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1、,常见可食用坚果的抗氧化和抗增殖活性,目录,一、研究进展二、研究目的三、研究内容四、实验内容五、实验总结六、展望,一、研究进展,坚果是不饱和脂肪酸，蛋白质，纤维，微量营养素，维生素，和植物化学物质丰富的来源，不同的坚果含量水平不同。坚果是植物化学物质的一个很好的来源的，包括酚类（丹宁酸，鞣花酸，和姜黄素），黄酮（木犀草素，槲皮素，杨梅素，山柰酚，和白藜芦醇），大豆异黄酮（木黄酮和大豆黄酮），萜类化合物和维生素E。,一、研究进展,坚果对人类健康的作用：1、有利的脂肪酸：A-亚麻酸抗心律失常，饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸有利于葡萄糖和胰岛素动态平衡2、抗氧化活性3、修复DNA损伤4、减少肿瘤的引发或
2、促进细胞的调控分化和增 殖5、免疫学活性的调控和炎症反应的调节,二、研究目的,坚果中成分的潜在作用机制可能是在对癌症的预防还没有完全被研究出来。到目前为止，关于坚果的研究被大部分重点放到了脂质方面。很少的研究被集中到了坚果的植物化学物质上，甚至很少注意到坚果的抗氧化性和抗增殖活性。,三、研究内容,（1）确定总酚的形态，包括坚果中可溶性游离酚和结合酚（2）测定总抗氧化活性（3）评价坚果的抗增殖活性对人类肝癌和结肠癌细胞的作用（4）探讨抗氧化性或抗增殖活性和总酚和类黄酮含量的相关性,四、实验内容,材料：（+）-儿茶素，亚硝酸钠，福林-乔卡梯奥试剂（FCR），盐酸，胰高血糖素，氢化可的松，胰岛素，和
3、KMBA，氯化铝，氢氧化钠，甲醇和丙酮，没食子酸，2,20-偶氮-异丁基脒（ABAP）九常食用坚果(杏仁、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、山核桃、松子、开心果和胡桃)和花生,提取流程图,方法,1、游离水溶性植物化合物的提取 25g坚果+200g 80%预冻丙酮（1:8 w/w）混匀搅拌5min均质5min抽滤45浓缩50%甲醇/水50mL正己烷除脂离心10min去正己烷层除脂两次45浓缩超纯水定容至10mL分装至2mL离心管-40储存备用。,方法,2、植物化学物质结合物的提取 取10g残渣充氮除氧，密封 40mL4mol/L NaOH消化1h浓盐酸中和至中性取10mL溶液过硅胶柱（1:2 v/
4、w）200mL 20%甲醇/乙酸乙酯洗脱洗脱液在45浓缩至干超纯水定容至10mL分装至2mL离心管-40储存备用。,方法,3、总酚含量测定：Folin-Ciocalteu比色法 所有提取物与蒸馏水以比例1:10稀释（制定没食子酸0.0-800.0mg/mL标准曲线）Folin-Ciocalteu试剂氧化碳酸钠中和 常温下反应90min后 760nm测吸光度，与已知的没食子酸标准曲线比较。,方法,4、总黄酮含量的测定 取0.25mL的提取物稀释10倍0.075mL 5%亚硝酸钠反应5min0.15mL10%氯化铝反应6min 0.5mL1mol/L氢氧化钠加蒸馏水至3mL在510nm用MRX I
5、I Dynex分光光度计测定该混合物的吸光度 黄酮的含量通过儿茶素标准曲线比较得到，平行测定三次，结果用（每一百克坚果中儿茶素当量）标准差表示。,TOSC法：总氧自由基清除能力检测法,5、总抗氧化能力的测定TOSC原理：ABAP产生的自由基与KMBA(-keto-methiolbutyricacid)作用可氧化产生乙烯,抗氧化剂的存在可与KMBA竞争结合自由基,从而减少乙烯的产量,最后通过乙烯的减少程度来衡量抗氧化能力的强弱。,MTS比色法,6、提取物抑制HepG2和Caco-2细胞的测试 用HepG2 和 Caco-2癌细胞模型来评价坚果提取物的抗增殖活性。抗癌症细胞增殖活性是用MTS比色实
6、验来测定的。HepG2细胞在Williams medium E上培养，Caco-2细胞在DMEM上培养,五、实验总结,酚含量的比较,胡桃含有最高可溶性游离酚含量，依次是山核桃，花生，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，松子和澳洲坚果，榛子。胡桃和榛子含量之间有59倍的差距。澳洲坚果是结合酚类化合物含量最高的，其次是花生，榛子，胡桃，山核桃，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，松子。澳洲坚果和最的松子含量之间有4倍的差异,2023/12/21,黄酮含量的比较,2023/12/21,山核桃含有最高的可溶性游离黄酮量，其次是胡桃，花生，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，榛子，松子，和澳洲坚果。胡桃含有最高的结合黄酮
7、量，其次是澳洲坚果，榛子，巴西坚果，山核桃，开心果，杏仁，花生，松子，腰果。,抗氧化活性的比较,胡桃有最大的抗氧化活性，其次是山核桃，花生，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，松子，澳洲坚果，和榛子。,2023/12/21,酚类物质的含量和总抗氧化活性之间存在正相关关系。坚果中酚类及黄酮类化合物组成了具有总抗氧化能力的部份，这表明植物化学物质和其协同作用可能是造成其强大的抗氧化活性的原因。,HepG2细胞和Caco-2细胞抗增殖活性,2023/12/21,胡桃，山核桃和花生的水溶性游离提取物对细胞增殖抑制呈剂量依赖性的关系；这10个样品的抗增殖活性在HepG2细胞和Caco-2细胞上有所不同。总的来
8、说，这10个样品抑制Caco-2结肠癌细胞增殖比抑制肝癌HepG2细胞增殖有更大的能力。,对HepG2 和Caco-2抑制的比较,通过坚果提取物抑制癌细胞的增殖能力能够部分地解释是由于提取物的总酚的作用，这表明一个特殊的酚类化合物或坚果类的酚类是负责其抗增殖活性的。特别的酚类化合物与其他化合物在发挥抗增殖活性的作用中可能是充当相加地，协同作用地，和/或拮抗作用。,酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系,酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系,坚果总酚含量的可溶性游离酚类和总的抗氧化活性以及可溶性游离黄酮含量和总的抗氧化活性之间有直接的关系。用可溶性游离酚/黄酮含量和中值有效剂量（EC50）与HepG2和Caco-2细胞增殖的抑制作比较，肝癌细胞增殖的抑制和可溶性游离酚含量和可溶性游离黄酮含量之间存在弱相关性。在所测试的坚果总抗氧化活性和HepG2细胞的抗增殖活性之间没有显著线性关系。同样地，Caco-2细胞增殖的抑制性和可溶性游离酚含量，可溶性游离黄酮含量，总抗氧化剂之间呈弱的相关性。,六、展望,目前关于酚类化合物的研究都是在其理化性质上，对于人体肠道的吸收研究很少多酚类化合物在安全性评价方面研究很少图表布局有待改进,2023/12/21,
