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1、ICS65.120CCSB46B21辽宁省地方标准DB21TXXXX-XXXX夏洛莱羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范点击此处添加标准名称的英文译名（征求意见稿）XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施辽宁省市场监督管理局发布*刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：锦州医科大学、朝阳市朝牧种畜有限公司、吉林大学、辽宁省农业发展服务中心。本文件主要起草人：王春强、张贺春、李纯锦、马巍、韩迪、
2、李宁、张拮。本文件发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号）,联系电话：024-23447862。标准起草单位通讯地址：锦州医科大学（辽宁省锦州市古塔区松坡路40号），联系电话：024-23264599o夏洛莱羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范1范围本标准规定了夏洛莱羊体外胚胎生产主要环节技术规范。本标准适用于夏洛莱羊种羊扩繁体外胚胎的生产及移植。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其
3、中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11供体羊donor指提供胚胎的母羊。受体羊recipient指接受胚胎的母羊。a1体外胚胎生产invitroembryoproduction指对母体进行激素处理，通过活体采卵或屠宰场摘取卵巢后采集卵母细胞，在体外条件下对卵母细胞进行成熟培养、体外受精、体外培养、获得可用胚胎，并将胚胎移植至同期发情受体，或冷冻的过程。羊胚胎移植技术。Vineembryotransfertechnology将良种母羊体内早期胚胎或体外受精及其他方式获得的早
4、期胚胎，移植到同种生理状态相同的受体母羊体内，使之继续发育成个体的技术。4供体绵羊的选择与饲养管理A1选择条件按照NY/T1571对供体羊进行选择。49饲养管理按照DB65/T4073-2017对供体羊进行饲养管理。5供体羊的激素处理所需药品见附录A。A5激素处理方法放入海绵栓或CIDR（含孕激素阴道栓）之日，作为发情周期的第。天，在第9天开始注射FSH,每天早、晚各注射1次，中间间隔约12h,连续3d,递减注射。注射第6次后间隔12h,对供体绵羊回收卵母细胞后取出海绵栓。参见附录B.6手术法活体采卵、屠宰后摘取卵巢采卵A1手术法活体采卵手术部位在离乳房前端约2Cnl处，腹中线大约6Cnl的左
5、侧或右侧位置，按下列要求执行：a）注射第5次FSH时开始空腹（手术前空腹24h）,禁饮禁食；b）麻醉及保定:根据绵羊体重，肌肉注射静松灵0.3mi-0.5mL,将其仰卧在手术架上并用绳索保定；c）使用肥皂水湿润手术部位的羊毛，刮毛刀刮去羊毛，并用水清洗干净：d）用2%-4%碘酊消毒手术部位，并停留5min;e）用75%酒精对手术部位脱碘、晾干；f）手术创布覆盖羊体；g）避开血管，用手术刀纵向切开3m5三长的刀口，将皮下结缔组织分离，暴露肌膜。再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性分离；h）食指和中指从刀口进入，在骨盆腔、耻骨前沿触摸子宫角，并将子宫、卵巢引出刀口外；i）用吸有抽卵液的10ml注射器抽取
6、突出卵巢表面的卵泡，边缘用纱布止血。回收卵泡液约6mL左右时，推入经抽卵液湿润的圆底试管，并放入37C水浴锅沉淀；j）在体视镜下捡出所有卵母细胞。69屠宰后摘取卵巢采卵a）注射FSH第6次后的12h,将待屠宰羊拉至屠宰场屠宰；b）在37C水浴锅中预热生理盐水，并在生理盐水中加入青霉素和链霉素各半瓶，倒入保温杯；c）将屠宰Ih内的卵巢用剪刀剪下，放入保温杯中，运回实验室内；d）在实验室内完成后期的所有操作；e）用剪刀将卵巢周围的结缔组织去除干净，38C生理盐水清洗卵巢3次，并浸泡于生理盐水中；f）用吸水纸吸附卵巢上的盐水，再用吸有抽卵液的注射器抽吸突出卵巢表面的卵泡；g）将抽完卵泡的卵巢至于60
7、mm平皿内，在平皿内加入2ml抽卵液，用刀片密集划破卵巢表层，并在抽卵液中涮洗：h）在体视镜下捡出所有卵母细胞；7卵母细胞的体外成熟培养将捡出的卵母细胞用干净的抽卵液洗涤3次，再用IVM液（卵母细胞成熟培养液）洗涤3次，按50枚/孔80枚/孔的密度，放入0.6L/孔IVM液并覆盖0.3InL矿物油的四孔板内。其中所用IVM液需在38.6、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中平衡3h.8体外受精A1鲜精受精8.1.1 对种公羊的选择按照DB65/T4073-2017对种公羊进行选择。8.1.2 采精a）采精前对种公羊外生殖器清洗消毒；b）采精后用精液稀释液按1:1稀释，放入30C的水杯中，置于
8、4的冰箱中1.5h,待用。8.1.3 鲜精上游取0.2InL平衡好的鲜精加入装有2mLIVF液（体外受精液）的圆底试管底部，置于二氧化碳培养箱内，待精子上游40min后，取上层约InlL液体于0.5mL离心管内，用1500r/min转速离心4min,弃去上清，再加入ImlIVF液，轻轻混匀精子，再次离心，留约0.1mL,轻轻混匀。用0.1%的透明质酸酶对成熟后的卵母细胞进行处理，除去部分卵丘细胞，并用IVF液洗涤3次后置于装有0.5mLIVF液的四孔板内。取30口L精子混悬液至四孔板内，与卵母细胞共同孵育。fi5冻精受精从符合GB/T5458的液氮中迅速取出冻精，投入37水浴锅内解冻3min,
9、取出细管并用纱布擦拭，剪掉细管的两端，将精液推入L5HiL的离心管内，用移液枪移入装入1mLIVF液的圆底试管底部，上游30min后操作步骤见8.L3.9体外培养将精子和卵母细胞共同孵育17h-23h的受精卵用IVe液洗涤3次，去除粘附于卵母细胞表面的精子。置于IVC四孔板中培养至48h,统计卵裂率，弃掉没有分裂的卵母细胞。此时的胚胎可用于移植，也可以继续培养至6d-8d,得到胚囊，用于移植或胚胎冷冻。10胚胎质量鉴定1检胚盛有冲胚回收液的表面皿放在体视显微镜下,在18C-25C内镜检,将检出的胚胎放入盛有保存液的35mm培养皿中。m5胚胎形态学鉴定方法a）输卵管胚:胚胎处于2-8细胞发育期:
10、卵裂球轮廓清楚,球体饱满，明暗度适中，数目吻合，为可用胚。b）子宫胚胎:处于3-7发育期的胚胎质量鉴定,分为1、2、3、4级。1级:发育正常，胚龄与发育期相吻合，卵裂球轮廓清楚，明暗度适中，细胞密度大，卵裂均匀。细胞变性率不超过10%,见附录C.2级:胚龄与发育期基本吻合，轮廓清楚，明暗适中或稍暗或稍淡，细胞密度较小或小型卵形球过多,细胞变性率为10%-20乳3级:轮廓不清楚，色泽过暗或过淡,细胞密度小，细胞变性率为30加40机4级:退化胚、变性胚。11胚胎的冷冻保存及解冻111胚胎的冷冻保存11.1.1 胚胎冷冻保存所需仪器、器材体视显微镜、胚胎冷冻仪、吸胚管、细管、细管塞、装管器、细菌过滤
11、器、培养皿。11.1.2 胚胎冷冻保存所需溶液保存液:含有0.4%牛血清白蛋白或20%血清的PBS液。10%甘油冷冻液:用保存液配制。1.5moLL乙二醉冷冻液(含0.1moLL蔗糖)：用保存液配制。11.1.3 胚胎冷冻保存操作步骤11.1.4 .1胚胎装管及记录1、2级胚胎用于冷冻，冷冻前将胚胎在保存液中冲洗4次-6次,然后直接放人冷冻液，并将胚胎装人细管。认真填好附录D所有明细;细管中胚胎的发育期、数量、质量用以下形式表示:如1枚1级桑根胚表示为IMlo其中M表示发育期，IMl左侧“大1”表示数量,右侧“小1”表示质量。11.1.5 .2胚胎冷冻程序、胚胎一保存液洗4次-6次-10%甘油
12、/保存液或L5InOL/L乙二醇/保存液一平衡15min-20min装管+冷冻仪(-5.5-7.0)f平衡5Inin-植冰一继续平衡5min-以0.3Cmin-0.6Cmin的速率下降-320C-35C-平衡5Ininf投入液氮。K5胚胎的解冻11.2.1 胚胎解冻所需的仪器、器材体视显微镜、温度计、解冻用保温杯、0.25mL塑料细管、吸卵管、细管推杆、装管器、90mm塑料培养皿,0.22L针头式细菌滤器等。11.2.2 胚胎解冻所需溶液保存液:含0.4%牛血清白蛋白或20%血清的PBS液。解冻液：lmoL/L蔗糖保存液。11.2.3 胚胎解冻方法a) 10%甘油冷冻胚胎的解冻：装胚细管一空气
13、浴(18C-25C)IOS-32水浴IOS一措干细管一剪去细管塞一推出胚胎一解冻液4min-保存液冲洗5次-6次一镜检。b) 1.5moLL乙二醇/保存液(含0.1moL/L蔗糖)冷冻胚胎的解冻(一步细管法)装胚细管空气浴(18C25C)IOsf32C水浴IOS一揩干细管一剪去细管塞一镜检。12受体羊的选择及饲养管理111受体羊的选择按照DB65/T4073-2017对受体羊进行选择。O5受体羊的饲养管理按照DB65/T4073-2017对受体羊进行饲养管理。13手术法胚胎移植121受体羊的同期发情处理13.1.1 同期发情处理方法药品:前列腺素（PG）、CIDRoPG法:第一次注射:任意一天
14、肌注PGO.1mg只。第二次注射:在第一次注射后7d后，注射剂量同第一次。第二次注射后12h-72h观察发情。CIDR法：以放入CIDR之日为0d,9d后取出CIDR,并在取出的前36h肌注PGO.1mg只，取出CIDR后，12h-72h,观察发情。13.1.2 胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见附录E。Ia5受体羊的胚胎移植13.2.1 受体移植所需器械药品手术台、剃毛刀、剪毛剪、手术刀柄、止血钳、巾帕钳、持针器、手术刀片、缝合针、缝合线、创布、纱布、16#针头（尖端磨钝）、35mm培养皿、移植器、针头式细茵滤器、5mL一次性注射器、酒精、碘酊、新洁尔灭、
15、生理盐水和青霉素等。13.2.2 受体羊胚胎移植操作步骤a）手术过程同供体母羊的冲胚手术。b）吸取胚胎:用移植器先吸一段约0.5Cm长的保存液，吸一段约0.3Cnl的空气，然后吸取含胚胎的保存液0.5cm,吸0.2cm空气,然后再吸取0.3cm保存液。c）输卵管内移植:将有黄体侧的输卵管伞部拨开,找到管口，把装有胚胎的移植器从管口插人2-3cm,然后将胚胎轻轻推出即可。d）子官内移植:将有黄体侧的子宫角取此用尖端磨钝的16#针头在子宫壁上扎一小孔，把装有胚胎的移植器从此孔插人子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。e）按附录E做好受体移植记录。f）受体创口缝合步骤同供体创口缝合。14妊娠
16、诊断受体羊胚胎移植后可通过是否返情，或第20-25天采用孕酮水平测定法，或疑似妊娠30天后通过B超早期妊娠诊断，确定妊娠与否。附录A（规范性）前期需准备的药品及器材A.1激素处理所需药品及器材A.1.1激素处理所需药品海绵栓或CIDR（含孕激素）、促卵泡素、生理盐水。A.1.2激素处理所需器材注射器（5mL、10mL）、长锻、CIDR放置器、高镒酸钾、喷壶、一次性手术手套。A.2手术法活体采卵所需药品及器材A.2.1活体采卵所需药品75%酒精、碘酊、新洁尔灭、0.9%生理盐水、青霉素、静松灵、消炎粉。A.2.2活体采卵所需器材羊手术架、保定绳、刮毛刀、手术器械盘、手术刀柄、手术刀片、手术直剪、
17、灭菌创布、灭菌纱布块、止血钳、IOmL注射器（8号针头）、持针钳、圆针、三棱针、缝合线、圆底试管、恒温水浴锅。A.3屠宰后离体采卵所需器材保温杯、高压灭菌吸水纸、10mL注射器（8号针头）、刀片。A.4捡卵及体外培养所需器材及药品次性塑料四孔板、中60mm培养皿、中35mm培养皿、中2.5mm玻璃管、体视显微镜、恒温加热台、二氧化碳培养箱、99%高纯二氧化碳、离心机、矿物油、0.1%透明质酸酶。A.5试剂配制A.5.1抽卵液的配制在TCMl99-hepes液的基础上，添加2%FBS、0.7mg/mL肝索钠和100IUmL双抗。A.5.2卵母细胞体外成熟培养液的配制（IVM）在TCMI99HCo
18、3液的基础,E,添力InO%FBS、0.05IUmL的FSH、0.05IUmL的LH、IygInL的雌二醇、24.2g/mL的丙酮酸钠、0.1mM/L半胱氨酸、10ng/mL的EGF和100IUmL的双抗。A.5.3体外受精液的配制（NF）输卵管缓冲液SOF液体的成分为：6.29mg/mL氯化钠、0.534mg/mL氯化钾、0.162mg/mL璘酸二氢钾、0.6u/mL乳酸钠、0.089mg/mL硫酸镁、2.1mg/mL碳酸氢钠.0.0357mg/mL丙酮酸钠、0.299mg/mL两水氯化钙、1%NEAA2%BAA100IUmL双抗。体外受精液成分为在SOF液的基础上，添加20%FBS6IUm
19、L肝素钠和100IUml庆大霉素。A.5.4体外培养液的配制（IVC）体外培养液成分为在SOF液的基础上，添加3mg/mL牛血清白蛋白。附录B（规范性）FSH3d注射时间、剂量注：本表以FSH总剂量45Omg为例：（2+1.5+1）x2x50=450mg；FSH（每瓶500Ing）用IOmL生理盐水稀释，50mgmL;若用活体采卵，在第5次注射FSH时禁饮禁食。发情周期天数第0天第9天第10天第11天第12天早2mL1.5mL1mL手术活体采放栓卵或屠宰摘晚2mL1.5mL1mL取卵巢采卵附录C（规范性）早期胚胎发育模式图17三三e6Od-ZOd注：1.未受精卵或1-细胞胚胎，为1日龄胚胎2
20、.216-细胞胚胎，为24日龄胚胎3 .早期桑篡胚，为45日龄胚胎4 .紧缩桑算胚，为5.56.0日龄胚胎5 .早期囊胚，为5.56.0日龄胚胎6 .囊胚，为6.06.5日龄胚胎7 .扩张囊胚，为6.57.5日龄胚胎8 .孵化囊胚，为7.58.0日龄胚胎9 .扩张的孵化囊胚，为9.010.0日龄胚胎B22钿艇2.4SB胞1.0d-20d2,Od-2.5d2161913早期桑其胚3.0d-4.0d4.0d-5.0dBO5.早期囊胚6.胚5.5d-6.0d6.0d-6.5dIJ76d-ao9.犷米的劣化H胚9.0d-10.0d附录D（规范性）供体羊采样记录液氮罐提漏号国产/进口冲胚时间畜主供体耳号品种注册号精液编号公畜注册号冷冻日期激素处理：发情日LHFSH品牌（厂家）批号孕酮处理预计发情日期FSH备注早晚早晚早PH晚早晚早实际发情日人工授精日第一次第二次第三次技术员小筒编号细管号和能色胚胎数和质量解冻日期备注采胚:时间黄体卵泡回收冷冻移植桑黄胚囊胚退化未受精卵附录E(规范性)胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期受体移植时间(发情之时为Od)桑箕胚(M)5.5d0.5d早期胚胎(EB)6.0d0.5d囊胚(B)6.5d0.5d扩张囊胚(EXB)7.5d0.5d
