TB1(TEOSINTE BRANCHED 1),SPS(SUPERSHOOT)。,2.直接影响（促进或抑制）腋芽分生组织及其后的发生发育过程的基因与生长素、细胞分裂素或独角金内酯信号传导有关的因子:PIN、CRE1、AHKS、MAX1等；与细胞分裂相关的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶CDKS（cyclin dep

27、endentkinase）；与茎尖分生组织发育相关基因：KNOX、WUS、MOC1、LS、CLV1、CLV3等；,三.KNOX基因与茎尖组织发育,KNOX（KNOTTED-like homeobox genes）家族是植物中的4个同源异型盒基因家族（KNOX、WOX、BELL、HD-ZIP）之一，几乎存在于所有的单子叶和双子叶植物中。（一）KNOX基因家族：1.KNOX亚家族：主要在植物分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必须的关键基因，调控与器官发生相关的细胞分化，最终影响侧生器官的形态建成。,2.KNOX亚家族：在所有植物组织中均表达，由于表达广泛且缺乏响应的突变体，目前对其研究较少。,

28、茎尖形态结构（Morphology of shoot apex）,（二）KNOX基因在茎尖中的时空表达,1.茎尖分生组织的结构,周围区的细胞通常较小,细胞分裂速度较快,位于SAM的侧翼边缘,发育过程中分化为叶、侧芽和茎外层组织。肋区促成茎的伸长。,以拟南芥为例,拟南芥中有4个KNOX基因:STM,BP,KNAT2和KNAT6。这些基因共同参与维持茎尖分生组织活力与结构，确定侧生器官边界等功能。,拟南芥根离体培养过程中和茎（芽）形成相关基因的表达顺序,自体调节/反馈调节,出生侧枝,拟南芥胚胎发育过程中典型基因的表达模式,GA,STM(KNOX),CK,ARR,WUS,胚胎发育过程中典型基因的表达

29、模式,3-6 体细胞胚发生中基因表达与调控,调控,1、顺式作用元件及其鉴出:启动子、增强子2、反式作用因子,3.体细胞胚发生中基因表达的激素调节；IAA、CTK、ABA、2，4-D4.蛋白质磷酸化与基因表达5.DNA的甲基化对基因表达的调控作用,一.体细胞胚发生中特定遗传信息的表达,1.mRNA的合成：mRNA在细胞中的含量很低(占总RNA的1%5%),每种特异 mRNA的含量则更少。植物细胞中mRNA合成的知识主要来自于对几种能产生高丰 度mRNA的基因的研究。mRNA分子的合成过程大致分为三步：,m7G5ppp5NPNP,2.胚性蛋白质的形成,在有胚胎发生的体细胞培养中均有特异性蛋白表达苜

30、蓿体细胞胚发生中,在诱导培养第5天的胚性细胞中有50kD的特异性蛋白表达；在胡萝卜、水稻、玉米、豌豆等的胚性愈伤组织中存在45 55kD的相关性蛋白；在小麦和枸杞体细胞胚发生早期分别检测到49kD和35 kD相关性蛋白。,二.体细胞胚发生中基因表达常用鉴定方法,1.转录水平上的鉴定(1)Northern杂交：通过细胞总RNA或Ploy(A)mRNA与探针的杂交来分析基因转录水平的方法，称Northern 杂交。程序：植物总RNA的提取；探针的制备；印迹及杂交。,斑点杂交与印迹杂交的区别：,斑点杂交只需要将RNA样品点在固相膜上直接与探针杂交。此法只能鉴定基因是否转录；印迹杂交则需要先将提取的总

31、RNA或mRNA样品进行电泳分离，然后转移到固相膜上，再与探针杂交。此法可对基因的转录情况进行较详细的分析，如RNA转录的大小及丰度等。,（2）mRNA差别显示技术,在生物体发育的不同阶段，或是在不同组织或细胞中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达方式，叫基因的差异表达（differential expression）。DDRT-PCR技术的基本原理:合成两组引物,通过随机组合,使1500种自由mRNA均有扩增机会,并显示出清晰的电泳条带：,DDRT-PCR反应的基本程序,A 从一对不同组织或器官中分离总RNA，分别为A、B两组：B 5-NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3n N

32、MTTTTTTTTT TT 3 5 反转录酶 3端锚定引物(5-T11MN-3)5-NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3n NMTTTTTTTTT TT 3 5 a b 5端随机引物C NMTTTTTTTTT TT 3端锚定引物(5-T11MN-3)PCR 5随机引物 放射性标记dNTPs NMTTTTTTTTT TTD,cDNA,优点：,可以同时比较多个样品间基因表达的差异；可以同时检测到“上游”及“下游”基因；检测灵敏度高,所需样品少,经过PCR扩增一些低丰度的mRNA也可以被检测出来；结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术,使本法具有高效性。,(3)mRNA的体外翻译,RNA的

33、体外翻译技术：从细胞中提取的自由mRNA或总RNA，在无细胞提取液的环境中被翻译合成蛋白质的技术。优点：可以探讨体内翻译后产生蛋白质的修饰、加工过程,以及蛋白质活性问题。体外翻译所产生的蛋白质无进一步的修饰加工过程,它所具有的一切特性都是编码它的基因经转录和转录后的修饰、加工所提供的。,从细胞中提取RNA体外翻译系统+除Met外的19种氨基酸+MgAc2+KAc+35S-Met 30温浴 蛋白质 免疫沉淀或SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳进行分析,2.翻译水平上的鉴定,(1)蛋白质的双向电泳 双向电泳是将等电聚焦IEF 和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合起来,依据蛋白质的等电点和分子量来分辨蛋白质有

34、关信息的技术。特点:IEF/SDS-PAGE双向电泳技术既能提高多肽的分辨率,又能提供有关多肽的分子量、氨基酸组成及在某些场合下翻译后修饰作用的信息。,利用该技术研究发现，苜蓿体细胞胚发生中的特异蛋白质50kD蛋白质，是等电点不同而分子量相同的三种蛋白质,在非胚性愈伤组织中缺乏这种蛋白质；在胡萝卜的体细胞胚发生研究中得到了伴随2,4-D的加入而产生的蛋白质。发现枸杞胚性愈伤组织中有70kD,56kD，32kD和一系列较小分子量(2026kD)的特异蛋白质表达。,(2)Western杂交,Westem杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体，用来检测表达的产物不具酶活性的特异蛋白质表达的技术。

35、可以从植物细胞总蛋白中检出50 ng的特异性蛋白质，若是提纯的蛋白质,可检至15ng，具有很高的灵敏度。根据检出结果,可得知被检植物细胞内目的蛋白表达与否,浓度高低及大致的分子量。,从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白溶解于含去污剂和还原剂的溶液中经SDS聚丙烯酸胶凝胶电泳，使蛋白质 按分子量大小分离将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上,膜在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭非特异性位点然后加入特异抗体(一抗),印迹上的目的 蛋白(抗原)与-l抗结合加入能与一抗专一结合的标记的二抗通过二抗上标记化合物的性质进行检出,(3)ELLSA检测技术(酶联免疫吸附法),ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原

36、、抗体的技术。其测定的灵敏度极高和具有较强特异性，是研究基因表达十分有效的方法。ELISA检测程序分三个阶段:抗体的制备;抗体或抗原的包被；免疫反应及检出。其中酶-抗体偶联物的制备是该技术的基础。ELISA使用的酶应具有特异性强、纯度及比活高、室温下稳定、来源方便、价格便宜等优点。目前主要使用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AKP)。,三.体细胞胚发生中基因表达的调控,1.顺式作用元件及其鉴出 顺式作用元件(cis-acting element)：是指基因5端上游区中那些与基因表达调控有关的DNA序列，包括一般基因都有的TATA box与CAATbox和一些重要的调控元件。由于这些序列均

37、与基因处于顺式位置，即在同一条DNA链上,故冠以顺式之名。,启动子(Promotor)是指RNA聚合酶识别并与之结合,从而起始转录的一段特异性DNA序列,包括TATA盒（控制转录启动的准确性）与CAT盒（调控转录的起始频率）两部分序列。增强子(enhancer)是能够增强与之相连锁的基因转录活性的调控序列。增强子的结构与启动子非常相似,其功能是结合特定的转录因子或影响DNA构象。,顺式作用元件(cis-acting element)的鉴出,构建融合基因(从转录起始点开始的5上游区一定长度的DNA片段与报告基因 编码区及3末端区相连接)用Exo外切核酸酶处理得到5端各有不同缺失长度的融合基因 转

38、化植物获得含有上述不同缺失长度融合基因突变体的植株 用组织化学方法或其他方法,分析基因的5上游区缺失到什么部位就不能使 报告基因表达,或失去正确时空表达专一性,或失去对胁迫因素的应答能力。找到调控元件存在的区域 从该区域的5端作小范围的缺失突变,或从该区域中间的不同部位造成缺 失突变找出调控元件存在的准确位点 人工合成此位点内的核苷酸序列,或将此序列中的个别核苷酸调换,或将这段 序列与突变后的序列分别连接在基础启动子上游检测它们是否能调节报告基因的表达,2.反式作用因子(trans-acting factor)反式作用因子是指那些结合到顺式作用元件上特异DNA序列，并相互作用而实现其调节效应的

39、蛋白质因子，它们可以增强或阻遏基因的表达,或者决定着基因表达的组织与发育阶段专一性。,主要的反式作用因子有：,基础转录因子，是与TATA盒/启动子结合的蛋白质因子；转录调控因子，是一些与启动子上游序列结合的蛋白质因子；诱导基因表达的转录因子，它是与基因的启动子或增强子区内一小段短的DNA序列结合从而完成该基因的诱导表达过程蛋白质因子；细胞专一基因表达的转录因子，这些因子通常都在某一特定组织中合成或激活并诱发细胞专一基因的转录。,转录因子的作用方式,研究发现，转录因子通常由DNA结合区和转录激活区两个功能区组成。,(1)DNA结合区的类型,螺旋-转角-螺旋结构由两个的-螺旋通过-折叠相互垂直连接

40、构成：两个的-螺旋中的一个通过与磷酸作用，与DNA形成非特异的结合；另一个叫识别螺旋，与DNA上的碱基序列特异的接触结合。,左图,右图,锌指(Zinc finger)结构,由多个重复的结构组成，每个分子中结合有7-11个锌原子，每2个半胱氨酸（Cys）和2个组氨酸（His）与一个Zn原子结合形成锌指，一个完整的分子可形成多个“指头”，这有利于DNA结合。,由亮氨酸丰富区组成两个-螺旋：每7个氨基酸就有1个亮氨酸，螺旋中每两圈出现一个亮氨酸；二个蛋白质因子的-螺旋通过亮氨酸的疏水作用形成一个拉链（二聚体）,其作用只是使两个蛋质分子能形成双体，从而有助于碱性功能区与DNA结合。,亮氨酸拉链(leu

41、cine zipper)结构,(2)激活功能区,转录因子的转录激活功能区一般由30个到150个氨基酸组成，其结构主要有三种类型：酸性功能区、谷氨酰胺丰富功能区和脯氨酸丰富功能区。其作用机制可能有两种模式：一是激活功能区直接与RNA聚合酶相互作用，从而提高其活性。二是激活功能区与其他转录因子（TFD）作用，然后再作用于RNA聚合酶。,3.体细胞胚发生中基因表达的激素调节,(1)细胞分裂素对基因表达的调控 细胞分裂素能够直接调控细胞核基因的活性：例如，从豌豆染色质中分离到一种细胞分裂素受体蛋白,在RNA合成实验体系中加入这种蛋白质及细胞分裂素时可以使RNA合成速度增加20%到50%（细胞分裂素受体

42、蛋白能作为一种反式作用因子识别DNA中某些基因的顺式作用元件）。,细胞分裂素可调控蛋白质的磷酸化；细胞分裂素还可调控蛋白质的翻译：例如，一种称为异戊间二烯腺嘌呤(ipA)细胞分裂素存在于tRNA分子的反密码子邻近处。实验证实，ipA具有是维持密码和反密码子之间的相互协调的作用。,(2)生长素对基因表达的调控,植物生长素能诱导mRNA的合成，而且能调控细胞内mRNA的含量水平：已克隆出几个受植物生长素诱导的mRNA的cDNA 2,4-D可以诱导苜蓿体细胞胚胎发生中编码富含脯氨酸的小分子蛋白质基因(MsPRP5)的表达；用100 mol/L的2,4-D处理愈伤组织20min，其MsPRPS 的mR

43、NA量开始增加,处理24-48h，mRNA的量达到峰值。,生长素受体在基因表达调控中的作用方式：激素受体是一类特殊的识别蛋白,生长素先与靶细胞膜或细胞质中的激素受体结合,形成“生长素-受体”复合物，进而转移到细胞核内，复合物特异性、高亲和地与DNA上特定序列相互作用（激活反式作用因子），形成新的RNA，在转录水平上调控基因表达：,(3)ABA对基因表达的调控,ABA对植物的生理及发育过程都有调控作用，包括胚胎形态发生,气孔开闭及植物对渗透压逆境的反应。在体细胞胚胎发生过程中：ABA能诱导一些特异性蛋白质的合成：如种子贮藏蛋白等；调节某些科植物胚胎发生特异性基因的表达：在转化的水稻原生质体中，用

44、ABA诱导了转入水稻的小麦胚胎发生相关基因启动子(Em)的转录。,4.蛋白质磷酸化与基因表达,(1)蛋白质的磷酸化影响蛋白质因子的运转：转录因子调节基因转录需要通过核膜进入核内，如果阻遏蛋白的磷酸化，则使其产生变构作用而失去运转、结合与调节基因转录表达的能力。,(2)调节转录因子结合DNA的能力：C-Myc是一种核磷酸化蛋白,它被磷酸化后就失去结合DNA的能力,不能激活基因的转录。推测磷酸化可导致构象变化,促进N端的折叠,使DNA的结合被遮盖。,(3)调节转录因子的转录激活功能：,激活功能区,5.DNA的甲基化对基因表达的调控作用,(1)DNA甲基化(methylation)的基本特点：DNA

45、甲基化是基因组的特征，细胞内甲基化过程发生在DNA合成以后，通常以半保留方式进行DNA 修饰，即双链DNA中仅对新合成链的对应位点胞嘧啶残基进行甲基化修饰:特别是在鸟嘌呤(G)旁边的C上：5-GCm-3（CPG）。,(2)特异DNA序列的甲基化降低基因表达活性：,不活动或持续失活的基因甲基化程度较高,活跃的或持续表达的基因常是低甲基化的；而具有组织特异性表达的基因5端上游常呈低甲基化状态。在植物体细胞胚发生早期，细胞中的甲基化程度很低，随着胚的发育成熟，甲基化程度升高。,培养细胞的分化率一般需要诱导，就是因为其甲基化程度较高，抑制了培养细胞中胚性相关基因的表达；而通过激素、光温条件等条件的诱导

46、，降低DNA甲基化程度，胚性相关基因才能表达，胚性细胞才能形成并进一步发育。到一定发育阶段时，DNA甲基化水平又逐渐升高，胚性相关基因的表达由处于不活跃状态，使植株发育成熟。原因:甲基化影响DNA与蛋白质的相互识别与作用；甲基化影响DNA的构象。,(3)2,4-D具有促进DNA甲基化的作用,Loschiava等观察到当胡萝卜悬浮培养物在含高浓度的2,4-D的培养条件下,其核DNA的甲基化从16%增加到45%；当除去2,4-D并降低细胞密度时,核DNA便去甲基化。因此,激活了相应基因的表达。这可以解释，为什么在植物体细胞胚发生中，许多材料的愈伤组织诱导需要高浓度的2,4-D，而体细胞胚的发生则必

47、需降低或去除2,4-D。,思考题：,1花粉小孢子离体发育的基本途径及其主要特点？2.体细胞离体再生的基本类型及特点？3胚性细胞分裂不同步性的可能原因是什么?有什么克服的方法?4体细胞胚胎发生的基本过程及其特点？5.花粉小孢子离体发育的A、B、C途径及其特点？6.胚性细胞形成过程中细胞的超微结构变化?7胚性细胞形成过程中主要的生化变化?8体细胞胚起源的普遍观点是什么?有何特点?9体细胞转化为胚性细胞的渐变理论的基本观点是什么?10为什么体细胞胚胎发生过程中易发生遗传变异,而且具有普遍性?11影响体细胞胚胎发生变异性的主要因素是什么?12参与腋芽和分生组织发育的基因的类型与种类？13.KNOX基因的生物学与茎尖组织发育的关系？12.何谓顺式作用元件和反式作用因子?13.何谓螺旋-转角-螺旋、锌指和亮氨酸拉链？14.蛋白质的磷酸化和去磷酸化对基因转录有和调节作用?15.体细胞胚发生中DNA的甲基化对基因表达有何调控作用?,被子植物生活史,