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1、肿瘤个体化治疗基因检测教程,教程目录,第一章 病理常规操作第二章 样本前处理（申请单填写、标本类型、标本评估及登记等）第三章 样本预处理（DNA、RNA提取及质量评估）第四章 基因操作（测序、片段分析及Q-PCR）第五章 结果解读及诊断报告出具第六章 资料汇总，资料库建立,第一章 病理常规操作,1.病理样本的接收2.组织固定3.取材4.包埋5.组织石蜡切片6.HE染色,1.病理样本的接收,1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4中性甲醛(10中性
2、福尔马林)固定组织的量应在610倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。,2.组织固定,临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。添加的量应610倍于标本体积.,3.取材及其后期处理,病理科病理医生取材核对标本及其标志与申请单是否一致。按照病理取材规范选取病变及正常组织。对送检标本进
3、行大体描述。取材后的标本保存至少两周。放入自动脱水机进行水洗脱水透明浸蜡前处理。,4.包埋,先将熔化的石蜡倾入模具，再用加热的镊子夹取已经浸蜡的组织块，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蜡。注意标本的编号和标本要对准，防止污染。为下一步切片准备，提供介质。,5.切片,刀片锋利，组织块预冷。切5-10um的连续组织切片，置于玻片上。捞片，烘干。,6.HE染色,苏木素伊红染色。苏木素染细胞核（核酸），伊红染细胞质（蛋白），使组织细胞对比清晰，便于显微镜下观察。主要流程：二甲苯脱蜡梯度酒精脱二甲苯苏木素染色分化、返蓝伊红梯度酒精、二甲苯封片。,临床技术操作规范病理学分册 2004年第1版,第二章
4、标本前处理,一、申请单填写1、登记患者基本情况，包括姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、病理诊断、标本病理号等2、患者签署知情同意书，留下联系方式3、患者病史及临床情况,患者病史及临床情况登记事项,有无手术（穿刺标本）手术时间 术前术后有无化疗，化疗方案及化疗效果及毒副作用（相关血项指标、胃肠反应、皮肤反应、神经反应等），治疗的单位。癌症有无转移，复发或者不能切除相关病史及家族史,送检标本种类：,外周全血；胸腹水；痰；尿新鲜(冰冻)标本；内镜活检标本；手术标本蜡块或切片,新鲜标本用10%中性福尔马林固定或用RNAlater浸泡20分钟以上（常温可保存10天）外
5、借病理蜡块，常规病理大小即可常规石蜡切片（10张白片），5-10um，常温送检,送检标本要求：,样本评估,血：保存温度、时间，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色观察结果是否有癌细胞蜡块或白片：组织保存时间、福尔马林固定时间、组织大小、有无癌细胞,将申请单登记入册,登记基因检测申请号、姓名、送检单位、病理号、检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,石蜡白片前处理1.烤片（90-95，0.5小时）2.脱蜡（过夜，最后一缸换新二甲苯）3.HE染色4.镜下区分选择肿瘤组织4.刮片5.消化肿瘤组织（200lTL+20lO
6、B酶，552-3h消化时间视具体情况定）,第三章 基因检测前处理,HE染色结果,DNA的提取,1.血DNA的提取2.石蜡组织DNA的提取,血液DNA提取,250l抗凝血加入250l Buffer BL和25l OB酶，70孵育15分钟。加入260l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l 70预热的洗脱液，静置5分钟，12000r
7、pm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Blood DNA kit protocol,石蜡DNA提取,在消化充分的组织中加入220l BUffer BL，震荡混合，于70孵育。加入220l无水乙醇震荡混合约20秒。取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。空甩离心，12000rpm2分钟。将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l70预热的洗脱液，静置5分钟，120
8、00rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Tissuse DNA kit protocol,电泳图,RNA的提取,1.石蜡组织RNA的提取2.血RNA的提取（化疗后需1200微升血白细胞太少）,1.石蜡组织RNA的提取,RNAlater样本处理另注加入250lbufferPKD和10l的蛋白酶K,涡旋混匀后，55C孵育2-3h，80C15min。然后加入500l的bufferRBC，充分混匀。将溶液转入gDNA Eliminator spin柱内，10000g离心30s，吸取收集管内液体至新的离心管，重复操作直至溶液都过滤
9、收集柱。在溶液内加入1200l无水乙醇，混匀，将溶液转入RNeasy MinElute spin柱内，10000g离心15s，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE，10000g离心15min，弃收集管内液体。加入500l buffer RPE,10000g离心2min。小心将柱取出，放入一新的收集管内，最大速度离心5min（将柱盖打开）将柱放入1.5ml收集管内，加入40-60l无Rnase酶水，盖上盖子，室温放置2min，最大速度离心1min洗脱RNA.,Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol,2.血RNA的提取,300l全血+1500l 1 b
10、uffer ERL（150l 10 ERL+1350l H2O）混匀。同时做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g 4，10min，弃上清。600l 1 buffer ERL混匀，洗涤细胞。洗涤后合并3管液体。450g 4，10min，弃上清。600l TRK裂解液+12l-巯基乙醇吹打混匀（可以暂时-70冻存）。加等体积70%乙醇，吹打混匀。将液体转入HiBind RNA提取柱内（800l/次），10000g离心1min，弃收集管内液体，重复操作直至所有液体都过柱。加700l RNA wash Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。换新的收集管，加500l RNA wa
11、sh Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。柱内加500l RNA wash Buffer，10000g离心1min弃收集管内液体。12000g 空柱离心2min。取一新的1.5ml离心管，在柱中央加入40l洗脱液，12000g离心1min。核酸蛋白仪检测提取RNA纯度及浓度。-70保存RNA。,Omega Blood RNA kit protocol,Quantifiler数据评估提取RNA质量OD260/OD280 1.82.0:纯度好 2.1:核酸降解 1.6:蛋白质污染,第四章 基因操作,PCR扩增（以K-ras为例）,反应体系为：10buffer dNTP(2mM)M
12、g2+TaqGenome DNAPrimer-F（10M）Primer-R（10M）H2O,2l 2l0.75l0.25l1l0.4l0.4l13.2l,Total 20l,PCR反应条件：置PCR扩增仪中95预变性15min，用TouchdownPCR，94变性50秒，63-58退火1分钟，72延伸1分钟，共循环10次，94变性50秒，57退火1分钟，72延伸1分钟，共循环30次，最后于72延伸10分钟。,电泳图,用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。,PCR产物纯化,1.加100lPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。2
13、.弃收集管内液体，加700lwashing buffer，12000rpm离心2min。3.弃收集管内液体，加400lwashing buffer，12000rpm离心2min。4.弃收集管内液体，12000rpm离心2min。5.柱内加30l70C预热洗脱液，12000rpm离心2min。,测序反应（以K-ras为例）,反应体系为：BigDye（2.5X）0.8l BigDyeSeqBuffer（5X）1.6 l Primer 0.3lPCR纯化产物 1lddH2O 6.3lTotal 10l,测序产物纯化,1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaAc（3M）到管里。2.每管加100l
14、100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。3.10C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。4.每管加100l70%酒精，5C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。5.37C;30min挥发净酒精，加10l Hi-Di溶解DNA。6.95C；变性5min，4C；4min，加样上机。,片段分析操作,步骤,1多重荧光PCR：15lPCRmix五种（胃肠）或七种（尿）引物0.8l（其中D17S283加1.2l）1lDNA.条件：95 C15min，94 C1min，56 C1min，72 C1min，30个cycle.lPCR产物0.4
15、lLIZ size standard+8l HiDi,95 C 5min,4C冰冷5min。上机，分析数据。,Q-PCR操作,详细步骤,1.RT反应:gDNA1l+RNA 6l；上机42C，2min；离心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，Primer 0.5l；上机A64程序。2.Q-PCR仪扩增（反应体系）2SYBR 2.5l Primer 1(5uM)0.5lPrimer 2(5uM)0.5lRT产物 1 lNuclease-free water 1l Total 5l,7900PCR仪反应程序,95C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。RQ Mana
16、ger 1.2软件分析实验数据。,第五章 结果解读及诊断报告出具,基因测序结果分析RNA表达量结果分析,测序结果图及分析,ABI3100测序仪测序，SeqScape v2.0分析结果为。以K-ras和EGFR为例,K-RAS 基因测序突变类型,K-ras:K2第12（GGT),13密码子（GGC）K3第61（CAA）密码子共9种突变类型：,GGT-GAT G12DGGT-GTT G12VGGC-GAC G13DGGT-TGT G12CGGT-GCT G12AGGT-AGT G12SGGT-CGT G12R,GGC-TGC G13CGGC-GCC G13AGGC-GTC G13V,7种 98%,
17、3种 2%,EGFR基因测序突变类型：,EGFR 第18,19,20,21外显子和第一内含子（CA）EGFR 19:容易发生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n16，EGFR非突变NSCLC患者服用TKI类药物具有短期疗效 EGFR 20:T790M 突变会使患者对EGFR-TKI 类药物产生耐药,EGFR18测序图,EGFR19测序图,EGFR20测序图,EGFR21测序图,EGFR intron 1测序图,RNA表达量结果图及分析,使用仪器为：ABI7900荧光定量PCR仪，分析软件为：RQ Manager 1.2,ERCC1,血液,石蜡组织,BRCA1,血液,石蜡组织,RRm1,血液,石蜡组织,VEGF,血液,石蜡组织,血液,石蜡组织,TS,第六章 资料汇总，资料库建立,将申请单，诊断报告按基因申请号装订成册按申请项目汇总电子版诊断报告，详细记录病人资料，做患者后续随访纪录治疗效果。统计总数，计算突变率，统计突变类型。可做纵向质控。方便后续资料检索查阅,
