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1、中国实验动物学会团体标准实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范编制说明中国实验动物学会团体标准实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范编制说明（一）工作简况，包括任务来源、协作单位根据中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会2022年3月22日下达的关于征集2022年实验动物标准化建议及标准立项的通知，湖南中医药大学牵头，组织华中科技大学同济医学院、广州医科大学、湖南师范大学附属湖南省人民医院共4家单位协作完成了实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范团体标准的起草工作,（二）主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会2022年关于征集2
2、022年实验动物标准化建议及标准立项的通知下达后，湖南中医药大学牵头，组织华中科技大学同济医学院、广州医科大学、湖南师范大学附属湖南省人民医院共4家单位开展了标准的起草、修改及验证工作。起草组成员包括戴爱国教授、胡清华教授、王健教授、蒋永亮教授、胡瑞成教授、易健副研究员，上述成员分别从事多年肺动脉高压疾病研究、实验动物标准起草、疾病动物模型研究等本标准起草相关研究工作，具有一定的知识储备和经验积累。起草组讨论形成了编制工作计划、编制原则和指导思想。（三）标准编写背景；1 .肺动脉高压肺动脉高国PUImOnaryhyPertenSiOn,PH）是指由多种异源性疾病（病因）和不同发病机制所致肺血管
3、结构或功能改变，引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征，继而发展成右心衰竭甚至死亡，不经治疗本病死亡率非常高。临床上，肺动脉高压分为5类：动脉性PH（pulmonaryarterialhypertension,PAH）、左心疾病导致的PH、肺病和/或缺氧导致的PH、慢性血栓栓塞性PH（chronicthromboembolicpulmonaryhypertension,CTEPH）和（或）其他肺动脉阻塞性病变所致PH、未明和（或）多因素所致PHo尽管不同亚类PH的病因不同，但都表现出相似的病理变化，包括肺血管内侧肥大、内膜增生和纤维化、外膜增厚伴随中度血管周围炎症细胞浸润、丛状扩
4、张性病变以及原位血栓形成，肺血管不断增生、重构使血管部分闭塞，肺血管阻力增加，导致进行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡。随着PH细胞分子学机制研究的不断深入和新兴药物的开发，患者的临床症状和预后都会有很大的改善，然而消除低氧是不可能的，且由于低氧所致肺血管收缩和重塑的渐进和不可逆性，当前仍是临床上治疗的难点，目前很多新兴药物（比如伊洛前列素、激酶抑制剂等）不但价格昂贵，还伴有多种并发症及副作用，临床普及面低，因而探索新的治疗途径和治疗方法意义重大，也很有必要。深入探讨PH的病因、病机、开发新的治疗靶点是亟待解决的关键问题。PH动物模型是研究PH发病机制和药物开发的重要载体。随着PH研究的深入，目
5、前已经构建了多种动物模型，但缺乏统一的制备方案和评价标准。PH模型制备和评价方法的规划范和标准化，将为进一步阐明PH的病理机制、提高PH患者的预后、探索新的治疗靶点提供基础。2 .前期研究基础我们的团队长期致力于肺动脉高压发病机制及防治研究，以肺血管损伤为研究核心，根据不同肺动脉高压的发生因素，目前已建立了香烟烟雾诱导性PH模型、低氧性PH模型、野百合碱诱导性PH模型以及复合型PH模型，从一般情况、血液生化、心肺血流动力学检测、病理特征等不同维度构建了肺动脉高压动物模型评价体系。相关研究获国家自然科学基金资助项目7项，发表与本研究有关论文300余篇。获国家教育部科技进步奖一等奖等多项奖励。3
6、.相关标准：我们查阅了中国实验动物学会信息库、中国实验动物标准化委员会制定的标准，国家军用标准全文数据库系统、国家科技部和解放军原总后卫生部发布的与实验动物相关的技术标准。目前并无肺动脉高压动物模型相关的标准规范。（四）标准编制原则；本标准的制定主要遵循以下原则：一是本标准编写格式应符合GB/T1.1和中国实验动物学会团体标准编写规范；二是科学性原则，在尊重科学前期研究基础上制定本标准，结合国内外大量参考文献，提出具体可量化的评价指标，使得制订的技术规范达到可操作、可评判；三是可操作性和实用性原则，所有造模方法和检测指标均便于使用单位操作，且经过多家单位的验证，便于推广应用；四是适用性原则，所
7、制定的诊断规范应适用于肺动脉高压大鼠模型的评价；五是协调性原则，所制定的技术规程应符合我国现行有关法律、法规和相关的标准要求，并有利于肺动脉高压动物模型的规范化和科学化。（五）确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订标准时，应增列新旧标准水平的对比；本项目主要内容包括制定肺动脉高压模型制备及评价相关术语;肺动脉高压模型制备及评价所需的检测设备、检测方法、测试时间和评价指标。本标准由范围；规范性引用文件；术语及定义；肺动脉高压动物模型制备和评价技术要求共五部分构成。现将“实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范”征求意见稿主
8、要技术内容说明如下：1不同类型肺动脉高压动物模型制备原理和方法肺动脉高压模型的建立方法主要有以下几种：利用低氧诱导肺动脉高压模型；利用药物、异物诱导肺动脉高压模型；通过手术分流建立肺动脉高压模型；借助基因工程建立肺动脉高压模型；混合干预建立晚期肺动脉高压模型等。目前PH动物模型仍不能全面模拟人体的发病特点，各种造模方法仍可优化和改进。本标准选取的以下五种造模方法，兼顾了肺动脉非特异性内膜和外膜增厚的经典模型（即低氧、MCT,香烟烟雾）以及丛状病变的更合模型（n5416缺氧、MC17缺氧）两大类，这五类模型都可以采用统一的标准进行量化评估，研究者根据疾病的不同病因和不同阶段选择合适的动物模型。1
9、.1 野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型1.1.1 实验原理野百合碱（monocrotaline,MCT）在经过大鼠肝脏细胞色素P450系统代谢后生成野百合碱毗咯，进而造成肺血管内皮细胞损伤和炎症，导致肺动脉高压的发生发展。1.1.2 模型建立技术要求和注意事项所有大鼠随机分为两组，即模型组和对照组。模型组：给予大鼠一次性腹腔注射（ip）MCT,推荐注射剂量为60mgkg-,o对照组：一次性腹腔注射（ip）等体积的生理盐水，4周后进行相关指标检测。McT注射剂量的注意事项：一般情况下，单次注射MeT（60-80mgkg-1）足以诱导肺动脉高压的病理特征，降低MCT的剂量（20-40mgkgT）相应
10、会降低肺血管重塑的程度，使大鼠产生适应性右心室肥大，与人类肺动脉的逐渐加重相反，大鼠的肺动脉高压会在4周后逐渐自发逆转。值得注意的是大鼠在单次注射腹腔注射MCT的6-8周后死亡率很高。1.2 慢性缺氧诱导肺动脉高压动物模型1.2.1 实验原理由于肺泡长期广泛缺氧导致肺小动脉收缩、肺动脉平滑肌增殖、肺血管炎症等造成肺血管重塑，导致肺动脉高压的发生发展。1.2.2 模型制备技术要求所有动物随机分为两组，即模型组和对照组。模型组：大鼠放入低氧舱（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）,每天低氧处理8小时，不间断重复4周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。所有动物都饲养
11、在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。1.3 咤0115416/缺氧（SUHX）诱导肺动脉高压动物模型1.3.1 实验原理Sugen5416（SU5416）是VEGFR-2受体抑制剂，在慢性缺氧大鼠中，SU5416可诱导肺血管内皮细胞死亡和功能障碍，促进内皮细胞转化为凋亡抵抗表型，增殖的内皮细胞引起动脉管腔闭塞，导致严重的肺动脉高压发生。132模型制备技术要求所有动物随机分为两组，即模型组和对照组。用按甲基纤维素（CMC）的稀释剂配备SU5416注射液。模型组：给予大鼠一次性皮下注射SU5416（20mgkg-）,并
12、低氧（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）处理8小时，不间断重复3周。在21天结束时，将大鼠返回室内空气（正常氧）再持续2周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。5周后进行相关指标检测。所有动物都饲养在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。1.4 香烟烟雾诱导肺动脉高压模型1.4.1 实验原理吸烟者容易发生肺动脉高压，并且不少吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期，未发生明显缺氧时己存在肺小血管重塑。因此，香烟烟雾可直接引起肺小血管重塑，导致肺动脉高压的发生发展。143模型制备技术要求所有
13、动物随机分为两组，即模型组和对照组。吸烟模型组大鼠置于香烟烟雾染毒箱（需有通气孔）内接受香烟烟雾刺激，每天2次，每次燃12支香烟，维持箱内烟雾量lh。所用香烟规格为：烟气烟碱量0.6mg、焦油含量9mg、烟气一氧化碳量Ilmg。为了避免缺氧对实验的影响，同时需要监测箱内氧浓度（氧浓度维持在18-21%）,基本可排除缺氧对本模型的影响。在箱内安装烟雾探测器，用于监测造模期间箱内CO浓度，CO浓度维持在80（MOOOPPm左右为宜。每周造模5天，连续造模4个月后进行相关指标检测。1.5 MCT/缺氧诱导肺动脉高压动物模型1.5.1 实验原理同1.1与1.2中的实验原理。152模型制备技术要求所有动
14、物随机分为组，即模型组和对照组。模型组大鼠一次性腹腔注射（ip）60mgkg-1的MCT后置于低氧舱（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）,每天低氧处理8小时，不间断重复4周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。所有动物都饲养在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。4周后进行相关指标检测。2肺动脉高压动物模型模型共性评价技术要求不同亚类PH的病因不同，但都表现出相似的病理变化，包括肺血管内侧肥大、内膜增生和纤维化、外膜增厚伴随中度血管周围炎症细胞浸润、丛状扩张性病变以及原位血栓形成，肺血
15、管不断增生、重构使血管部分闭塞，肺血管阻力增加，导致进行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡。因此我们在模型评价时，除了对模型动物的血流动力学进行常规检测之外，还重点对右心肥厚指数及肺血管重塑进行重点评估，用以评估疾病病程长短、严重程度的不同，种属特异性，血流动力学状态以及血管损伤性质的对肺动脉高压的影响。2.1 模型的一般症状观察要求观察大鼠活动及呼吸情况，精神状态，毛发颜色，营养状态等，有无异常表现，并及时记录大鼠体质量变化和患病或死亡情况。2.2 模型心、肺血流动力学检测2.2.1 具体检测指标- 右心室收缩压（RVSP）- 平均肺动脉压（mPAP）- 三尖瓣瓣环收缩期位移（TAPSE）右心室
16、舒张末期横径（RVEDD）- 右心室舒张末期纵径（RVEDL）- 右室舒张末横、纵径之比（RVEDD/RVEDL）肺动脉血流加速时间（PAAT）- 右心室游离壁厚度（RVFWT）2.2.2检测技术要求（1）超声心动图检测检查操作前准备：因为大鼠太大而无法在其清醒时手动约束，所以在进行超声心动图之前需对大鼠进行麻醉；使用3%异氟烷吸入诱导麻醉，以1%-1.5%异氟烷加100%氧气维持麻醉;使用金霉素软膏等或动物用软音涂抹大鼠的眼睛，防止麻醉后干燥；使用脱毛膏脱去大鼠胸部及右侧颈部的毛发；将动物放在手术平台上，保持仰卧位；下面放置一个加热垫，并设置加热水平以维持37-37.5C的体温（因为体温过低
17、会导致明显的心动过缓，而体温过高会导致明显的心动过速），操作过程中监测大鼠直肠温度；操作过程：检查部位涂布适量的耦合剂，用彩色多普勒超声诊断仪，配小动物探头（频率设置为25MHz）,帧频设置为150帧/秒，行二维超声心动图、M型超声心动图和多普勒超声心动图检查，检测相关参数评估右室功能及反应肺动脉高压，检查参数使用VisuaISonicsVevo770System设置。所有超声检测方法依据欧洲超声心动图协会指南要求进行。所有检测指标重复测量3次，取平均值。RVEDD和RVEDL：采用二维超声心动图，舒张期于心尖四腔面测量RVEDD和RVEDL,并计算RVEDD/RVEDL；PAAT：脉冲多普勒
18、取样线平行血流方向，肺动脉瓣水平记录肺动脉血流频谱，测得PAAT；TMPSE：2DM模式超声心动图中从心尖四腔切面测量的，将光标定位在靠近游离RV壁的外侧三尖瓣环上，并使其尽可能靠近心尖。RVFWT：在舒张末期，在胸骨旁短轴二尖瓣二维水平或胸骨旁长轴RV流出道水平的M模式下测量；结果判定：与对照组相比，模型组RVEDDsRVEDL、RVEDD/RVEDL明显上升高，而PAAT与TMPSE明显下降(P0.05);(2)右心导管法检测大鼠的RVSP和mPAP操作步骤如下：右心导管的制备：取9cm的PE管，将其一端2cm处卷成圆形，通过酒精灯或水浴加热的方法，使其前段弯曲弧度固定成形。尽可能的使导管
19、末端的弧度与右心室、肺动脉所形成的弧度相似。制备完成后，分别在距离末端5cm、6cm、7cm处做标记，作为插管时判断位置之用。插管前准备：自制右心导管预充淡且浸泡肝素生理盐水(I(X)UmL),保持导管通畅；多导电生理仪参数设置：将压力传感器连接到输入通道1;在软件中，将通道I设置为压力，通道2设置为心率；要将单位转换为mmHg,记录基线轨迹，使用压力表手动执行压力校准基线(如果使用血压传感器和PE管)，需在通道1下进行单位转换。分离颈外静脉：将大鼠放置于体视显微镜下分离颈外静脉；取颈部正中偏右纵切口，在切口的每一侧放置一对牵开器，以充分暴露颈部区域；切除唾液腺，使用镜子暴露右颈外静脉,小心地
20、将右颈外静脉与周围的结缔组织隔离开来;使用60缝合线对颈外静脉的远心端结扎，近心端做一松结以防止插管时血液流出过多。插管：用眼科剪在静脉中上1/3位置斜行剪开颈外静脉，用镜子稍提起近心端切口边缘，插入右心导管。插入时保持导管的弧向上。导管进入心脏前，要经过两次旋转：1)在腋静脉与颈外静脉交汇处，约在导管进入ICm后，此时应轻左旋导管。2)在静脉进入胸腔处，导管共进入约1.5Cm时，此时应右旋导管。若导管进入心脏，可观察到导管随心跳节律抖动，压力曲线由直线变呈有波形的曲线。这时，可将导管推进至7cm标志处，然后再缓慢退出导管，并不断左右旋转，导管可进入右心室。一般插入2cm3Cm可到达右心房，4
21、Cm可达右心室，4.5cm-5Cm可进入肺动脉。同时，还应根据监视器显示的压力值大小与压力曲波形的变化来判断导管尖端的位置，并作相关记录。平均肺动脉压(mPAP)=2/3舒张压+1/3收缩压结果判定：模型组大鼠的RVSP和mPAP显著高于对照组(PV0.05),判定结果。2.3.右心肥厚指数及肺血管重塑指标检测231心、肺组织标本获取技术要求大鼠在进行心、肺血流动力学检测后，放血处死大鼠，进行胸骨中线切开术以暴露心脏和肺部；IOml注射器抽吸无菌冷PBS,更换小针头，备用；手术剪剪开左心房，镜子固定心尖部，IOml注射器穿刺右心室，以适当速度注射PBS,PBS通过右心室-肺动脉-肺静脉-左心房
22、，将血液冲洗出来，待双肺变白，证明肺内血液基本冲洗干净；彻底离断肺门组织，取出双肺；离断升主动脉，取出心脏，生理盐水冲洗心脏。沿房室沟剪去左右心房和大血管，再沿室壁间沟将右心室(RV)游离壁分离，切开左心室(LV)游离壁。将分离的组织展平，并用滤纸吸尽其上的液体。分别对(LV)、室间隔(三)和右心室(RV)进行称重。2.3.2右心肥厚指数(RVHI)检测RVHl指数计算公式：RV/(LV+S)结果判定：模型组大鼠右心肥大指数显著高于正常组(P0.05),判定结果。233大鼠肺肺血管重塑相关指标检测肺动脉组织学评估：取左下肺组织，用含1%福尔马林+0.5%琼脂糖的PBS经气管充气，恒压20CmH
23、20,然后在10%福尔马林中性缓冲液中固定过夜，取5m厚的切片进行后续的分析。苏木素-伊红(HE)染色检测小鼠肺小血管病理变化。光学显微镜下观察拍照，ImageJ测量分析血管直径25100m的肌性肺小动脉。Masson染色检测肺血管纤维化。光学显微镜下观察拍照，ImageJ测量分析血管直径25100m的肌性肺小动脉。WA%=管壁面积/血管总面积XlO0%,WT%=肺小动脉管壁厚度/动脉外径XlOO%。免疫组化检测肺动脉-SMA的表达:肺组织切片经常规脱蜡至水,PBS缓冲液冲洗,H2O2阻断内源性过氧化氢酶，柠檬酸缓冲液进行抗原修复，滴加一抗a-SMA（1：500）4C孵育过夜，PBS冲洗后分别
24、滴加反应增强液、二抗，DAB染色，苏木精复染，饱和碳酸锂返蓝，梯度75%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜于200倍镜下观察a-SMA的表达。结果判定】）肺组织病理改变：相比较正常组大鼠，模型组大鼠肺组织出现血管内皮细胞损伤，细胞分布不均，动脉管壁明显增厚伴玻璃样变，小动脉管腔狭窄，肌化明显，肺组织有大量炎性细胞浸润，肺血管密度变小。2）肺小动脉形态计量学改变：模型组大鼠WT%、WA%较对照组明显升高（P0.05）,提示模型组大鼠小动脉管壁增厚，管腔缩小。3）肺组织MaSSOn染色：对照组大鼠肺组织无或极少有细丝状纤维沉积，肺结构清晰可见，排列规则；模型组大鼠肺组织形态紊乱、结构排列模
25、糊、有大量蓝色纤维沉积、肺组织间隙严重充血。4）肺组织a-SMA蛋白表达：采用IHC评分标准，在200倍镜下观察各组组织a-SMA染色情况，每张切片选取3个视野，以评价着色深浅程度及其面积计分。对照组细胞颜色着色浅且面积较小，蛋白表达量较低，1HC评分为阴性。模型组细胞着色较深，蛋白表达量高，IHC评分为阳性。（六）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果；本技术规范的参数、实验模式和测试时间的量化指标，由来自于多年从事肺动脉高压实验研究的专家团队,在调研分析近20年国内外有关肺动脉高压实验研究的文献和多家实验室采用的实验方法的基础上，依据自己长期的实践经验，总结提炼编
26、制形成的。具有很强的可操作性。（七）采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；目前国外尚无肺动脉高压动物模型的行业团体标准，只有对于具体某个模型或者检测方法的标准化操作规程（SOP）,且SOP文件多在起草实验室内部进行使用。该技术规范为国内外第一次制订。全部数据来自于参编专家在查阅大量国内外公开发表的文献资料，结合自己多年工作实践中积累的经验制订而成，具很强的实践操作性，达国际领先水平。（八）与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系；本标准的编制依据为现行的法律、法规和国家标准，与这些文件中的规定相一致。目前实验动物国标中没有肺动脉高压疾病相关的技术规程。（九）重大分歧意见的处理经过和依据；本标准起草过程各单位都对草案和征求意见稿提出了建设性意见,但未出现重大分歧意见。（十）标准作为强制性标准或推荐性标准的建议;本标准批准后建议作为推荐性标准使用。（十一）贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）；本标准发布后，将在标准参编单位应用。同时，参编单位将采取多种形式，利用媒体等各种途径，组织力量宣传贯彻，逐渐向相关单位推广。（十二）废止现行有关标准的建议；无现行有关标准。（十三）其他应予说明的事项。无其他需说明的事项。
