肿瘤诊断.ppt

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1、,肿瘤的分子诊断Molecular Diagnosis of Tumor,Whats molecular diagnosis tumor?,病理切片和影像扫描,肿瘤的分子诊断Molecular Diagnosis of Tumor,一、肿瘤的分子诊断的目的与意义Purpose&Meaning of Molecular Diagnosis of Tumor,患家族性腺瘤性息肉瘤发现APC基因。,乳腺癌、卵巢癌的BRCA1、2、3,70基因等。,反向遗传学(reverse genetics)由基因的遗传连锁图分析,找到致病基因在特定染色体上的准确位置。,经典遗传学(classical geneti

2、cs)由疾病的表型改变去追溯有无肿瘤易感基因存在。,2早期诊断(Early-stage diagnosis of tumor),寻找肿瘤的早期诊断的分子靶点。,主要肿瘤的常用的多标志组合恶性肿瘤 主要标志 其他标志前列腺癌 PSA fPSA,PAP,ALP,CEA,TPS乳腺癌 CA153 CEA,CA549,CA72-4,hCG,LASA,erb-B2子宫颈癌 SCC CA125,CEA,TPA直结肠癌 CEA CA19-9,CA724,NSE胃癌 CA724 CA199,CA50,CEA,铁蛋白,SA,CA242原发性肝癌 AFP GT,ALP,TPS,GST肺癌 NSE ACTH,降钙素

3、,CA724,CEA,铁蛋白,LASA淋巴瘤-2M Ki67,LASA,LD2黑色素瘤 黑色素瘤抗原 NSE,LASA,血儿茶酚胺,L多巴脑胶质瘤 VMA HVA,NSE,铁蛋白,甲基卟啉卵巢癌 CA125 CA19-9,CEA,TPS,AFP,LD,hCG,胰腺癌 CA199 CA242,CA50,CA724,CEA,ALP膀胱癌 无 CEA,TPA,3肿瘤分类(Classification of tumor),WHO提出在传统病理学分型、分类的基础上,进行分子水平的分型。启动了肿瘤分子学分型工程,用分子生物学的检测技术对肿瘤进行分类、分型。能更准确地提供诊断、鉴别诊断和预后判断。,染色体的

4、t(15:17)易位的检测,区分M3型白血病;Bcr-Abl基因检测,可确诊CML型白血病。,4预后监测(Prognostic inspect of tumor),对血液、痰液、尿液等进行监测,可较早判断肿瘤的复发和转移。,(一)过表达或低表达(Over expressivity of gene)肿瘤细胞内癌基因过表达和抑癌基因低表达或突变后过表达。,二、肿瘤的分子诊断依据,转录水平检测 多拷贝基因使其转录增多,表现出mRNA过表达或突变体。,1点突变(Point mutation)人类大部分的肿瘤几乎都存在相关基因的点突变。,【For Example】肺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胆

5、囊癌、胰腺癌等存在H-Ras、K-Ras、N-Ras的12、13、61编码子的已知 点突变,3基因易位或重排 易位或重排使目的基因与它的调控基因出现位置上分离,导致目的基因表达异常,使细胞恶变。【For Example】B淋巴瘤:由于其Bcl-1断裂点发生t(11:14)(q13:q32)易位,Cyclin D1基因受到IgH启动子控制(IgH位于14号染色体),导致Cyclin D1基因的过表达,导致细胞癌变,对基因易位或重排检测将有助于肿瘤的诊断和生物学分型。,3.异常甲基化检测意义 检测异常甲基化的启动子作为肿瘤标志物。,2.异常甲基化导致基因表达失常的机制 低甲基化可使受抑制的癌基因过

6、表达,增加了整个基因组的 不稳定性;过甲基化可使抑癌基因的表达失活和蛋白质表达丧失。(类似于突变所造成的基因功能丧失)甲基化的CpG位点是突变热点和易发点(Mutant hot spots)(5-甲基胞嘧啶的嘧啶环4位脱氨基转变成胸腺嘧啶),四、肿瘤的分子诊断技术 Detection methods involved in the MDT,1.基因的检测技术 基因点突变检测(Gene point mutation)基因缺失、易位检测(Gene loses&translocation)基因过表达检测(Over expressivity of gene),(一)传统检测方法(Method of t

7、raditional detection),(1)基因点突变检测(Gene point mutation)已知有义点突变检测,一直是肿瘤分子生物学检测的主要研究对象。等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)一种建立于基因杂交基础之上的已知点突变检测技术。,【ASO检测原理】,PCR-SSCP法(PCR-单链构型多态性检测)利用基因突变后,其单链DNA的二级结构发生改变,这样在非变性 聚丙酰胺凝胶(56%)电泳时会出现迁移率改变。,荧光共振能量转移探针结合融合曲线分析(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)检测探针与靶DNA杂交后,根据杂交结合物的解

8、链温度(Tm)的差异进行基因点突变的实时监测。并结合荧光融合曲线分析,提高点突变的检测分辨率。,50,52,DNA序列分析(DNA sequencing)利用双脱氧终止法进行碱基序列分析。肿瘤DNA的核苷酸序列测定后,再与正常DNA序列进行比较,以确定突变的类型和突变的位置。,染色体Giemsa染色分析 采集新鲜的肿瘤组织,经短期培养后用秋水仙素处理,使细胞停留在有丝分裂中期,收集细胞,制片后经10%Giemsa染色显带,进行G带分析。【染色体核型】单倍体、异倍体、缺失、重排、易位、倒位、插入等。,荧光原位杂交(Fiuorescence in situ hybridization,FISH)荧

9、光素标记核苷酸制被探针,通过原位杂交检测目的靶DNA存在的一种分子检测技术。,【FISH最大的优点】可以检测染色体结构异常和靶基因定位。可用于新鲜组织,也可用于固定组织的石蜡包埋切片。能用于有丝分裂中期细胞和间期细胞检测。具有较强的特异性、稳定性和无污染。,Normal,N,N,N,D,H,N,H,D,1,W,2,W,36%粒,33%粒,18%粒,35%粒,12%粒,29%粒,Western blot,ELISA检测仪器,(三)组学检测技术【生物芯片技术(Technique of DNA chip)】生物芯片或微阵列技术是指在一小片(或微粒)固相载体上储存大量的生物信息,并形成高通量的检测技术。,(Wen用DNA芯片和DNA序列分析两种技术对108例卵巢癌p53基因突变进行检测,并比较两种技术的效率、敏感性,其中57例突变被两种方法同时检出,一致率为81%,另外14例被芯片检出,但有6例由测序检出),2.蛋白质组检测技术【血清学检测】蛋白质组技术与血清学研究相结合,应用于肿瘤标志物的筛查和鉴定工作。,血清蛋白质组分析(SERPA),血清全蛋白进行分析(血清蛋白质指纹模型),【血清检测方法】,肿瘤组织蛋白 2-DE 组织蛋白质分离 免疫印迹 凝胶上蛋白质转印NC膜上 患者、健康人血清 显色,

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