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1、药用海水珍珠收敛生肌功效的物质基础和作用机制网络药理学研究张婷（广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011）摘要：目的挖掘珍珠收敛生肌功效的物质基础和活性成分作用靶标，进一步阐明其分子机制，为后期的实验研究提供指导。方法基于网络药理学的理论和方法，从成分-靶点-疾病-通路-功能间的相互关联入手，结合现代信息和网络数据库技术，通过检索TCMSP、STRING.STITCH、CTD,TTD、UniProt等数据库，获得珍珠活性成分潜在作用的疾病和靶点蛋白、靶点对应的基因、溃疡性疾病相关基因，运用CytOSCaPe3.2.1软件，构建成分-靶点、成分-疾病、靶点蛋白相互作用PPl网络等，将靶点
2、基因与溃疡疾病相关基因映射，得到核心靶点基因，进行GO注释、通路富集分析和PPI网络构建。结果成分-靶点、成分-疾病网络包含20个化合成分和相关靶点561个，271种不同类型相关靶标和292种相关疾病，关键靶标涉及PTGS1、PTGS2、IgT链C区、CTSD,F2THR,NOS、CYPlO1、F13A1,F7等，对靶点基因进行富集分析，得到收敛生肌直接相关通路28条；映射所得核心基因9个，构建基因蛋白PPl相互作用网络，GO注释得到的核心基因参与细胞代谢过程、血管内皮生长因子、细胞分化、血管组织重构、调节凝血、纤维母细胞生长因子生产、炎性反应、伤口愈合的监管等相关生命过程，在调节血管收缩、血
3、小板凝聚、细胞生长因子激活、凝血止血等方面具有一定的作用。结论对传统中药珍珠活性成分及关犍靶点的网络药理学研究提示其具有收敛生肌、修复溃疡的作用，丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缀氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等是珍珠产生收敛生肌作用的物质基础；珍珠的有效活性成分通过作用关键靶点来调控相关基因的表达、影响相关通路来产生收敛生肌、愈合溃疡的功效，本研究为阐明珍珠收敛生肌疗效机制提供了新的思路和方法。关键词：药用海水珍珠；收敛生肌；物质基础；作用机制；网络药理学Uncoveringthematerialbasisandmechanismofpearlsfunctionofhealingwoundandpromot
4、ingCytothesisbynetworkpharmacologicalanalysisTingZh任ngRniIUmghospitalaffiliatedfGuangxiuniversityoftraditionalChinesemedicine,Ncuining530011ABSTRACTAccordingtoChinesePharmacopoeia,pearl,atraditionalChinesemedicineformula,canbecommonlyusedasastringentsandusedtopromotegranulation,however,itsnotclearho
5、wtheyworkinhumanbody.Thepresentstudyaimedtofigureoutthematerialbasisandusethenetworkpharmacologytoestablishthetargetsoftheactivecompounds,whichmayhelptoelucidatethemolecularmachanisimsunderliningthetherapeuticeffectsofpearls.ThedatabaseofTCMSRSTRING,STITCH,CTD,TTDandUniProtwereretrievedtogetinformat
6、ion,suchasdiseasesrelatedtothecompounds,targetproteins,targetgenesandgenesassociatedwithulcerdisease,startingwithcompounds-targets-diseases-pathways-functions.Cytoscape3.2.1wasusedtoconstructcompounds-targetsnetwork,ComPoUndS-diseasesnetwork,interactionPPInetworkoftargetproteins,etc.Genemappingwaspe
7、rformedtodeterminethecoregenes,whichwasthensubjectedtoGOannotationandpathanalysis.Thecomounds-targetsnetworkcontained20compoundsand561targetproteinsbelongingto271differentkindsoftargets.ThekeytargetssuchasPTGSIPTGS2、Ig-I、CTSD、THR、NOS、CYPlOkF13A1andF7hadagreateffectonwoundhealing.Theenrichmentoftheta
8、rgetgeneswasanalyzed,and28direct-correlationpathwayswereobtained.GOannotationofthemappinggenessuggestedthatthe9coregeneswereassociatedwithcellmetabolism,regulationbloodcoagulationandtheexpressionofvascularendothelialgrowthfactorandfibroblastgrowthfactor,andplayedaroleinregulatingvascularcontraction,
9、plateletaggregation,cellgrowthfactoractivationofcoagulationhemostasis,etc.Pearlscanshrinkandconstricttheskintissuesandpromotegranulationbecauseoftheiractivecompounds,includingalanine,threonine,glycine,valine,tyrosine,phenylalanine,etc.Theactivecompoundsmayregulatetheexpressionofrelatedgenes,regulati
10、ngkeytargetsandrelatedpathwaysandpromoteulcerhealing.Keywords:Seawatermedicinalpearl;Astringency;Materialbasis;Mechanismofaction;Networkpharmacology珍珠入药始见于雷公炮炙论，历代本草均有记载，性甘、咸、寒，归心、肝经，具有收敛生肌、安神定惊、明目消翳等功效，被广泛应用于治疗消化性溃疡、口腔溃疡、糖尿病足、梅疮、烧烫伤、皮肤黏膜溃疡病症等，林江通过观察160例珍珠蜂蜜液治疗宫内节育器引起子宫异常出血，发现珍珠蜂蜜液可以改善患者的血液流变学指标，这一临
11、床运用与珍珠收敛生肌的功效关系密切。珍珠虽然临床疗效显著，但是其作用的物质基础和分子机制尚且不明，有待进一步研究明确。网络药理学是通过计算机分析整合大量生物学信息，涉及到生物、细胞、分子、代谢等多学科的融合，从药物-多靶点-机体间的相互作用入手，在蛋白、分子和基因层面揭示出机体与疾病作用机制，具有可控性强，缩短后续实验周期，节约经费等优势，同时从蛋白、分子、基因等水平进行系统研究分析药物的作用基础和分子机制，为传统道地药材的开发与利用提供理论依据和实验指导。1材料与方法1.1 材料水解南珠液”(2000年获得国家发明专利ZL.2；ZL.2；ZD由合浦海水珍珠，经过特定水解工艺制备而来，含有丰富
12、的氨基酸、无机盐、矿物质等各种天然活性化合物，作为研究的基础材料。1.2 方法1. 2.1珍珠活性成分作用靶点挖掘随着现代医学研究的发展，在治疗溃疡性疾病时需要干预多个靶点和多条信号通路，通过调控复杂的生物功能网络产生理想的治疗效果，选取药用海水珍珠成分中18种氨基酸、牛磺酸和Ca作为收集靶点的活性成分，在TCMSP、天然化学成分数据库、STITCH及PharlIlMaPPer中以20种成分的英文作为搜索词，挖掘出活性化合物所作用的靶点蛋白信息，整理所得271个不同类型的靶点蛋白，为构建成分-靶点网络提供数据文件。2. 2.2靶点垂钓靶点蛋白收集的过程中，遇到有些活性化学成分的作用靶点在数据库
13、中无法直接获得，利用STITCH,PharmMapper数据库对该成分作用靶点进行预测，垂钓出所有可能产生作用的靶点，选择其中评分较高的靶点蛋白作为该成分可能的作用靶点。检索网络数据库时，胱氨酸的作用靶点无法查询到，通过PubChem数据库找到胱氨酸的SMILES结构，下载后输入基金项目基于比一6和VEGF通路探究珠黄散去腐生.肌愈合创面的分子作用机制(2019MSo35):珠母导痰汤介导NMDA/多巴胺D2受体抗精神分裂分子机制研究(2O2OKYO7O44)；珠黄散活性成分介导NF-KB信号转导通路抑制炎性反应的分子机制及物质基础研究(GZZC)第一作者张停，硕士，助理研究员。从事传统方剂、
14、医药资源挖掘与整理工作，Tel:.Ema止STlTCH数据库中进行靶点垂钓，预测到TDPLPNP、P2RY1等15个靶点蛋白，补充成分-靶点数据文件。1. 2.3溃疡性疾病基因与靶点基因映射在TTD、CTD数据库中查找溃疡性疾病相关的基因，共18965个，选择其中评分大于30的疾病相关基因，整理得288个。对搜集到的271个成分作用靶点蛋白进行所对应基因的标准化，通过检索STRING和UniProt数据库得到269个成分作用靶点基因，利用Venny2.1.0软件与溃疡性疾病基因进行在线映射，结果见图1,找出共有的核心基因NOS3、CAT、MEhGOTI等9个，为后续对这些基因进行GO注释和通路
15、分析提供数据。etMnKM*iixMluM*m，龙分fr，ue*.6)Figure21Compositionandtargetnetwork(afteranalysis)Figure2-2Coretarget(degree6)本研究通过网络药理学分析得到珍珠主要成分作用核心靶点蛋白包括Thrombin、CathepsinD,CoagulationfactorVII,IgT链C区、NOS、FVlII等，史学良等研究发现对外科手术或严重创伤导致的出血，hFVIIa能够迅速激活人体凝血系统，达到快速止血的效果。凝血因子VIl是启动外源性凝血途径的核心，在很大程度上直接决定了机体的凝血状态和伤口止血愈
16、合的情况，珍珠活性成分可以活化人凝血因子Vll达到止血的功效。丁萌等3认为不同炎症反应因子与凝血因子间具有相关性，对血浆CRP、D-Dimer.IL-6、FIB的浓度和FViil的活性水平进行了分析，表明炎性反应因子CRP与凝血因子FIB及FviIl间均具有正相关性（长0.01）.有关研究表明靶点NOS与PTGS相互作用产生气体NO,调节体内血管舒张功能和一系列炎症过程，直接作用于血管平滑肌，诱导L-arginine/氧化氮通路，催化NOS产生No对血小板的粘附、聚集、活化发挥作用。凝血酶是人体凝血系统中的重要组成因子和血管内皮细胞受到损伤机体正常凝血时所产生的一种多功能蛋白酶，直接参与凝血过
17、程，介导血小板聚集，对伤口愈合具有止血、正向调节的作用，张耿坤等,通过临床观察82例上消化道出血患者，发现内镜f止血术联合口服凝血酶加快了出血点的愈合，从而提高了治疗效果。伤口修复后期形成的肉芽组织与成纤维细胞关系密切，LIYC等研究发现珍珠水解提取物能增强创口愈合过程中必不可少的纤维母细胞的迁移能力，这些研究都进一步佐证了珍珠水解活性成分参与炎症反应、细胞的免疫和代谢、促进凝血止血等，还可刺激成纤维细胞增殖，具有收敛生肌、促进伤口愈合的作用，可以运用在各种创伤出血和溃疡性疾病的临床治疗中。将20个珍珠活性成分潜在作用靶点271种输入CytOSCaPe3.2.1,联网检索数据库得到对应通路45
18、2条，靶点-通路网络如图2-3所示，其中直接与收敛生肌相关通路28条，分别包含Plateletactivation、SignalingbyNGF、SignalingbyEGFRPlateletAggregationFormationofFibrinClotCellCyclesPlateletdegranulationPlatelethomeostasis等，详细结果如表1所示。此外，还有一些间接相关和炎症通路，如InnatelmmUnCSySten1、Metabolismofaminoacidsandderivatives、MetabolismofcarbohydratesNOD12Signa
19、lingPathway等免疫应答和炎症密切联系的调节通路。ToIl样受体是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，可以及时识别入侵并激活机体产生免疫细胞应答。图2-3靶点通路富集网络图Figure2-3target-pathwayenrichmentnetworkdiagram表1靶点-通路书集结果Table1target-pathwayenrichmentresultsReactOmePathwayNumberofProteininPathwayProteinfromGQneSelP-valueFDRHitGenePlateletactivationrsignalingandagg
20、regation22696.79E-O35.43E-02F2,F13A1,PPIA,ADRA2C,ADRA2B,ADRA2A,SRC.P2RY1,PTPNlSignallingbyNGF42174.36E-O14.36E-01PRKACA.GRIN2A,GRIN2C,GRIN2B.IKBKB,GRIN1,SRCSignalingbyEGFRan63.32E-O13.32E-01PRKACA,GRIN2A.GRIN2C.GRlN2B,GRINl,SRCPlateletAggregationPlugFormation)3762.16E-056.91E-04F2,ADRA2C,ADRA2B,.M)R
21、A2A,SRC,PTPNlInterleukin-3,5andGM-CSFsignaling22152.33E-O12.46E-01PRKACA,GRIN2A,CRIN2C.GRIN2BGRINllnterleukin-2signaling21543.97E-O13.97E-01GRIN2A,GRIN2C,GRIN2B.GRINlAntimicrobialpeptides444438E-033.94E-02PRSS3,LYZ,DCD,LTFArachidonicacidmetabolism3642.15E-O32.15E-02LTA4H,PTGS2,PTGSl.AL0X5Col1surface
22、interactionsatthevascularwal120836.OOE-Ol6.WE-OlF2,PPIA,SRCFomationofFibrinClot(ClottingCascade)3932.08E-O21.18E-01F2,F7,F13A1CellCycle,Mitotic42029.88ETH9.88E-01PRKACA,CDC25BApoptosis15926,86E-016.86E-01MAPT,CTNNBlResponsetoelevatedplateletcytosolicCa2+10624.,68E-014.68E-01F13A1,PPIAPlateletdegranu
23、lation10124.43E-O14.43E-OIF13A1,PPIAPlatelethoneostasis5922.19E-012.46E-01NoSLNoS3Amyloidfiberformation4721.55E-O12.46E-01LYZ,LTFColIagendegradation3921.15E-012.46E-01CTSD,MMP8ApoptoticcleavageofcelIularproteins3821.IOE-Ol2.46E-01MAPT1CTNNBlCommonPathwayofFibrinClotFotination2224.29E-O21.71E-01F2,F1
24、3A1Nitricoxidestinlatesguanylatecyclase2224.29E-O21.71E-01NOSl,N0S3Thrombinsignallingthroughproteinaseactivatedreceptors(PARs)1722.68E-021.34E-01F2,SRCMetabolismofAngiotensinogentoAngiotensins132L63E-O29.78E-02REN,MMI:FactorsinvolvedinBiogakaryccytedevelopmentandplateletproductionHO18.07Efl8.07E-01P
25、RKACAColIagenformation7116.53E-O16.53E-01P4HA1Interleukin-IOsignaling4715.04E-015.04E-01lyGS2IntrinsicPathwayofFibrinClotFormation2212.79Ef12.79E-01F2MetabolismofnitricQXido181N35E-O12.46E-01N0S3ExtrinsicPathwayofFibrinClotForiiation517.16E-O22.15E-01F7如表1所示,通路PlateletaCtiVation、PlateletAggregationS
26、ignalingbyEGFRxFormationofFibrinClot、ThrombinsignallingthroughproteinaseactivatedreceptorsIntrinsicZExtrinsicPaIhWayofFibrinClotFormation.Metabolismofnitricoxide、Interleukin-2,3,5Signaling等都是与收敛止血、愈合创伤密切相关的信号通路。其中，血小板活化通路是激活、诱导血小板发挥生理作用关键信号通路，孙海燕等通过对36例健康人的血液标本进行蛋白免疫实验研究发现凝血酶可通过激活血小板内的PTENP13Kkt的信号通
27、路发挥作用，调控血小板内细胞周期蛋白的表达来诱导血小板活化。表皮生长因子受体存在于特殊的靶细胞质膜上，信号通路参与细胞生长、增殖、分化和迁移等活动，并且与肿瘤的发生有关，张芹等”指出EGFR广泛分布于哺乳动物细胞内，与其受体结合，能促进创伤愈合，已被用于角膜、胃、肠道、肝脏、骨骼、神经等多种组织创伤的研究，EGFR信号通路中位于下游的信号分子ERK和Elk-I被激活后可以产生促进细胞生存并维持细胞正常功能的作用，在研究肿痛细胞的血管生成、恶性增殖和转移等多方面有着重要的指导意义。1.2 珍珠活性成分相关疾病分类与网络筛选分析检索TCMSP网络数据库，统计得珍珠活性成分潜在作用疾病共806个，涉
28、及192种不同疾病，通过对成分-疾病网络进行筛选，取degree值大于10的节点构建核心疾病网络，如图31所示，Convulsion、Osteoarthritis-,InflammatoryPyresis、Schizophrenia,RenalCellCarcinoma,AnxietyDisordersCancer、InsomniaAbdominalaorticaneurysm、AdenomatouspolyposisCarpaltunnelSyndrome、Genitourinarytumors-Malignantmesothelioma等可能是珍珠水解成分潜在治疗的疾病，但具体对这些疾病的
29、治疗效果有待验证。杳询其中具有疾病分类号（ICDI0）,得到135个疾病分类号，共计16类，如图3-2所示，可见珍珠活性成分在Aoo-B99（某些传染病和寄生虫病）、C00-D49（肿瘤）、D50-D89（血液及造血器官疾病和某些涉及免疫机制的疾患）、EoO-E99（内分泌、营养和代谢疾病）Foo-F99（精神和行为障碍）、GOo-G99（神经系统疾病）、HOo-H59（眼及附器疾病）、Ioo-199（循环系统疾病）、JOO-J99（呼吸系统疾病）、LOO-L99（皮肤和皮卜.组织疾病）、M00-M99（肌肉和骨骼系统及结缔组织疾病）、NoO-N99（泌尿生殖系统疾病）、PoO-P99（起源于
30、围生期相关疾病）、Q00-Q99（先天性畸形、变性和染色体异常）、RoO-R99（症状、体征和临床与实验室异常所见不可归类在其他处）、S00-T88（损伤、中毒和外因的某些其他后果的后遗症）治疗方面可能具有潜在优势，由此推测珍珠可能通过这些活性成分作用达到镇静安神、调节内分泌和收敛生肌的疗效，在治疗肿瘤、神志不安、内分泌失调和皮肤皮F组织等疾病可能具有潜在应用价值。1 -66d60d2 -OTS1OQO388s36900I3 6S工，00工5IQQ6I66HOOH666N，OON7I66HxX8IJoo9I66n,Oown66OoVBl66n6091566UUOE1866_g25三6o8302
31、0100图3-1核心作用疾病(degree10)Figure3-1core-actingdiseases(degree10)diseasesofpearl疾病分类图3-2珍珠活性成分潜在作用疾病种类分布Figure3-2distributionofpotentialactingactiveingredients2. 3映射基因-蛋白相互作用PPI网络构建与分析映射所得9个基因为PTGSl、PTGS2、CAT、CTNNBl,XDH,NOS,IKBKB、MELGOTl,运用CytoSCape3.2.1软件构建其蛋白相互作用的PPI网络，如图5-1所示，基因-蛋白间相关作用不仅包括与其他蛋白间的作用
32、，也包括蛋白自身的作用，蓝色节点表示相互作用基因,粉色节点表示通过检索DIP、BIOGRID,HPR0、INTACT、MINI.BIND等数据库所得基因。对映射基因-蛋白PPI网络进行筛选,取degree值大于50作为筛选条件,得到核心网络图5-2,包含蓝色的检索基因ESRhAR、EGFR、HSPAS、MAP3K3,TRAF2,TRAF6和红色的检索基因IKBKB、CT、NBl等，这些核心基因及相关蛋白之间存在着复杂的作用关系，在生物体内的代谢过程也较为复杂多变，选取筛选所得较为重要的蛋白基因进行实验验证，测量珍珠水解液作用组蛋白基因表达的差异性,直接表明水解珍珠活性成分通过影响溃疡性疾病相关
33、靶点基因的表达，达到收敛止血、生肌敛疮的效果，为阐明珍珠分子机制提供基因层面理论依据。图5-1映射基因-蛋白作用PPl网络图5-2映射基因-蛋白作用PPl网络筛选(degree50)Figure51PPInetworkofmappinggene-proteininteractionFigure5-2PPInetworkscreeningofmappinggene-proteininteraction(degree50)2.4映射基因的GO注释与分析止血过程包括血液凝固、血小板聚集和血管收缩三个重要因素，如外伤性出血，可见受伤局部血管收缩，血小板在血管破损处凝集，并释放血管收缩物质及凝血因子，而
34、血浆及组织中的凝血因子FV、FVIkFV11.FIX、FX、FXIFXII等受到激活，参与血液凝固过程，收缩伤口而止血。对映射基因进行Go注释(结果如图6所示)，发现9个映射基因GO注释共涉及753个结果，包括PoSitiVeregulationvascularendothelialgrowthfactorproductionregulationofvascularendothelialgrowthfactorproduction、bloodvesselremodelingxregulationofbloodcoaguIatiorixregulationoffibroblastgrowthfa
35、ctorproductionpositiveregulationofinflammatoryresponse、regulationofwoundhealing等包含各种细胞组织蛋白、碳水化合物生成复合代谢生命过程及参与调解的信号通路等，朱朝军等询提出了慢性疮面煨脓长肉过程中的药疮交互作用，指出中药不但能够调节创面血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-BI)的释放，促进药物有效成分释放和疮疡活性细胞吸收利用，补充创面局部的营养物质的缺乏和愈合创面，由此可见，在止血这个复杂的连贯过程中，由于珍珠化学成分较多，故而其“收敛止血、生肌”机制也是多样化，这些活性成分对血液系统和血管生成
36、的影响，对炎症介质的产生和释放的影响、)组织细胞代谢和伤口愈合进度的影响等都有待进行验证。图6映射基因GO注释Figure6MappinggeneGOannotation分类结果显示与收敛生肌相关有14条（PCO.01）,具体结果如表2所示，其中CeUUIaraminoacidmetabolicprocess、smallmoleculebiosyntheticprocess、regulationofbloodvesseldiamotcr、regulationofvasoconstriction、vasodilationregulationofbloodcoagulationpositivere
37、gulationofsmoothmusclecontraction、negativeregulationofplateletactivation、positiveregulationofwoundhealing等涉及至J细胞生物合成过程的积极调节、多细胞组织过程调控、小分子生物合成和细胞氨基酸代谢过程、细胞凋亡的调控、调节血管直径、调节血管收缩和血小板活化聚集、凝血、伤口愈合的积极调节等生物过程,珍珠成分作用靶点TLRS(TLR1、TLR2,TLR4、TLR9及TLR9)、GPT、CYPlOl和NOD均可促进血小板活化，其中靶点通路NOS、Toll样受体等都与血小板活化通路密切相关，李晋等E通过观察人细胞中细胞色素P4504A11表达抑制时发现血管相关收缩因子表达也受到一定影响，表现为促血管收缩相关因子内皮素1受体(endothelin1receptor,ETlR)、血管紧张素1型受体(angiotensintype1receptor,ATlR)表达下调(尸513)：289-297.8孙海燕，毛德奎，董俏言，等.对凝血酶诱导血小板活化分子机制的研究J.当代医药论丛，2016,14(20)：5-7,9张芹，奥婷，肖淑英，等.表皮生长因子受体-细胞外信号调节激酶信号通路在缺血性脑血管病中的相关研究进展J.中国医药导报
