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1、药物筛选,2023/12/13,2,药物筛选,对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和实验，以求发现其药用价值和临床用途，为新药研究和开发提供最初始的依据和资料是实现药物发现的重要手段,2023/12/13,3,药物筛选的历史,2023/12/13,4,药物筛选的历史,2023/12/13,5,药物筛选的理论基础,古代药学理论与药物筛选：芳香药物解表（薄荷、防风）；苦寒药物清热解毒（黄莲、大黄、栀子、苦参）现代药学理论与药物筛选：酶学与受体理论基因水平上的药物筛选.,2023/12/13,6,新药的类型和发现的特点,2023/12/13,7,药物筛选的形式（一）,定向筛选：采用特定方法，专
2、门筛选防治某种疾病的药物。长期使用的方法不能全面反映出被筛选物质内在的作用。理想的方法：一药多筛,2023/12/13,8,药物筛选的形式（二）,特定样品筛选：利用已有信息，在特定的样品范围内进行筛选。例：筛选多种细菌产物的抗菌活性，发现新抗生素；中药有效成分的筛选。成功率较高；被筛选范围受限，忽略了广泛的资源；信息资料不可靠时可能产生误导,2023/12/13,9,药物筛选的形式（三）,比较筛选：根据对现有药物的认识，获得结构或性质相似的样品，采用刚确定的模型进行筛选，由此发现同类型而作用更好的新药物。例：me too 药、甾体激素类抗炎药物、阿片类镇痛药成功率较高；难以产生完全创新的药物,
3、2023/12/13,10,药物筛选的形式（四）,随机筛选：采用不同的方法，对可能作为药用物质样品进行药理活性的广泛筛选。新药发现的最基本形式能够发现全新的药物成功率不可预测需要有足够的被筛选样品量和广泛的药物作用筛选方法,2023/12/13,11,药物筛选的形式（五）,计算机筛选：根据药理学、药物化学、计算机科学等多学科的理论知识，应用计算机和相关软件作为工具进行的化合物活性的预测。药物与靶点结合理论基础上，采用计算机模型进行对接（分子对接计算以及分子相似性分析），筛选出可能具有药理活性的化合物结构抗肿瘤药物研究，抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂的发现，钾离子通道阻断剂的发现,2023/12/1
4、3,12,药物筛选的形式（六）,高通量药物筛选（high throughout screening,HTS）：以随机筛选为基础，对大量化合物进行微量样本的实验测定。日筛选能力应在10000次以上主动寻找药物的重要技术手段。减少动物用量和动物标本的制备量需要大量新化合物，传统的化学合成方法已不能满足筛选的需要：需要组合化学和组合化合物库的应用，提供新化合物。,2023/12/13,13,药物筛选的模型（一）,整体动物模型与传统筛选模型可以从整体水平，直观地反映出药物的治疗作用，不良反应及毒性作用。对被筛选样品的临床价值和应用前景具有十分重要的价值。包括正常动物和病理动物模型局限性：药物筛选手工操
5、作，样品有限，病理模型有限,2023/12/13,14,药物筛选的模型（一）,整体动物模型与传统筛选模型研究进展：与人类疾病相关的病理动物模型遗传性动物模型（高血压大鼠、糖尿病大鼠、衰老动物、老年痴呆动物）、基因敲除和转基因动物模型化学、物理或其他方法制备的动物模型,2023/12/13,15,药物筛选的模型（二）,组织器官水平的筛选模型和体外药物筛选方法观察药物对特定组织或器官的作用，分析药物作用原理和可能具有的药物作用一定程度上克服整体动物模型的不足降低筛选样品的用量（整体动物的1/10或更少）降低劳动强度，扩大筛选规模，减少动物用量，同一时间可进行多样品的筛选，提高效率，降低筛选成本：减
6、少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用,2023/12/13,16,药物筛选的模型（二）,组织器官水平的筛选模型和体外药物筛选方法缺点反映药物作用有限对样品的需求量仍然很大人工操作技术要求高进展：测定方法的改进和结果处理的自动化、智能化,2023/12/13,17,药物筛选的模型（三）,细胞、分子水平药物筛选模型和高通量药物筛选微量化；高灵敏度，高特异性，药物作用机制比较明确，可以实现大规模的筛选，可以实现一药多筛。操作简便，可进行自动化操作，进行高通量药物筛选和超高通量筛选,2023/12/13,18,药物筛选的模型（三）,细胞、分子水平药物筛选模型和高通量药物筛选进展新的药物作用靶点的发
7、现更多的细胞可用于筛选：正常细胞、转基因细胞、病理细胞、人源组织的细胞或者是人源转化细胞株通过转基因方法由细胞表达多数生物活性物质生物芯片技术：高通量、微型化、自动化,2023/12/13,19,高通量药物筛选的理论基础,样品与靶点的相互作用：根据分子间相互作用的原理建立筛选模型，筛选与特定靶点具有亲和力的样品。如作用于受体的药物筛选。对酶活性的影响：观察反应底物的减少或产物的增加对细胞的作用。观察被筛选样品对整个细胞的影响（单靶点或多靶点）。,2023/12/13,20,HTS的理论基础-反向药理学,2023/12/13,21,HTS的理论基础-反向药理学,传统药理学效率低、规模小、成本高、
8、难度大，因而不能形成规模，制约新药发展速度机制研究难度大，需要进行大量探索工作反向药理学从药物作用的靶点水平，大规模的筛选药物，高效率发现新药,2023/12/13,22,基于HTS的药物筛选与新药发现过程（一）,初筛和复筛分子或细胞水平筛选样品，证明对靶点的作用选择具有活性的化合物，采取系列浓度，进行同一模型的复筛，阐明其对该靶点的作用特点、强度和量效关系，发现活性化合物。,2023/12/13,23,基于HTS的药物筛选与新药发现过程（二）,深入筛选采取与初筛不同但相关的分子、细胞模型进行进一步筛选（样品的选择性、细胞毒性、其他性质），确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物（先导
9、化合物）结合组织器官或整体动物模型，证明其药理作用根据实际情况进行结构优化（或直接作为药物候选化合物进行开发），进行化合物结构的改造，得到活性更高、不良反应更小的活性物质。,2023/12/13,24,基于HTS的药物筛选与新药发现过程（三）,确证筛选对深入筛选获得先导化合物或优化后被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究：药理作用、药物代谢过程、一般不良反应等多方面的筛选。符合要求的样品确定为药物候选化合物，进入开发临床研究，即临床前研究,2023/12/13,25,高通量药物筛选的基本特点,高容量的化合物库：充分利用药用资源，快速，每天筛选上万药次自动化操作系统：减少操作误差发生，提高
10、筛选效率和结果的准确性，完备的疾病基因/蛋白库高灵敏度检测系统，准确判断筛选样品的活性和选择性微量筛选系统：高特异性细胞、分子水平的药物筛选模型；样品用量微量高效率的计算机数据分析系统经济 筛选费用低,2023/12/13,26,The Evolution of HTS,2023/12/13,27,高通量药物筛选-样品,样品类型：单一化合物（合成化合物，天然化合物）混合物（天然提取物，合成化合物）样品来源：化学合成、组合化学合成天然产物提取物、组合生物合成（基因水平由微生物合成多种化合物）、代谢产物样品管理：化合物数据库,2023/12/13,28,基本原理:采用适当的化学方法，在特定的分子母
11、核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。,组合化学(combinatorial chemistry),2023/12/13,29,组合化学,2023/12/13,30,化合物库 样品自动化储存系统产品,REMP Large-size storeTM(LSS),2023/12/13,31,组合化学,山东齐鲁：针对EGFR,Her-2,VEGFR,RAF,PDGFR等靶点，设计合成化合物约200个，已经对155个化合物进行了活性筛选，其中1个化合物（塞拉替尼，L-2）优于国外上市的拉帕替尼恒瑞医药：发现并合成一系列小分子酪氨酸激酶抑制剂。其中VEGF类的阿帕替尼已在国内II期临床。E
12、GF类的AL6802，在非小细胞肺癌、人表皮鳞癌等移植瘤动物模型体内显示出与厄洛替尼相当的显著抗肿瘤活性。,2023/12/13,32,采用微孔板作为反应容器。通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内。自动操作（加样、稀释、混合、温孵、转移等）自动检测（时间、顺序、条件等）数据获得（原始数据、简单处理数据）结果储存（计算机保存）,高通量药物筛选 自动化操作系统,2023/12/13,33,高通量药物筛选 自动化操作系统,优点快速筛选大量药物减少实验人员结果的重现性好安全微量化,2023/12/13,34,The Genesis Robotic Sa
13、mple Processors(RSP，自动样品处理机),2023/12/13,35,2023/12/13,36,（一）光学检测技术紫外-可见光检测技术：通过酶促反应产物的光吸收强度来测定酶活力化学发光检测技术：灵敏度紫外-可见光检测荧光标记检测技术荧光强度检测荧光猝灭检测(FQ)荧光偏振检测(FP)荧光共振能量转移检测(FRET)均相时间分辨荧光共振能量转移检测(HTRF)邻近闪烁分析(SPA)、Alphascreen 筛选法（光敏感剂取代放射性同位素）光学传感器技术：非标记检测特征,高通量药物筛选 检测技术,2023/12/13,37,可见紫外荧光发光分析仪,FluoStar 比色仪,20
14、23/12/13,38,Fluorometric Imaging Plate Reader（FLIPR）,384 samplesa 5-min turnaround time,40,000 samples/8-h period.,38,2023/12/13,39,邻近闪烁分析法（scintillation proximity assay,SPA）,当同位素标记的配体与受体分子结合时,放射性同位素分子与荧光微球之间的距离足够近,此时放射性同位素发射出的粒子能够激发微球发射荧光,游离的同位素标记配体与荧光微球距离较远,不能激发荧光,2023/12/13,40,邻近闪烁分析法（scintillati
15、on proximity assay,SPA）,2023/12/13,41,液闪发光计数仪,液闪发光计数仪,2023/12/13,42,光学传感器技术,包被在传感器件敏感膜表面(sensor substrate)的生物识别分子，与筛选分子特异性结合时引起传感器件的光电物理特性（如光强,折射率或电阻等）的变化,2023/12/13,43,（二）色谱-光谱联用检测技术：用于药物与血浆蛋白（受体）亲和力的筛选（三）质谱检测技术（四）电化学检测技术：高通量平板膜片钳技术，以离子通道为靶点的HTS,高通量药物筛选 检测技术,2023/12/13,44,（五）热分析检测技术：等温滴定量热法（ITC），药物
16、分子与生物活性分子如蛋白受体、酶之间的相互作用研究，核苷酸、蛋白受体、酶为靶点的药物快速筛选（六）核磁共振检测技术根据不同受体浓度对于小分子化合物1H 谱吸收峰强弱的变化，评价候选药物与靶点亲和力的大小,高通量药物筛选 检测技术,2023/12/13,45,高通量药物筛选 生物材料,cDNA、抗体、酶、蛋白等生物大分子：以高密度微阵列方式排列于玻璃板或膜片上，与生物样本反应，检测观察指标的变化细胞：采用预先制备目的基因或报告基因的转染细胞株，观察目的基因或报告基因的表达变化,2023/12/13,46,常用药物高通量筛选分析技术,以靶点为基础的分析方法以细胞功能为基础的分析方法,2023/12
17、/13,47,以靶点为基础的分析方法,药物靶点的生物学特征：a、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可以单独存在或形成聚合体存在；b、具有可以与其他物质（主要是外源性或内源性小分子物质）相结合的部位或位点；c、该物质的结构可以发生变化，而且是在与小分子结合后发生变化，正常情况下，这种变化通常是可逆的；d、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化；,2023/12/13,48,以靶点为基础的分析方法,药物靶点的生物学特征：e、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或作用通路中具有主导作用；f、病理条件下该物质的表达、活性、结构或特性可以发生变化
18、，这种变化可以是原发性，也可以是继发性的。g、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）或外源性配基，其配基的作用已经被认识。h、靶点的高度选择性,2023/12/13,49,以靶点为基础的分析方法,常用靶点Enzymes28%Membrane Receptors45%Ion Channels5%DNA2%Nuclear Receptors2%Hormones and Factors11%Unknown7%,2023/12/13,50,靶点确证,Expression phenotype?Mutant?Antisense treatment?Antibody treatment?RNAi
19、?Knockout/knockin?Inhibitor treatment?,2023/12/13,51,以靶点为基础的分析方法,（一）以酶为靶的高通量检测观察药物对酶活性的影响放射性方法：将底物标记，测定放射性产物的生成；标记酶，测定被特异结合的酶；SPA（邻近闪烁分析法）比色、荧光的方法,2023/12/13,52,Results from 1 plate in Enzyme Inhibition Screen,2023/12/13,53,以靶点为基础的分析方法,（二）以受体为靶的高通量检测间接检测配体对受体作用的药物筛选模型，观察受体介导的后续生物效应的变化直接检测配体-受体结合的药物筛
20、选模型：在结合部位直接反映药物与受体的相互作用，无法确认药物对受体的激动/拮抗作用，需要进行进一步的功能验证,2023/12/13,54,间接检测配体对受体作用的药物筛选模型,基于受体介导的报告基因表达变化的药物筛选（萤火虫荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、-半乳糖苷酶、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白）例：在细胞水平上构建以雌激素应答序列（ERE）为靶序列，分泌型碱性磷酸酶（SEAP）为报告基因的药物筛选模型，筛选雌激素受体b 亚型激动剂SEAP可催化D-荧光素-O-磷酸盐水解生成D-荧光素，后者可作为荧光素酶的底物 基于受体介导的特异代谢物变化的药物筛选M1 受体稳定转染入3H-AA标记的细胞中，建立用
21、3H-AA 标记的筛选M1受体激动剂的高通量筛选模型,2023/12/13,55,间接检测配体对受体作用的药物筛选模型,基于第二信使水平变化的药物筛选模型基于钙流检测的受体药物筛选：将细胞与Ca2+敏感的荧光探针(Fluo-4)共同孵育，筛选以N受体或组胺受体为靶点的药物基于cAMP水平变化的受体药物筛选：引入报告基因筛选法，将cAMP 响应元件(CRE)与报告基因偶联，通过报告基因的表达量的变化，可反应cAMP 的变化与配体的功能。,2023/12/13,56,直接检测配体-受体结合的药物筛选模型,基于放射性同位素标记结合的受体药物筛选，例：建立稳定表达ETAR 的COS7 细胞系（肾成纤维
22、细胞系），125I 标记的ET-1检测ETAR 拮抗剂基于细胞膜色谱法（CMC）的受体药物筛选，建立白细胞膜色谱模型，筛选白术中与白细胞膜及TLR（Toll 样受体）4 受体作用，并具有抑制炎症反应的活性成分基于酶联免疫法（ELISA）的受体药物筛选：酶标记的单克隆抗体与相应的受检物质反应，形成酶标记的免疫复合物。当酶遇到其相应底物时即反应产生有色或发光物质，且产量与受检物质的量相关,2023/12/13,57,以细胞功能为基础的分析方法,观察被筛样品对细胞的作用。但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。内皮细胞激活细胞凋亡抗肿瘤活性信号转导通路细菌蛋白分泌细
23、菌生长,2023/12/13,58,以细胞功能为基础的分析方法,（一）内皮细胞激活以选择素（E-selectin）蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，选择素在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。,2023/12/13,59,以细胞功能为基础的分析方法,（二）细胞凋亡细胞预先用3 胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，收集DNA碎片。通过对DNA放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。Caspase-3荧光光度法检测 ELISA检测细胞溶解物中的单/低聚核小体,2023/12/13,60,以细胞功能为基础的分析方法,（
24、三）抗肿瘤活性(1)肿瘤细胞生长抑制检测。细胞暴露于受试化合物后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，(3)凋亡检测,2023/12/13,61,以细胞功能为基础的分析方法,（四）G2 检查点G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7 m p53细胞（人乳腺癌细胞）培养，种在96孔板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。细胞周期分为四个阶段：即G1期(DNA合成前期)、s期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)
25、。G0期细胞也称休眠细胞。,2023/12/13,62,以细胞功能为基础的分析方法,（五）信号转导通路TGF3（转化生长因子）通路作用物的高通量筛选方法：构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGF高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。,2023/12/13,63,以细胞功能为基础的分析方法,（六）细菌蛋白分泌以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法：建立SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。,2
26、023/12/13,64,以细胞功能为基础的分析方法,（七）细菌生长抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。腐生性分枝杆菌培养：测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。,2023/12/13,65,斑马鱼（zebrafish）在高通量筛选中的应用,在分子、细胞、和组织水平上，和哺乳动物高度相似脊椎动物，胚胎透明，加药方便，非常适合药物筛选利用96 微孔培养板培养可进行大规模的快速活体小分子筛选同时提供大量互不干扰的形态学信息,例如皮肤(黑色素细胞)、心脏、眼睛、耳朵和脑。使用组织特异性表达报告基因(如GFP)的转基因品系还可以方便的观察内部器官的形态。,2023/1
27、2/13,66,2023/12/13,67,斑马鱼应用举例,UCLA使用特异性标记血管内皮细胞的Tg(kdrl:GRCFP)zn1 转基因斑马鱼筛选了一个含有1120 个分子的化合物库，发现其中化合物MPA 可以有效抑制斑马鱼的血管新生,在MPA 处理的胚胎中,体节间血管的生长被严重抑制。,2023/12/13,68,超高通量筛选（ultra high throughout screening,uHTS）,每个工作日检测次数105、反应体积1536孔）检测板中进行的药物筛选。,2023/12/13,69,高内涵筛选（high content screening,HCS）,在保持细胞结构和功能完
28、整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导多个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。针对个体细胞对细胞表型的多次测量应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，以获得被筛样品对细胞产生的多维个体和实时快速的生物效应信息。,2023/12/13,70,系统生物学,在细胞、组织、器官和生物体整体水平研究结构和功能各异的各种分子及其相互作用。实现从基因到细胞、到组织、到个体的各个层次的整合。在疾病相关基因调控通路和网络水平上研究药物的作用机理、代谢途径和潜在毒性等。药物创新的思路由基于单一靶标的药物发现向基于网络调控的药物发现转变新药筛选从“靶点驱动”向“信号通路驱动”和“网络调控驱动”的转变,
