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1、,新药临床前毒理学评价Preclinical Toxicological Evaluation of New Drug,Contents,目的意义急性毒性试验(acute)长期毒性试验(chronic)特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌)其它毒性试验(过敏、刺激 etc.)药物非临床研究质量管理规范（GLP）SFDA新药审评会案例学习,Acute Toxicity Test,概念、目的意义传统方法基本内容和要求有关问题其它实验方法,Concept,动物单次或24h内多次给予受试物后，一定时间内(14天)所产生的毒性反应毒理研究早期阶段进行,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dos

2、e安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction:性质、程度、量毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility解毒或解救措施 Antidote确保临床用药安全(重点监测指标),目的意义,阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数了解毒性靶器官为长毒、特殊毒性试验剂量设计为期临床试验起始剂量选择为临床毒副反应监护提供参考其它(DO STAR),OECD口服急性毒性分级,相对毒性参数,治疗指数TI=LD50/ED50安全系数SF=LD5/ED

3、95可靠或确实安全系数CSF=LD1/ED99安全范围SM=(LD1/ED99-1)X 100%SED50/ED50,越大越安全LD5基本无害量 ED95基本有效量LD1肯定无害量 ED99肯定有效量,为临床毒副反应监护提供参考,中毒症状,起始、持续、恢复时间中毒靶器官对抗试验为临床急救提供依据,为长毒等试验选择剂量提供依据,长期毒性剂量设计LD50法(1/10,1/50,1/100)MTD法(1,1/3,1/10)生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50,为特殊毒性试验选择剂量提供依据,致突变试验啮齿类动物微核试验高剂量为1/2

4、LD50果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD50和1/4 LD50精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2 LD50 短期致癌试验高剂量=MTD,I 期临床选择起始剂量提供参考,细胞毒类抗癌药，I期临床起始剂量=1/10 LD50,其它,系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50复方药物的相互作用,也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质比较不同途径的LD50，获得一些生物利用度信息，为剂型开发提供参考,基本原则,执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认,动物,获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物啮齿类-小鼠或大鼠非啮齿类-犬或猴二

5、种动物(啮齿类及非啮齿类)小鼠18-22g;大鼠120-150g;犬用成年犬初始体重不应超过或低于平均体重的20%各半(勤俭办事，服从命令),受试物,工艺稳定、符合临床用质量标准标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求,受试物,原料药临床拟用剂型复方制剂：复方+拆方(增毒？新毒？)易降解：含降解产物量最高的受试物进行急毒试验，并与临床样品的急毒试验结果比较,给药途径,临床拟用途径+原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射）啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水,剂量和分组,给药剂量：未见毒性量严重毒

6、性量设空白和/或溶媒（辅料）对照小动物4-6个剂量组,组距0.65-0.85,求LD50大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法),求出ALD和MTD，不必达到致死量,给药容积,不等浓度等容量给药常规及最大给药容量为:,观察指标及时间,药后4h内详观,后每天上下午各一,观察14d记录毒性反应、死亡情况,中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间其它指标：一般指标、体重变化等,急性毒性研究的一般观察和指征,病理学检查,大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物)组织病理学检查:体积、颜色、质地等改变时,结果处理,实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD5

7、0 表.XXX急性毒性结果及LD50计算剂量对数剂量动物数死亡动物数死亡率机率单位 LD50及可信限(mg/kg)(X)(只)(只)%(Y)(mg/kg),结果处理,剂量反应、时间反应关系反应可能涉及组织、器官或系统肉眼病变和组织病检，初步判断毒性靶器官病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片,确定NOAEL、MTD、ALD etc，初步判断受试物的安全范围,综合评价,判断反应与药物作用相关性：时间、发生率、剂量-反应关系动物种属及背景数据病理学检查结果同类药物特点安全范围、毒性严重程度及可恢复性毒性作用靶器官毒性可能涉及部位大体解剖和组织病理学检查结果,注意问题,光化学治疗药

8、和辐射增敏剂急毒试验照光+不照光分别测定LD50复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价,注意问题,充分重视预试毒理学界对LD50看法试验结果（信息）的一部分LD50测定不足：动物消耗量大获得信息有限测得数值不准,EPA Policies,Discourages the use of the Classical LD50 test Uses Structurally Related Activities(SRA)to obviate the need for testing on animals Recommends the Limit test,EPA Policies,Beyond the

9、 Limit,recommends approximate lethal dose the up-and-down methods,近似致死剂量法(非啮齿类动物),6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出剂量序列表,First,最低致死剂量,最高非致死剂量,最低致死剂量,最高非致死剂量,OR,近似致死剂量范围,近似致死剂量范围,Second,MTD法,最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50,可只求MTD值一次或24h多次(总量5g/kg)给20只动物观察14d,未见死亡,则MTD XX g/kg;个别死亡,则写成LD

10、50 XX g/kgiv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20sig时空腹,即禁食12-16h左右,常用容量和最大容量(ml),最大无毒性反应剂量（no observed adverse effect level,NOAEL)：指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量最小致死剂量（minimal lethal dose，MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量半数致死量（median

11、 lethal dose,LD50）：在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。,长期毒性试验 Long-term Toxicity Study,目的意义基本内容和要求有关问题Mechanic?Innovative?,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dose安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction:性质、程度、量毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility解毒或解救措施 Antidote确保临床用药

12、安全(重点监测指标),基本原则,执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认,Procedure,Animals Housing DrugRoute Dosage GroupDuration Index RecoveryTime Report（动饲药径剂组周指恢时报告）,Animal,in vitro体系筛选实验动物种属或品系理想动物对受试物生物转化与人体相近对受试物敏感已有大量历史对照数据,Animals,rodent non-rodent rat beagle dog mouse monkey,Animal,二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬,必要时用

13、猴、猪等符合等级要求来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证大鼠6-9 w，Beagle犬6-12 m,体重CV20各半必要时，可用疾病模型动物进行试验 Duration 6m,natural death(rat:1y-15%,1.5y-50%,2y-70-80%)(勤俭办事，服从命令）,XXX 体外代谢种属比较研究,结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评,动物选择,XXXX西地那非,已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4）PDE5抑制剂，治疗男性ED选用雄性动物进行下列试验急性毒性（大鼠、小鼠）安全药理学（小鼠、犬）须与已上市药物进行对比（已上市药需国外进口或买不到时？）,动物选择,治

14、疗HER2阳性乳腺癌药物,治疗妇女HER2阳性乳腺癌用雌性动物进行一般毒理学研究厂家要求选用雌雄各半动物，何故？,动物选择,Housing,T,humidity,light,ventilation,animal feeds Rat:5/cage or separated，acclimation 1wDog:TB test,anthelmintic acclimation:1-2w/1m,饲养管理,Drug,test article/solvent/excipient name,batch No.,source,specification,purity,preserve condition,et

15、c same quality criterion,Route,与临床用药途径一致临床iv,大鼠给药1月，ip代替im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径但应说明原因,模拟临床给药途径,纤维蛋白胶：犬腹腔给药小儿止泻贴剂：相当于脐部给药,途径方式,Dose and Group,三个给药组,单位：mg(IU)/kg 或 mg(IU)/m2不等浓度等容量给药低剂量组高于有效剂量，不出现毒性中剂量组轻微或中等度毒性高剂量组明显/严重毒性，或个别动物死亡空白对照溶媒或赋形剂溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组阳性对照,Dose and Group,大鼠各15只/组大动物各5只/组,特例：等浓度不等容量

16、给药,白蛋白：疗效与蛋白浓度有关紫杉醇脂肪乳：乳剂的比例影响紫杉醇安全性,途径方式,Correspond duration of clinical ad.with animal ad.,注：表中给药期限均为最短给药期限，不包括恢复期，均为完整试验,Index-Clinical Examinations,rodent non-rodent signs of ill health+pupil,T behavioral changes breath,sialosis reaction to treatment vomitingDead or moribund animal:necropsy with

17、in 1h,Index-Hematology,受试物对造血系统有影响，应重视骨髓检查,Index-Clinical Chemistry,Index-Urinalysis,Index-Pathology称重并计算系数,calculate organ weights relative to body weight,paired organs weigh together,Index-Pathology病检脏器组织,Index-Pathology病检脏器组织,Index-Pathology,heart liver spleen lung kidney brain adrenals pancreas

18、stomach duodenum jejunum ileum colon cecum（盲）pituitary thymus spinal cord prostate testes epididymides uterus ovaries optic nerve injection site bone and marrow urinary bladder lymph nodes(mesenteric,local)thyroid¶thyroid lobes,脏器取材样式（SOP),肺脏,脑,01,肝脏,02,03,04,05,肾脏,膀胱,心脏,肺,06,脾脏胸腺,07,甲状腺,08,气管,

19、09,脑垂体,10,胃,切片中组织排列和方向,IndexECG,Eye,大动物长期毒性必须做 ECG观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期,Recovery,Observation:1/31/2 animal,26w Late toxic reaction and reversibility Items:same as treatment period,测试次数,能反映动态变化一般行为、食量每天观察记录大鼠体重每周一次大动物生理指标每半月一次大动物ECG 导联，给药前、给药期间、停药及恢复期均要检测发现有阳性指标应加大观察密度,Observa

20、tions,Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6m(rat)9m(dog)Toxic reaction:properties,degree,dose-toxicity relationship,initiating time，peak time,lasted time,late reaction toxicity,accumulating toxi-city,tolerance,Frequency of lab.investigations,rat=3m rat 6m Non-rodentlast ad.interim

21、twice pretreatmentrecovery end last ad.once every 1-3 m recovery end last ad.recovery end,资料整理,首页试验指导者、课题负责人、病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察者SD申明QA申明摘要正文合理的统计图、表有差异的指标应进行统计标示,Problems,Pretest Animal&Housing Route Dose Duration Observation Index Toxicokinetcs Data handling Archives,Pretest,What depend on

22、?Overseas pre-clinical/clinical dataAcute toxicity,pharmacodynamics and pharmacokinetics or intended clinical doseHow long?2w-1mBiological product:antibody?,Dose,LD50 MTD MBS ACD 3m 6m 1/10 1 10Cmax 50100 30 50 1/50 1/3 5Cmax 3050 1525 1/100 1/10 Cmax 1020 510 half for dog and monkey,常用动物等效剂量折算表,Dos

23、e,高剂量原则上应使动物产生明显毒性低毒性药物高剂量的选择：问题:临床拟用剂量可靠吗？高剂量与临床剂量的比值？与动物有效剂量的比值?办法:是否线性动力学？药物完全吸收了吗？-毒代动力学证据是否达最大给药浓度和体积(限制性因素)?,剂量设计,依据充分指导原则文献资料官方资料设计合理药效剂量药代数据种属差异作用机制预试结果,特例：犬的剂量高于大鼠,大鼠：10、30、60 mg/kg(iv 60天)30、60 mg/kg给药后尖叫，体重下降胆红素，血糖，局部刺激犬：25、50、100 mg/kg(静滴60天)50、100 mg/kg给药后动物流涎、皮肤潮红胆红素，血糖，局部刺激,剂量设计,大鼠雌雄剂

24、量不同,雄大鼠：20、60、120 mg/kg(ig 30天)雌大鼠：10、30、60 mg/kg(ig 30天),雄大鼠对该药的生物利用度为雌大鼠的一半，故给药剂量加倍,剂量设计,分组,分别随机分组开始实验时体重CV20大动物：给药前生理生化指标过高或过低的去掉,Index,Possible Toxic Reactionspharmaco-chemical pretesting publishedlogical effcts structure results data,Index-hematology&chemistry,Reticulocyte countAST ALP BUN Alb

25、,Index-pathology,Tissue:free of fathalf rationed：no changes(-)0,suspected()0.5，mild(+)1，median(+)2，severe(+)3Local inflammation,WBC infiltration,local bleeding,haemostasis,suspected cell degeneration self-infected,sacrifice induced,指标增加,PEG化EPO（化学1.1）+免疫源性（抗体及其性质）+免疫毒性细胞及体液免疫：IgG、IgM、C3、C4、CIC、T淋巴细胞

26、分型（CD4+、CD8+)，IL-6,INF-等）,指标检测,测试方法,简便快速灵敏准确公认,Toxicokinetics,毒性剂量系统暴露的代谢动力学可以描述系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间关系目的在于解释长期毒性试验结果,Toxicokinetics,合适采样点，获得AUC、Cmax、Tmax等参数结合药物血浆蛋白结合率评价系统暴露量长毒试验各剂量全部或部分动物，以估算高剂量药物的动力学过程是否属非线性鼓励创新药物进行毒代动力学研究,Data Handling,Ration data:xs,international unitvs control and dosage grou

27、p,vs d0Statistics:t test or F test，Ridit analysis,资料整理,raw data,documentation,records,protocol(and amendments thereto)specimens,reserve samples control article final report(signed)原始资料应保存完好，我国规定原始资料至少保存至生产后5年,均值和单个数据,Rodent：组均值单个动物，背景数据和文献数据可参考Non-rodent：数量少、个体差异大，单个动物的试验数据具有重要毒理学意义。须与给药前、对照组和背景数据进行

28、多重比较，文献数据参考价值有限,统计学意义和生物学意义,有统计学意义并不一定有生物学意义判断因素数据变化剂量反应关系其他相关参数改变与历史背景数据比较异常数据合理解释,正确判断毒性反应,给药组和对照组之间差异来源与受试物有关的毒性反应动物对药物适应性改变正常生理波动判断关注剂量反应关系参数变化幅度和性别差异分析毒理学变化参数关联和机制单个参数变化判断应慎重结合TK,毒性反应对于临床试验意义,种属差异无关毒性：高剂量，非线性动力学代谢特异反应难以检测：头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊疑毒从有,机制研究（探索药理/毒理信号通路）,鉴别新分子实体是否有新的药理/毒理作用机制，加深对药物的

29、认识与已有类似药物作用比较，判断是否属于新作用机制采用多种先进的生理、生化和分子生物学方法和技术对机制进行多层次研究,例：1971年美国颁布国家癌症法以来，前列腺癌、肝癌、胰腺癌等发病率和/或死亡率没有明显改变,Pfizer研发CETP抑制剂损失8亿$,Torcetrapib的副作用源自脱靶效应,辉瑞公司ILLUMINATE试验详细数据表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脱靶效应动物研究发现切除肾上腺，可以阻断torcetrapib的升压效应，验证了醛固酮所起的作用美国转化医学协会的主席Bruce Littman指出，torcetrapib事件另一个教训是，当涉及到黑箱机制时，尤其是

30、与安全性有关的问题时，一定不要把所观察到的问题仅仅作为风险那么简单,Nat Rev Drug DiscovVOL 10|MAR 2011|163,2011年立普妥专利到期,辉瑞急切希望torcetrapib弥补2011年立普妥专利到期带来的巨额损失，过度扩大了torcetrapib可能带来的经济效益，偏离了研发的科学性20102015，辉瑞至少失去18个药物的独家专利权。这些药物2009年销售收入达256亿美元，占总收入60%,2012年全球处方药市场销售20强,单位：亿美元,单位：亿美元,2012年全球处方药市场销售20强,整体性综合评价,结合药学、药理学、PK、TK和其它毒理学研究(+临床

31、研究)，利弊权衡，综合评价找到：不良反应、毒性靶器官、安全范围、临床需重点检测指标及临床监护或解救措施,26 SCIENCE VOL 334 7 OCT 2011,人卵细胞培养出胚胎干细胞,Cell 153,111,June 6,2013,人卵细胞停滞于减数分裂中期,目前还无法进行人类克隆,精子指导胚胎早期发育子代继承父源的DNA甲基化图谱，抛弃了母源的图谱，精子中携带的信息指导胚胎的发育,Cell 153,759772,May 9,2013,The fourth mutation allowed the virus to spread more effectively,infecting

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