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1、第五章 疫苗制品,一、疫苗概念(Vaccine),一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸活载体，感染因子等。,第一节 疫 苗 概 述,由特定细菌、病毒、立克次体、衣原体等微生物及寄生虫制成的，接种动物后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗。,二、疫苗的起源与发展疫苗的起源可以追溯到我国古代。早在4世纪初，东晋葛洪所著肘后方中，已有关于防治狂犬病的记载：“杀所咬犬，取脑敷之，后不复发”。在宋真宗时代（公元1000年左右）宰相王达之子患了天花，四处请医无效，最后请来了
2、峨眉山的道人，取其患处的结痂，处理后进行自体接种而治愈，这是最早的自身免疫治疗（self-Vaccine）。,逐渐发展成了预防天花的人痘接种法，即从感染天花后的恢复期病人或症状比较轻的病人身上，挑取水泡、脓疱和痘痂内容物并保存1个月左右待其干燥，然后将其研磨成粉末，给健康人的鼻腔吸入，以预防天花，取得了很好的保护效果。这是人类史上最早使用疫苗来预防疾病的记录，较英国医生琴纳（Jenner）发明牛痘苗早了几百年。,15世纪中期我国的人痘苗接种法传至中东，后经改革进行皮下接种。1721年英驻土耳其的大使夫人，将此法又传至英与欧洲各国。人痘的发明是中国人民对世界医学的一大贡献。2000年，美国疾病控
3、制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）出版了疫苗可预防疾病的流行病学与预防学第6版，在这本被誉为疫苗学权威手册首页的“疫苗接种的里程碑”中，第一项即是“12世纪中国开始用人痘接种预防天花”。这是对中国首先开始使用人痘接种预防天花是最早的免疫接种形式的肯定。,疫苗发展史上的里程碑事件,引自：CDC：Epidemiology and Prevention of Vaccine-preventable Disease.6 Edition，2000,17965.14英国乡村医生爱德华琴纳（Edward Jenner）进行了人类历史上
4、的第一次疫苗接种试验。Jenner从一位感染了牛痘的年轻挤奶农妇的手上挑取了痘苗接种到一名8岁男孩的手臂上。经过几个月的严密观察，发现小男孩获得了免疫保护，一直没有感染天花。1798年9月，Jenner发表了接种“牛痘”预防天花的论文，虽然当时全然不知天花是由天花病毒感染所致，但这一划时代的发明，开创了人工自动免疫的先河。,随后，种痘技术传遍了欧洲，后又传到北美和亚洲。为纪念Jenner的这一伟大贡献，巴斯德（Pasteur）将疫苗称为Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。由于长期和广泛地使用牛痘苗，全世界从1977年以后再也没有发现过天花病人。世界卫生组织（World Health
5、 Organization，WHO）于1979年10月26日庄严宣布，天花已在全球绝迹。这是人类历史上第一个使用疫苗消灭的传染病。,19世纪70年代，法国科学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur）有关减毒鸡霍乱菌的研究，是继琴纳之后的重大进步。他认为使用减毒的病原体来预防其导致的疾病，比使用相关的动物病原体来预防人类疾病理当更加有效。巴斯德建立了现代意义上的预防接种，即通过实验室内研制的疫苗来预防传染病。随后的羊炭疽减毒活疫苗的试验成功，尤其是1885年首次在人体使用减毒狂犬病疫苗的成功，标志人类进入了一个预防接种的科学新纪元。基于安全原因，正式生产的均为狂犬病灭活疫苗，质量上也在不断的
6、改进。Pasteur在疫苗研制领域的先锋作用和卓越贡献引起了第一次疫苗革命。,到19世纪末，人类在疫苗学领域里已经取得了辉煌的成就，包括2个人用病毒减毒活疫苗（琴纳的牛痘，巴斯德的狂犬病），3个人用细菌灭活疫苗（美国Salmon和Smith、法国Chamberlai和Roux的伤寒、霍乱和鼠疫），以及疫苗学的一些基础概念，如Metchnikoff的的细胞免疫（1884年），Ehrlich的受体理论（1897年）及毒素-抗毒素作用。,进入20世纪前30年，疫苗学在三个方面取得了重大进展：首先，法国科学家Calmette和Guerin在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递23
7、0代，获得1株减毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所谓卡介苗（BCG）。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗。第三，Wilson Smith和Thomas Francis分别在禽胚中研制成功2种灭活甲型流行性感冒（流感）疫苗。,二次大战后，疫苗研究进入了突飞猛进的发展阶段。波士顿的Enders及其同事发展了病毒的体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3价灭活脊髓灰质炎（脊灰）疫苗（IPV），后有Sabin的3价减毒脊灰疫苗（OPV），为人类渴望在地球上消灭脊灰提供了有力武器。同一时期还研制了在鸡胚
8、细胞中培养减毒的麻疹疫苗。60年代研制了在鸡胚中减毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在细胞中培养的风疹疫苗。细菌疫苗方面，70年代细菌夹膜多糖的纯化技术促进了多个侵袭性细菌疫苗的研制成功。同一时期的病毒蛋白纯化技术也促进了血源性乙型病毒性肝炎（乙肝）疫苗的研制成功。,20世纪80年代，现代分子技术的应用推动了又一代疫苗的研制，引发了疫苗发展史上的第二次革命，其首要成果是基因重组乙肝疫苗，为人类在地球上消除乙肝提供了希望。与此同时，化学、生物化学、遗传学和免疫学的发展在很大程度上为新疫苗的研制和旧疫苗的改进提供了新技术和新方法.,新技术对疫苗研制和开发的作用及影响,至今已有30余种疫苗成功的用
9、于人类疾病的预防（表5-3）。其中一半以上是病毒疫苗。如天花（poxvirus）、小儿麻痹（poliovirus）、麻疹（Measles）等曾严重危害人类生命与健康的疾病的流行得到了有效的控制。其中天花已被根除，创造了使用疫苗在自然界中彻底消灭一种病原微生物的医学奇迹。人类消灭脊髓灰质炎的目标也即将实现。,人用疫苗发展年表,人用疫苗发展年表,我国自1919年开始建立专门的机构（中央防疫处，北京生物制品研究所前身）从事生物制品的研究、生产，这是我国第一所生物制品研究所。建国后，我国政府重新组建和新建了北京、上海、武汉、长春、兰州、成都等六个生物制品研究所。中国现有疫苗产品生产企业约30家，是世界
10、上疫苗产品生产企业最多的国家（表5-4）。中国的疫苗产品年产量已经超过10亿个剂量单位，疫苗的种类和数量也达到世界之最，其中用于预防乙肝、脊髓灰质炎、麻疹、百日咳、白喉、破伤风的儿科常见病的疫苗生产量达到5亿人份，已经全部实现计划免疫接种。中国生产的疫苗产品已经能够满足防病、灭病的需要。,中国主要疫苗种类和生产厂家,减毒活疫苗 灭活疫苗 牛痘苗 乙型脑膜炎疫苗 流感活疫苗 流感疫苗 麻疹活疫苗 Q热疫苗 腮腺炎活疫苗 脊髓灰质炎疫苗 水痘活疫苗 乙型肝炎疫苗 风疹活疫苗 斑疹伤寒疫苗 脊椎灰质炎疫苗,亚单位疫苗 基因工程疫苗 流感亚单位疫苗 乙肝疫苗 黄热病疫苗 狂犬疫苗,三、疫苗的分类,分类
11、,按微生物分类细菌类疫苗病毒类疫苗寄生虫类疫苗,按疫苗抗原的性质和制备工艺分类活疫苗（live vaccine）弱毒活疫苗基因缺失疫苗基因工程活载体疫苗病毒抗体复合疫苗：特异性高免血清与适当比例的相应病毒组成，其特点是可以延缓病毒释放，提高疫苗的安全性和免疫效果。,活疫苗特点可在体内繁殖系统免疫反应和局部免疫反应免疫力持久，产量高，成本低有毒力增强和反祖危险抗原干扰现象保存条件苛刻,死疫苗（killed vaccine）灭活疫苗：由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性，又要保留其免疫原性。亚单位疫苗：是指将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有
12、效抗原部分制备的一类疫苗，经提取、纯化，通过化学合成，制成不同的亚单位疫苗。,基因工程重组亚单位疫苗：利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性的基因 导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链，提取肽链加入佐剂制成。该类疫苗安全性好，副反应小（有害的反应原少），稳定性好，便于保存和运输，但研发、生产成本高，免疫原性较差，需多次免疫才能得到有效保护。,死疫苗特点不能在体内繁殖有利于制备多价或多联疫苗比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象受外界影响小，有利于保存运输免疫剂量大，需多次免疫，成本高只能诱导机体产生体液免疫通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果,基因疫苗
13、（genetic vaccine）：包括DNA疫苗和RNA疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制下，构成重组表达质粒DNA或RNA，将其直接注入动物体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生抗原蛋白的免疫应答。,单价疫苗（univalent vaccine）：利用同一种微生物（菌）毒株或同一种微生物中的单个血清型（菌）毒株的增殖培养物制备的疫苗。多价疫苗（polyvalent vaccine）：利用同一种微生物（菌）毒株或同一种微生物中的多个血清型（菌）毒株的增殖培养物制备的疫苗多联疫苗（mixed vaccine）：利用不同的微生物增殖培养物，按免疫学原理
14、和方法组合而成的疫苗。接种动物后能获得相应疾病的免疫保护，一针多防，可减少劳动力和动物应激。,按疫苗病原菌（毒）株来源分类同源疫苗：采用同种、同型或同源微生物制备，应用于同类动物免疫接种的疫苗。异源疫苗：采用不同种微生物的（菌）毒株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中未含有的病原体产生抵抗力，如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热的抵抗力。或采用同一种中一种型微生物的（菌）毒株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。,第二节 疫苗的生产,菌（毒）种 培养物（培养基、动 物、禽胚或细胞等）收获抗原（培养液、含毒组织、胚液或细胞液等）配苗 分装 冻干成活疫苗或灭活后制成灭 活疫苗。
15、,一、工艺流程,细菌疫苗的制造流程,蛋白胨、肉浸液等原料,病毒性细胞疫苗的制造工艺流程,健康动物（或胚胎）,病毒性组织疫苗的制造工艺流程,感染动物或胚胎,分装、扎盖、贴签,二、病毒类疫苗的制造方法,1毒种的选择与减毒毒株须具备的条件：（1）持有特定的抗原性；（2）有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；（3）易在特定组织中大量繁殖；（4）不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；,（5）如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；（6）未被其它病毒污染。2病毒的繁殖（1）活体动物培养（2）鸡胚培养（3）组织培养,（4）细胞培养；细胞培养时需要控制：常用的维持液和生长液需要氨基
16、酸、辅酶、维生素、葡萄糖和无机盐等。培养条件控制a pH值：7.00.2；b CO2提供：通过保持环境CO2分压5%，控制pH。,c 氧的提供：通氧；d 容器内壁洁净度控制：用硫酸铬酸混合液洗涤，后用纯水冲洗；e 细菌污染控制：彻底灭菌，加入一定量抗生素；f 培养温度和时间控制：371，时间24天。,3疫苗的灭活用甲醛或酚溶液灭活。动物组织对灭活效果有影响；灭活时间要合适。,5冻干冻干的疫苗充氮或真空密封保存。,4疫苗纯化细胞培养换液即可。,病毒性细胞培养疫苗的制备流程：种毒与毒种 营养液配制与细胞制备 接毒与收获配苗工序1 种毒与毒种种毒由国家指定的菌、毒种保藏部门鉴定分发，多为冻干品。按规
17、定在细胞中继代培养后用作毒种。继代培养控制在一定代数以内。工序2 营养液配制与细胞制备营养液通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的是生长液血清含量为520，维持液血清含量仅有05。不同细胞需要不同的营养成分，根据需要选择合适的营养液。常用的营养液有乳汉液、MEM、DMEM、199、1640等，只需溶解后经除菌过滤即可使用。,工序3 接毒与收获病毒接种可与细胞同步（分装同时或分装不久后接种病毒）或异步（细胞形成单层后接种病毒）。待出现70%80%以上细胞病变时即可收获。收获时可将培养瓶反复冻融后收取；也可加EDTA-胰酶液消化分散收获。收获的细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后
18、，供配苗用。工序4 配苗灭活疫苗和冻干苗的配制方法见禽胚培养疫苗。,三、疫苗质量控制及检定的要求（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求在生产工艺的各个环节和步骤中的产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行,保证产品的质量、工艺的稳定性。,（二）疫苗产品的质量检定与要求 1外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准。2pH值检测：可根据一般生物制品的要求建立标准，一般为7.20.5。3纯度：主要用于评价纯化制品中含有有效成分的量和杂质的最低限量，制定相应标准，通常可测定有效抗原在疫苗中的绝对值或测定主要杂质的量推算有效抗原在疫苗中的相对值。4宿主细胞 DNA和蛋白残留量检测：采用传代细胞
19、生产疫苗，应限制疫苗中的宿主细胞DNA和蛋白残留量，进行方法研究时应建立相应的标准品，并对检测试剂的敏感性和特异性进行验证。疫苗中残余宿主细胞DNA及蛋白残留量可参考现行版中国药典的相关要求。,5.无菌检查：应符合现行版中国药典的相关要求。6热原或细菌内毒素检查：可参照现行版中国药典的相关要求进行；也可以用其它方法检测疫苗中的热原物质。7抗生素检测：预防用疫苗在生产过程中不得添加青霉素或其他内酰氨类抗生素；如在生产过程中添加除上述以外的其他抗生素，应建立相应的检测方法并规定抗生素残留量的要求。8灭活效果的验证：由于制备疫苗的病原体一般均对人类致病，因此应建立有效的灭活方法对该制品中的病原体进行
20、灭活，并应对灭活效果进行验证；在成品检定中应建立灭活剂残留量检测的方法和限度标准。9异常毒性检查：应符合现行版中国药典的相关要求。,10稳定性试验：是指疫苗在常规保存温度下的稳定性试验。由于稳定性试验的结果直接与制品的效期有关，且试验观察时间较长，因此应在生产工艺确定后尽早留样进行，定期取样测定制品效力和其他相关的质量指标；11效力试验（生物效价）：由于用于预防的疫苗是通过机体的免疫应答反应发生作用的，因此应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度12佐剂的质量评
21、价：如最终制品含有佐剂，则应建立佐剂含量以及与之结合率的检测方法，并制定相应质量标准。13疫苗标准品或参考品的研究：对于一种新疫苗而言，建立检测疫苗的效力、免疫原性或毒性用标准品或参考品对判断验室研究阶段与批量投产后的疫苗质量是否一致以及临床试验的评价是非常重要的。,厂房、设施和仪器设备,GMP证书是疫苗生产的准入证，疫苗生产必需拥有与生产工艺相符合的生产线 GMP 生产车间设计要求功能区：抗原制备区、成品生产区、洗涤区、办公区。各区域和功能间以洁净走廊相连，严格按人流物流分开原则进行设计。洁净度：按各功能间洁净度、压力、压差要求设计施工。有10万级区、万级区和局部百级区。六大系统：供电、供水
22、、供汽、污水处理、净化、监控。,厂房、设施和仪器设备,检验设施质检室检验动物舍（应配备有符合各类实验动物级别饲养设施）仓储设施原辅材料库半成品库成品库,厂房、设施和仪器设备,灭菌设备：高压蒸气灭菌柜、干热箱、锅炉等；净化设备：净化机组、无菌室、超净工作台等；微生物培养设施设备：温室、孵化器、细胞培养转瓶机、各种罐体、生化培养箱等；乳化设备：各种罐体、胶体摸、高压匀浆机等；冻干设备：冻干机；灌装设备：洗烘连动线、自动灌装加塞联动机；包装设备：扎盖机、帖标机；冷藏冷冻设施设备：冷库、冷柜、液氮罐等；污水废弃物处理设施设备：灭菌柜、消毒罐、污水处理站；检验仪器设施设备：,第三节 重要病毒性疫苗研究进
23、展,目前，病毒基因工程疫苗主要集中在研制常规技术不能或很难解决的新疫苗和改造免疫保护效果差，负反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗上，有的疫苗兼有预防和治疗两种功能,我国重要病毒病基因工程疫苗研究开发状况,1、艾滋病（AIDS）疫苗（1）研究的三阶段：最早使用其膜抗原gp120（Glucose protein 120）膜抗原加其他能诱发细胞免疫抗原的多抗原疫苗的复杂设计；在泰国使用gp120亚单位疫苗数千人免疫接苗无效后，改为先用重组痘病毒ALVA（疫苗注射后），再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。,（2）HIV感染特点：HIV直接感染破坏免疫
24、细胞；HIV变异极快。,（3）AIDS疫苗研究方向：能诱发有效的中和抗体，阻止或大部阻止HIV感染免疫细胞；能诱发强细胞免疫；中和抗体屏障被部分突破时能有效清除被感染细胞，是研究中应统筹考虑的。,2、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗,（1）目前存在的问题：人群中约10%左右对现有乙肝疫苗（仅含S抗原的疫苗）无反应；（2）研制方向：使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使对现有S乙肝疫苗无反应的人群产生良好的免疫反应。目前，含前S的疫苗，新佐剂乙肝疫苗，乙肝抗原抗体复合物疫苗，治疗性乙肝研究的热点。,（3）丙型肝炎病毒（HCV）疫苗 丙型肝炎感染约占人群2%左右，也就是有2000多万感
25、染者，大部分都会转为慢性，并导致肝硬化和肝癌，危害远大于乙肝。研究方向；多数实验集中于使用病毒外膜蛋白E1+E2研制病毒样颗粒的亚单位疫苗和使用载体进行重组活疫苗研究。由于丙肝病毒变异快，极易冲破已有中和抗体的屏障，选择变异不大且能诱发细胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。,4、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗戊型肝炎病毒属杯状病毒科，单股正链RNA病毒，基因组全长约7.4kb。经消化道传播，暴发流行和散发两种，戊型肝炎的临床表现比甲型肝炎重。选择基因工程的手段研制戊型肝炎疫苗唯一的方法。基因工程疫苗主要采用原核细胞、酵母细胞和昆虫细胞三种表达体系。,我国目前以原核细胞和酵母细胞对戊型肝炎病毒结
26、构蛋白均表达成功（张明程，1999）抗原性在世界范围内稳定，表明戊型肝炎病毒基因工程疫苗将对该病的预防具有良好的效果。,5、呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗 呼吸道合胞病毒属单股副链RNA病毒，是引起婴幼儿肺炎的主要病因。RSV保护性抗原主要是其糖蛋白F和G，高度糖化蛋白，抗原结构复杂，属结构依赖性抗原，产生中和抗体的能力都很差，给研制RSV蛋白亚单位疫苗带来了一定困难。,研制方向：目前研制的高度减毒的非复制型载体是研制该疫苗的重要途径；制备减毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一个重要途径，负链RNA病毒cDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望，也是目前RSV疫
27、苗研制重要途径。,6、人巨细胞病毒（HMV）疫苗（1）危害：HMV 属疱疹病毒科，通常为隐性感染，无明显临床症状。然而 HMV的潜伏感染将对人体健康造成极大威胁。（2）问题：该疫苗株虽能诱发体液和细胞免疫，但保护作用不强，且其潜在的致癌性，以及尚未能最终排除的潜伏感染性，使该类活疫苗尚未能广泛使用。,（3）研制方向：目前使用分子生物学技术，有目的地去除与与毒力、潜伏及肿瘤相关基因的分子减毒疫苗株正在研制中。基因工程技术表达的gB做亚单位疫苗或重组活疫苗的研究已成为目前HMV疫苗研究的一个重要方向。,7、单纯疱疹病毒（HSV）疫苗（1）危害：单纯疱疹病毒有两种类型（HSVI和HSVII），在人群
28、中感染相当广泛。HSV I人群感染率高到50%-90%，多为隐性潜伏性感染。母婴传播中疱疹性角膜炎视力障碍新生儿死亡率高达60%。在病毒性脑炎中，HSV I型感染引起的占10%。HSV II主要经过性传播，病毒检出率可达5%-12%。HSV II感染是宫颈癌的重要诱因之一。,（2）方向：病毒糖蛋白gD和gB是主要的保护性抗原，与gC、gE、gI联合使用可诱生体液和细胞免疫，在动物实验中，HSV II gD 的核酸疫苗可以保护动物免受感染及随后的潜伏感染，这些研究为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供了有力的证据。,8、登革热病毒疫苗（Dengue fever virus vaccine）（1）危害：登革
29、热病毒属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，有4个血清型，蚊子叮咬传播给人，在我国南方热带亚热带地区发生过多次登革热流行。,（2）方向：通过表达prM-E形成病毒样颗粒的亚单位疫苗显示了较好安全性和免疫保护性，是该疫苗研究的重要方向。使用该病毒感染性cDNA进行的分子减毒活疫及多种亚型嵌合的减毒活疫苗研究也取得了较好效果，是另一个重要途径。,9、人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）疫苗人乳头瘤病毒是环型双链dsDNA病毒，其中与宫颈癌密切相关的有HPV16、18、33、58等亚型。外壳蛋白L1和L2能诱发机体产生体液和细胞免疫，预防乳头瘤病毒感染；E6和E7是与细胞转
30、化有关的蛋白，表达E6和E7的重组痘病毒疫苗能有效阻止HPV阳性的宫颈癌细胞生长和转移。表达HPV16和HPV18两型E6和E7的重组痘苗病毒已进行了小量人体观察，证明产生了部分抑制肿瘤生长的结果（1996）。L1和L2可在细菌、酵母及痘苗病毒载体中很好表达，并形成病毒样颗粒，有很好的安全性和免疫效果。治疗性疫苗以E6和E7为主，加上L1和L2可增强治疗性疫苗免疫效果。,10、Epstein-Barr病毒（EB）疫苗（1）危害：EB病毒为疱疹病毒科，嗜淋巴细胞病 毒属，感染广泛，90%以上成人都感染过此病毒。（2）方向：阻断其原发感染；清除鼻咽癌细胞。,（3）方法：前者主要以EBV的MA（如g
31、p350）为免疫原，gp350亚单位疫苗和表达gp350的重组痘苗病毒活疫苗显示了一定抗瘤作用；后者主要以EBV的潜伏膜蛋白LMP1和LMP2为免疫原，进行了多肽、重组活疫苗、DNA疫苗免疫细胞疫苗等多种尝试。,11、埃博拉病毒（EBV）疫苗vaccine）埃博拉病毒是单股负链RNA病毒，属丝状病毒，致死率极高。致病机制尚不清楚，曾试用过灭活疫苗，效果不好，减毒疫苗存在危险性，至今尚未成功。,第四节 我国基因工程病毒疫苗的开发战略研究（Development strategy of gene engineering vaccine in china)一、首先要明确基因工程病毒疫苗在整个病毒疫苗
32、研究开发中的地位和任务(Status and task)1 主要常规技术不能或很难解决的新疫苗(New generation vaccine)不能或难于培养的病原体；有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体。,2、传统疫苗的改造（(Reconstruction of traditional vaccine）主要针对免疫效果差，负反应大，成本较高和使用不方便的传统疫苗进行改造。3、加强治疗性疫苗研究（Intensification of cure vaccine research)近年来，使用疫苗进行疾病治疗的研究发展迅速，对引起慢性或持续性感染或与诱发肿瘤十分相关的病毒病，治疗性疫苗的研究将具有重要
33、性。,4、发展多价疫苗 多价疫苗成本低，免疫程序简单，是疫苗研究的发展方向。其发展方向为：使用基因工程技术对传统疫苗进行改造，获得联合疫苗；发展具有高导入、高表达、强免疫、可加强的新型载体。,二、目标的选择要以社会和市场需求为导向 1、研制预防我国严重病毒病的疫苗放在重点位置2、大力发展有市场前景新型疫苗,三、加强新型疫苗的基础研究 1、加强疾病免疫保护机制的研究（Intensify the research of immunity protection mechanism）(1)选取病原体的某些抗原或某些抗原表位，或删除某些无用甚至有害的组分而构成的，因而必须了解这些抗原、表位或组分在病原体
34、致病和免疫中的作用和机体对它们的应答。,(2)一些发病和免疫机制比较简单的疾病已用常规疫苗解决了，留下的是一些比较复杂和较难解决的疾病或问题，例如呼吸道、肠道和生殖系统黏膜感染，其病原体常多型善变；易于产生持续感染基因整合的病毒；免疫病理机制不清的病毒；病原体结构复杂，发育阶段多，免疫保护作用不强；常规疫苗由于反应大，效果差或引起个别严重并发症，需用新型疫苗来代替。,2、加强新型疫苗的免疫保护机制的研究（Intensify the research of immunity protection mechanism of novel vaccine）新型疫苗抗原的免疫保护效果是新型疫苗研究的首要
35、问题。活疫苗（包括基因工程活疫苗）最近似地模拟了感染后免疫，因而基因工程多肽疫苗和合成寡肽往往是用单一或少数几种保护性抗原，甚至单一个主要抗原表位代替完整的菌体或病毒颗粒。,产生的两个问题：第一，分子越小，其免疫原性越弱。因此多肽疫苗常需要用强有力的佐剂，以增强其免疫原性，合成寡肽则除了强佐剂以外，还要求偶联于一种载体蛋白上。第二，产生的免疫仅针对一种抗原，甚至一个抗原表位，在免疫的综合性方面就与感染后免疫相差甚远，其有效保护程度和时间还需通过实践加以检验。,基因工程疫苗类型和表达系统的选择对获得有效的免疫保护常用关键性意义。新型疫苗的作用方式对机体的免疫系统产生重要影响。任何疫苗的作用机体的
36、方式都不会与病原自然作用方式完全相同，因此必然产生新的免疫特点。在载体疫苗，特别是核酸疫苗中，这个问题尤为明显。在甲型流感的自然感染中，不同亚型间的共同抗原核蛋白无中和活性，也不能产生亚型间交叉保护。,3、提高新型疫苗免疫效果(Enhance the immune effect of new vaccine)基因工程多肽或寡肽疫苗成败的关键是如何克服免疫原性弱、免疫综合性差的问题。,（1）多抗原表达（Multi-antigen expression)新型疫苗的一个趋向是应用二个以上抗原。第一类都是表面抗原（2种以上）；第二类是同时用表面与内部抗原诱生中和抗体；第三类是用表面抗原与非结构蛋白。,
37、（2）颗粒性抗原(Granular antigen)在体外将多肽聚团化可形成100nm左右颗粒，如加入皂角糖苷（Quil A）可形成“免疫刺激复合物”（Immunostimulating complex，ISCOM）；将抗原包入脂质体内可形成免疫脂质体。,应用基因工程或化学交联方法将B细胞表位结合到HbsAg,核心Ag或轮状病毒核心表面，以增强免疫原性，特别是HbcAg具有T细胞依赖性和非依赖性免疫作用，是较为理想的颗粒型载体。有些病原结构基因的表达可产生不含核酸的病毒样颗粒，人类细小病毒B19株的壳蛋白可形成空心外壳；在痘苗中同时表达HIV的gag和env基因可形成类似病毒的颗粒。,（3）蛋
38、白质工程抗原 多个寡肽串联成“鸡尾酒式疫苗”是首先针对恶性疟原虫而提出的，是将多个不同的B细胞表位和多个TH细胞表位串联起来，同时删除可能存在的抑制性T细胞（suppressor T cell，Ts）表位。另一个也属于蛋白质工程范畴，是将本来在细胞内表达的抗原加以改造，使之表达于细胞膜表面，以增强其免疫原性。此外，将RSV的两个表面抗原G和F组合成一个蛋白质的研究也相当深入，组合似不影响到它们各自的抗原特异性。,（4）载体疫苗系统(Vector vaccine system)基于病毒的载体活疫苗；基于质粒DNA的非病毒载体疫苗。前者方向是“非复制型”载体，需克服不安全性和不易加强使用的缺点；后
39、者方向是改进导入效率、提高抗原表达、增强免疫反应强度、克服潜在的致癌及免疫病理作用。,其优点是：廉价、高效、易于组合成多价疫苗，是新型疫苗的重要组成部分。其缺点是：尽管用于载体研究的这些微生物都是疫苗株，但做为活疫苗载体，可能产生接种副反应。机体内针对载体的抗体，不论是免疫前存在的，或是免疫后产生的，都会对相应载体疫苗的再次使用产生一定影响，从而影响其免疫效果。,（5）免疫佐剂与联合免疫 强有力大都胞壁二肽的衍化物，如Syntex佐剂对多肽和寡肽都有很强的佐剂作用，能诱生抗体和细胞介导免疫，甚至超过了福氏完全佐剂，且无热源性，不引起肉芽肿、关节炎或其他组织损害。在用HCG-的37肽作为避孕疫苗进行人体实验时使用了这类佐剂。淋巴因子如胸腺肽、白细胞介素-2、-干扰素等均曾用于免疫增强目的。IL-2似乎只对某些抗原有佐剂作用，且须每天注射。,缓慢释放抗原的微胶囊（microsphere），虽不是佐剂，却能增强免疫效果。例如丙交酯与乙交酯共聚物，颗粒可达至3mm，小至1m。Al（OH）3依然独占鳌头。佐剂不但是亚单位疫苗成功的关键，而且还可通过选择不同的佐剂改变疫苗免疫反应类型，增加疫苗用途，提高新的免疫接种途径。不同类型疫苗联合应用，以达互补效果，是近年一些难度较大疫苗研制的新途径。,
