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1、农业行业标准乳及乳制品中（X-乳白蛋白和乳球蛋白的测定液相色谱法（征求意见稿）编制说明中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）内蒙古智慧质量中心有限公司黑龙江飞鹤乳业有限公司一、工作简况（一）任务来源2018年10月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所完成了乳及乳制品中-乳白蛋白和-乳球蛋白的测定液相色谱法标准草案和项目建议书等书面材料，向全国畜牧业标准化技术委员会提出申报。2019年6月，农业农村部发布关于下达2019年农业国家、行业标准制定和修订项目任务的通知（农质标函（2019）77号）批准项目立项，项目
2、计划编号：农质标函（2019）77号2019-20,标准起草单位为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，协助单位包括农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）、内蒙古智慧质量中心有限公司、黑龙江飞鹤乳业有限公司。（一）制定背景牛奶是人们饮食结构中十分重要的食品，具备较高的营养价值,被认为是最完美的天然食品之一，在预防各种慢性疾病，促进人体各项机能成长等方面有着显著功效。乳蛋白是牛奶中主要的营养物质，它的含量是衡量牛奶营养价值高低的重要指标之一。a-乳白蛋白和0-乳球蛋白为牛奶乳清蛋白中重要的组分，具有较高的营养价值及功能特性。研究显示，a-乳白
3、蛋白是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，具有调节蛋白质平衡，促进免疫系统发育的作用。a-乳白蛋白与锌离子结合可以激活免疫因子，减少腹泻。此外，a-乳白蛋白富含的色氨酸是神经发育的重要因子，能够显著改善婴幼儿的睡眠质量。P-乳球蛋白能够与脂溶性维生素结合，从而促进他们的吸收；B-乳球蛋白有抗高血压、抗病毒、有助于钙、矿物质吸收等功能特性，已经被越来越多地应用于乳制品、婴幼儿配方食品中。-乳白蛋白和B-乳球蛋白是乳制品质量评判的重要指标之一。目前，国内外均无奶及奶制品中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测方法标准，建立高灵敏检测方法一直是制约奶业高质量发展的关键技术难题之一，迫在眉睫。（三）起草过程第
4、一阶段：起草阶段1）成立起草组在接到标准制定任务后，2019年6月成立了标准起草组，包括XXX共Il人（见表1）o2019年7月，标准起草组围绕a-乳白蛋白、P-乳球蛋白的检测技术等方面，制定了详细的实施方案和技术路线。*标准起草组成员及分工序号姓名单位分工1XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所整体方案设计，组织协调2XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所标准征求意见、方法验证3XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、标准文本撰写。4XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、材料完善5XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所方法优化、材料完善6XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究
5、所材料检查修改7XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改8XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改9XXX中国农业科学院北京畜牧兽医研究所材料检查修改10XXX内蒙古智慧质量中心有限公司方法验证JlXXX黑龙江飞鹤乳业有限公司方法验证2）收集和分析相关参考文献2019年6月到12月，收集到如下国内外相关法律法规、标准、书和文章，为标准起草提供了参考。37 JacksonJ.G,etal.Amultinationalstudyofa-lactalbuminconcentrationsinhumanmilk.JNuiriBiochem,2004,15(9):517-521.38
6、 YipingR,ZhengH,XiaojunC,JingshunZ,ZengxuanC,YongjiangW.Simultaneousdeterminationofbovinea-lactalbuminand-lactoglobulinininfantformulaebyultra-high-performanceliquidchromatography-massspectrometry.AnalyticaChimActa,2010,667:96-102.39 DingX,etal.Analysisofa-lactalbumin,-lactoglobulinAandBinwheyprotei
7、npowder,colostrum,rawmilk,andinfantformulabyCEandLC.DairyScience&Technology,2011,912:213-225.40 StandardizationIDF,Liquidmilk.Determinationofacidsolubleb-lactoglobulincontent.Reverse-phaseHPLCmethod.2005.41 DEWC,etal.Bioactivityof-lactoglobulinanda-lactalbuminTechnologicalimplicationsforprocessing.I
8、nterDairyJ,2006,1611:1229-1240.42 MeixiaChen,etal.DeterminationofnativelactoferrininmilkbyHPLConHiTrapTMHeparinHPcolumn.FoodAnalMethods,2019,12(11):2518-2526.由于本文件涉及的内容在奶业发达国家已经具有成熟的研究基础，考虑到我国奶业发展现状以及与国际奶业发达国家有效接轨，标准起草组首先查阅了以上相关参考文献，认为参考文献中关于a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测对起草本标准具有参考或是引用价值。3）实验工作，方法建立标准起草组在广泛查阅收集国内
9、外相关技术资料和标准基础上，拟定了样品前处理方法和仪器检测条件等初步实验方案，开展了乳及乳制品中-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测技术研究。本方法主要围绕生乳、巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、灭菌乳和乳粉中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测，从色谱柱的选择、检测波长的选择、前处理方法的确定、调PH后静置时间的确定、方法选择性、方法线性范围、标准溶液保存稳定性、方法定量限、方法准确度与精密度、实际样品的测定等多个方面对反相液相色谱法和凝胶渗透色谱法进行了优化实验和验证实验。4）试验验证情况2022年5月委托农业农村部乳品质量监督检验测试中心（北京）、农业农村部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨）和唐山市农产品质
10、量安全检验检测中心三家检测机构对标准方法的检测灵敏度、检测限、重复性、重现性、检测范围进行复核验证实验。验证结果表明，该方法设计合理，实用有效。5）形成标准征求意见稿在以上收集和分析相关参考文献，调研、试验验证工作的基础上，起草组按照标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则（GB/T1.12020）和标准编写规则第4部分：试验方法标准（GB/T20001.42015）的规定起草编写文本和编制说明，并组织开展4次专家讨论会。2020年6月150,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所组织召开视频研讨会，王加启、郑楠、张养东、刘慧敏、叶巧燕等104生产企业3收到20家单位及专家回函，共有160
11、条意见。经过研究和甄别,采纳64条意见，不采纳85条意见，部分采纳11条意见，并经过对征求意见稿进行修改完善，形成标准预审稿。第三阶段：预审阶段2023年3月31日，标准起草组组织召开了标准预审会，邀请李俊玲、陈义强、邓立刚、李宏、郑小平、刘壮、陶大力、靳婷婷8位专家，对标准预审稿进行了认真审查。在听取标准起草组汇报的基础上，专家组审查了标准文本及编制说明，提出如下修改意见:一是建议将标准名称修改为牛乳及其制品中-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定高效液相色谱法；二是范围添加“注：本文件仅适用于未变性的a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定；三是第一法标准曲线中增加lmgL的最低浓度点；四是编制说明中补充
12、两个方法提取步骤中“定容前后pH变化的相关数据和实际样品测定数据，以及生乳中B-乳球蛋白本方法与NY/T1663-2008的检测结果比较情况;六是按GB/T1.1和GB/T20001.4的要求进一步规范标准文本。专家组一致同意审查通过，建议标准起草单位按照上述意见进一步修改后形成牛乳及其制品中a-乳白蛋白和-乳球蛋白的测定高效液相色谱法(公开征求意见稿)，报全国畜牧业标准化技术委员会秘书处。预审意见汇总处理表附后。二、标准编制原则、主要内容及其确定依据(一)标准编制原则本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草，同时遵循以下原则：(1)政策性：
13、制定本文件直接关系到国家和广大人民群众的利益。因此，在制定过程中严格贯彻国家有关方针、政策、法规和规章。(2)先进性：对本文件中有关内容的确定，力求反映本研究领域的国内外先进技术和经验，使标准中所规定的技术内容有利于-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定。(3)规范性：在本文件征求意见稿的编制过程中力求做到技术内容的叙述正确无误，文字表达准确和简明易懂，标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑。(4)可操作性：可操作性是制定标准的必备因素，因此，在制定标准的过程中，始终把经济实用和可操作性作为重要的依据，以便在执行中容易操作。(二)主要内容及其确定依据1、反相液相色谱法M色谱柱的选择试验选取X
14、BridgeC18和XBridgeBEH300AC4色谱柱比较对浓度为100mg/L的IgG、BSA、乳铁蛋白、a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的分离效果。如错误!未找到引用源。所示，a-乳白蛋白和P-乳球蛋白标品在XBridgeBEH300AC4色谱柱上能与IgG、BSA和乳铁蛋白较好的分离且峰型尖锐对称，故选择XBridgeBEH300AC4色谱柱。图2-乳白蛋白和IJ-乳球蛋白等在XBridgeC18色谱柱上的色谱图1.2检测波长的选择不同文献中有报道利用液相色谱法对-乳白蛋白和-乳球蛋白进行检测，采用的检测波长有21Onm及280nm,为了选择待测物的最大吸收波长，本试验比较了上述不同波长下
15、-乳白蛋白和-乳球蛋白检测的色谱图（错误!未找到引用源。）。由图可知，a-乳白蛋白和B-乳球蛋白在210nm时进行检测，峰面积更高，且基线比较平稳，因此本试验采用210nm作为后续-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测波长。图3不同检测波长下a-乳白蛋白和A乳球蛋白典型色谱图(100mgZL)1.3前处理方法的确定牛乳中除了含有乳清蛋白外还含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能会对a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的检测产生干扰。因此要选择优化适当的前处理方法沉淀去除酪蛋白，以便更充分有效地提取未变性的a-乳白蛋白和B-乳球蛋白。本方法制定过程中比较两种前处理方法：方法一：取5.0g试样，加入水定容至25mL后离心
16、，取中间层试液直接上机检测。方法二：取5.0g试样，加入水定容至25mL,用乙酸调节PH至4.60,静置后离心，取上清液上机检测。如错误!未找到引用源。可见，经方法二调节PH处理后,生牛乳和巴氏杀菌牛乳中未变性的a-乳白蛋白和供乳球蛋白保留在上清液中，经上机检测，两种蛋白分离的峰型较好、基线平稳且出峰时无干扰，故选择此方法为生牛乳和巴氏杀菌牛乳前处理方法，且本方法仅适用于未变性的-乳白蛋白和P-乳球蛋白。ano乳舞白图4不同前处理方法的巴氏杀菌牛乳试样溶液色谱图但在乳粉和灭菌乳上机测定液中发现，*乳白蛋白和P-乳球蛋白无法与干扰物基线分离（错误!未找到引用源。），无法进行准确定量。需要再对前处
17、理步骤进行摸索和优化。（技术参数确定过程图5乳粉试样和UHT灭菌乳经酷蛋白沉淀后，上清液测定色谱图1.4 定容前后pH变化分别称取生乳和巴氏杀菌乳样品5g,每个样品三个平行,加入约15mL水，用冰乙酸调节PH值至4.60,然后用水定容至25mL,测定PH值,统计数据结果见表4,由表可知定容前后PH变化在0.010.02,变化在4.600.05范围内。表4定容前后PH对比结果样品名称编号定容前PH定容后PH生乳14.604.61生乳24.604.61生乳34.604.62巴氏杀菌乳14.604.61巴氏杀菌乳24.604.61巴氏杀菌乳34.604.611.5 调PH后静置时间的确定试验样液调P
18、H后的静置时间会对样液离心效果及样液上机后检测的-乳白蛋白和0-乳球蛋白的含量造成影响，因此分别选取调PH后静置IOmin、30min、Ih后离心IOmin,共3个条件的离心效果进行比对，离心结果见图6。由图可见3个条件的离心上清液均澄清无杂质；对3个条件的离心上清液同时稀释上机，结果见错误!未找到引用源。，由图可见3个条件的a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的峰形几乎无差别；同时也比对3个条件的峰面积、保留时间和含量，结果见表4,由表5可看出，三个条件的峰面积、保留时间和含量几乎无差别，在不影响检测结果的情况下，故选择效率更高的条件调PH后静置10min。图6调PH后不同仲置时问条件下齐心效果图图7
19、调PH后不同件置条件下峰型的比对表5调PH后不同静置时问条件下上清液上机响应值样品名称OI-LaP-Lg面积相对偏差（%）面积相对偏差（%）静置10min7728560.721.58静置30min781254静置1h7835621.6 方法选择性分别选取生牛乳和巴氏杀菌牛乳样品进行试验，由错误!未找到引用源。可见-乳白蛋白和0-乳球蛋白出峰区域未出现干扰峰。错误!未找到引用源。表明本方法可以很好地分离乳中常见的几种活性蛋白，方法选择性符合检测的要求。BSA KttSJ，乳白II白/乳母蛋白IF：L4!；-图9乳中各种活性蛋白分声色谱图1.7 方法线性范围绘制7点不同浓度工作曲线：将-乳白蛋白和
20、B-乳球蛋白标准中间液(200mgL)用一级水稀释，制得标准系列工作溶液，浓度为1.0mg/L、5.0mg/L,10.0mgL,20.0mgL,50.0mgL,100.0mg/L和200.0mgLt在本法所确定的试验条件下进样测定，得到*乳白蛋白和B-乳球蛋白的峰面积。以-乳白蛋白和B-乳球蛋白的浓度X(mg/L)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，在1.0200.0mg/L范围内呈良好线性关系，a-乳白蛋白回归方程Y=13556.22IX+1806.326,相关系数R=0.999949,见图10；P-乳球蛋白回归方程Y=14254.653X-18536385,相关系数R=0.99998
21、5,见图11。结果表明，本方法线性范围符合方法学要求。图Ioa-乳白蛋白标准曲线30m106-校正曲级图图UIi-乳球蛋白标准曲线1.8 标准溶液保存稳定性将浓度为10mg/mL的-乳白蛋白和-乳球蛋白标准储备溶液在-20C保存0、1、2、3个月后，分别配制成浓度为600mgL和300mg/L的标准工作溶液上机测定，结果见表6,表明储备液放置3个月后，上机测定峰面积无变化，因此本研究中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的标准储备溶液可以在-20C条件下保存3个月。表6标准溶液保存稳定性汇总表标液浓度名称时间/月面积平均面积相对标准偏差/%600mgLa-LaO1.6123600mgLP-LgO2.61
22、23300mgLa-LaO1.9123300mgLP-Lg0620349634639L91648945263884636304171.9 方法定量限通过调节PH至4.600.05,将巴氏杀菌乳样品中的酪蛋白和变性乳清蛋白沉淀，离心，取上清液过3kDa超滤管制备空白基质，在空白基质中加入不同浓度的-乳白蛋白和B-乳球蛋白标准中间液，上机测定，根据表7、表8和表9结果可知，当空白基质中-乳白蛋白的浓度为1mgL,信噪比S/N大于10,回收率为90.4%,折算样品前处理的稀释倍数后，得出样品中a-乳白蛋白的定量限为25mgkg0当空白基质中B-乳球蛋白的浓度为4mgL,信噪比S/N大于10,回收率为
23、93.9%109.0%,折算样品前处理的稀释倍数后，得出样品中P-乳球蛋白的定量限100mgkgo表7a-乳白蛋白方法定量限考察结果样品名称名称峰面积上机液浓度(mg/L)信噪比S/N回收率(%)1.0mg/La-La14557I15.25/2.0mg/La-La3()616239.79/3.0mg/La-La46020344.72/4.0mg/La-La60956469.86/5.0mg/La-La72250575.16/6.0mg/La-La88759687,25/空白基质加标-1.0a-La13165I12.9390.4空白基质加标一2.0a-La27993224.3191,4空白基质加
24、标-3.0-La42290342.6691.9空白基质加标-4.0-La55276465.8190.7空白基质加标-5.0-La75569571.03104.6空白基质加标-6.0-La84122678,8594.8表8P-乳球蛋白A方法定量限考察结果样品名称名称面积上机液浓度(mg/L)信噪比回收率(%)l.0mgL-Lg-A465113.65/2.0mg/L-A14619212.66/3.0mg/L-A20632313d2/4.0mg/L5LgA30512421.46/5.0mg/L-A48995524.86/SOmg/L-U-A62275630.21/空白基质加标-LOP-Lg-A/1/
25、空白基质加标-2.0P-U-A585623.6/空白基质加标。3.0-Lg-A1200439.06/空白基质加标-4.0-A28648417.8793.9空白基质加标-5.0-A4551751892.9空白基质加标一So-Lg-A6390062431102.6表9-乳球蛋白B方法定量限考察结果样品名称名称面积上机液浓度信噪比回收率%)1.0mg/L-Lg-B180611.942.0mg/L-Lg-B14520210J43*0mg/LP-Lg-B18700313.12/4.0mg/LP-Lg-B25327414.87/5.0mg/LP-Lg-B37538517*036.0mg/L-Lg-B435
26、6662095/空白基质加标-1.0-Lg-B/1/空白基质加标-2.0-Lg-B347022.53/空白基质加标-3.0-Lg-B925836.85/空白基质加标-4.0B2760941435109.0空白基质加标-5.0P-Lg-B36680514.5397.7空白基质加标-6.0-Lg-B39704618.8791.11.10 方法准确度与精密度本方法的实验室内回收率和精密度实验，以巴氏杀菌牛乳为样品基质，添加-乳白蛋白和B-乳球蛋白50Omg/kg、100Omg/kg和2000mgkg三个浓度水平，每个浓度水平进行3次重复试验，连续三天，测得回收率结果汇总于表10和表11。巴氏杀菌牛乳
27、在添加浓度500.02000.0mg/kg范围内，a-乳白蛋白的平均回收率在90.6%101.3%之间，相对标准偏差在0.8%2.4%之间；B-乳球蛋白的平均回收率在92.6%102.6%之间，相对标准偏差在0.2%5.5%之间。表IOa.乳白蛋白实验室内加标回收率和精密度汇总表检测日期样品类型编号实测加标值(mg/kg)理论加标值(mg/kg)回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差(%)第一天巴氏杀菌乳5()0-1462.150()92.493.6U500-2472.250094.4500-3469J50093.81000-11008.4100O100.8101.30.81000-2100
28、9.11000100.9Iooo-31022.0I(XX)102.22000-11922.4200096.195.01.720(X)-21863.22()(X)93.22000-31915.0200095.7第二天500-1452.750090.592.42.05(X)-2463.050092.6500-3470.750094.1IO(X)-I1008.1I(XX)1(X).8100.41.01000-2993.5IoOo99.41000-31011.4IOoOWlJ2000-11934.7200096.794.22.42000-2侬5.4200092.820(X)-31861.2200093
29、.1第三天500-1455,050091.090.61.9500-2443.250088.6检测日期样品类型编号实测加标值(mgkg)理论加标值(mg/kg)回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差(%)500-3460.350092.11000-1991,71099.299.21.()10(X)-2981.6I(XX)98.21000-31002.01000100.22000-1192L9200096J94.51.52000-21868.3200093.42000-31881.1200094.1表Ilo-乳球蛋白实验室内加标回收率和精密度汇总表检测日期样品类型编号实测加标值(mg/kg)理论
30、加标S(mg/kg)回收率(%)平均回收率(%)相对标准偏差(%)第一天巴氏杀菌乳500-1459,150091.896.15.5500-2472.650094.5500-3509.8500102.01000-1983.310009&394.73.8l(X)0-2944.3I(XX)94.41000-3912.4100091.22000-11943.620(X)97.297.40.22000-21949.3200097.52000-31949.3200097*5第二天50()-1463.450092.793.73.2500-2485.450097.15(X)-3456.650091.3LOOO
31、-I948.8100094.994.62.71000-2970.910()097J1000-3919.1100091.92000-118939200094+795.81.72000-21899.3200095.02000-31953.1200097.7第三天500-1529.0500105.8102.63.2500-2496.450099.3检测日期样品类型编号实测加标值(mgkg)理论加标值(mgkg)回收率(%)平均回收率()相对标准偏差(%)500-3513.9500102.8100O-I1046.11000104.6101.14.01000-2965,9100096.61()00-31
32、020.0I(XX)102.02000-11855.3200092.892.60.22000-21848*4200092.42000-31851.9200092.6.e-乳球蛋白在反向液相色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法中测得的数据结果对比分别选择3个生乳样品进行两个方法的对比试验，结果见图12和表12所示，由结果可知，两个方法结果差异较大，由于聚丙烯酰胺凝胶电泳为半定量方法，方法准确度不高，而反相液相色谱法分离度高、特异性强、定量准确。M-gS1S2S3M：Marker-g:B-乳球蛋白(sigma)S1：华西牧场20230410S2:华西牧场20230411S3:华西牧场20230412图12
33、0.乳球蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图表12B-乳球蛋白在反向液相色谱法和聚丙端眺胺凝胶电泳法的数据结果序号样品类型液相法(gL)SDS-PAGE(gL)Sl生乳4.45587,85S2生乳4.49297.29S3生乳4.43718.141.12 实际样品的测定采用已建立的方法，对生牛乳和巴氏杀菌牛乳中的-乳白蛋白和B-乳球蛋白进行测定，结果见表13,表明本方法适用于生牛乳和巴氏杀菌牛乳样品中a-乳白蛋白和-乳球蛋白的测定。表B巴氏杀菌牛乳、生牛乳中/乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定样品类型样品编号a-乳白蛋白平均含量(mgkg)加标量测定值(mg/kg)回收率(%)B-乳球蛋白平均含量(mg/kg)
34、加标量测定值(mg/kg)回收率(%)巴氏杀菌牛乳1788.81.547,795.3%104.5%297722.0209.696.5%-104.8%2797.6+1.148.0337L1+L5204.23864.10.549.53162,41.1200.74878.31.252+33426.81.9193.05892.11.852.03748.64.0196.4生牛乳61056.3+0.747+895.6%105.0%3699.31.5190.8954%104.6%79533+2.54933687.8+1.0204.78994.33.652.54150.41.9209.291035.3+0.9
35、51+63476.31.2206.110939.71.350.83698.1+0.62.91.13 髭牛乳和水牛乳实际样品的测定采用已建立的方法，对牝牛乳和水牛乳中的a-乳白蛋白和-乳球蛋白进行测定，结果见表14,表明本方法适用于耗牛乳和水牛乳样品中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的测定。表14把牛乳和水牛乳中公乳白蛋白和-乳球蛋白的测定结果畜种样品编号a-La(mg/kg)a-La(mg/kg)-Lg(mg/kg)B-Lg(mg/kg)加标量(mg/kg)回收率水牛12711.012716.33554.303573.850098.10%2272L653593.36牝牛11195.061208.55
36、741.1175865.150091.%II2I1222.01II5989.1072、凝胶渗透色谱法因反相高效液相色谱法无法准确测定灭菌乳和乳粉中-乳白蛋白和-乳球蛋白，通过查阅文献发现以盐酸肌为变性剂，以B-疏基乙醇为还原剂，断开蛋白质中的硫-硫(S-S)化学键，形成展开的a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的单体结构，经凝胶渗透色谱柱分离，可以实现高温杀菌乳、灭菌乳和乳粉试样中a-乳白蛋白和供乳球蛋白的准确测定。本研究从色谱柱选择、检测波长确定、样品提取方法、试剂用量、定量限、方法线性范围、精密度和准确度等方面进行该法主要技术参数的确定，结果如下。2.1 色谱柱的选择本实验选取3款凝胶渗透色谱柱：T
37、SKgeIG3OOOSWXL(7.8mm*30cm,5m),TSKgelG3000SWXL*2(7.8mm*30cm,5gm)、TSKgelUP-SW3000(4.6mm*30cm,2m),比较对浓度为0.0625、0.125、0.625、1.25、2.5mg/mL的a-乳白蛋白和P-乳球蛋白的分离度。如图13和表15所示，a-乳白蛋白和B-乳球蛋白标品在TSKgelUP-SW3000色谱柱上能较好地实现基线分离且分离度大于1.5,故选择TSKgelUP-SW3000(4.6mm*30cm,2m)作为本试验的色谱柱。QIP-NONi.Amx*白I2.-丸白白图13-乳白蛋白和P-乳球蛋白标准溶
38、液在不同凝胶渗透色谱柱的色谱图表15-乳白蛋白和IJ-乳球蛋白标准溶液在不同凝胶潜透色谱柱的分离度色谱柱Peak#lPeak#2平均分离度Ii-乳球蛋白(I-乳白蛋白平均保留时闻G3000SW14.5015.520.75G3000SW230.9533.481.06UP-SW3OOO14.351540L612.2 检测波长的选择将-乳白蛋白和P-乳球蛋白标准溶液在200400nm波长下进行扫描，得到其紫外光谱图见图14,由图可知，其在22Onm和28OnnI有吸收峰。图14以乳白蛋白和IJ-乳球蛋白标液凝胶沸透柱分高后紫外光谱图再将5mg/L、10mg/L-乳白蛋白和B-乳球蛋白标准溶液分别于2
39、2Onm和280nm波长下测定，得到色谱图见图15图18,信噪比见表16表19。由图表可知a-乳白蛋白和-乳球蛋白在220nm波长的响应比在280nm波长的响应高，但在220nm波长下的基线噪音高，致使a-乳白蛋白和P-乳球蛋白在280nm波长下的信噪比远高于220nm波长下的信噪比，故最终选取280nm作为检测波长。O(OW图15-乳白蛋白和II-乳球蛋白标准溶液（SmBzL）在28Onm的色谱图表16乳白蛋白和P-乳球蛋白标准溶液（5mgL）在28Onm的信噪比Peak名称保留时间面积高度浓度/ngL选择性分离度s/n1P-Lg14.766107205565/8.52-La15.85725
40、81311365L082.2717.37图16-乳白蛋白和-乳球蛋白标准溶液（IOmgZL）在28Onm的色谱图表17-乳白蛋白和口-乳球蛋白标准溶液（IOmgZL）在28Onm的信噪比Peak名称保留时间面积高度浓度/mg/L选择性分离度s/n1P-Lg14.72318()4292410/Z1212-La15.821440832027IO1.082.252655w图17-乳白蛋白和J-乳球蛋白标准溶液（5mgL）在22Onm的色谱图表18-乳白蛋白和P-乳球蛋白标准溶液（5mgL）在22Onm的信噪比Peak名称保留时间面积高度浓度/mg/L选择性分离度s/n1P-Lg14.62913938
41、963075/2.552-La15.6923001I883951.082.273.57图18-乳白蛋白和-乳球蛋白标准溶液（IOmgZL）在22Onm的色谱图表19-乳白蛋白和P-乳球蛋白标准溶液（IOmgZL）在22Onm的信噪比Peak名称保留时间面积高度浓度/mg/L选择性分离度s/n1-Lg14.6092534781196210/5.022-La15.68238568817213101.082.237.222.3 进样量的选择图19不同进样体积的色谱峰比较合适的进样量既能保证有良好的谱图、信噪比，还能尽可能减少对仪器、色谱柱污染。为了选择合适的进样体积，本试验比较了5L.10L和20L进样体积下-乳白蛋白和B-乳球蛋白标准品的色谱图。由图19可知，a-乳白蛋白和P-乳球蛋白在进样量为10L时，峰面积显著高于5L,且分离度优于5L,20L进样体积的峰面积与10L的差异不大，因此确定10L作为本方法的最佳进样体积。020018016-O14012-W0.
