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1、,1,猪圆环病毒病防控措施,2,兽医科学研究的基本思路,基础研究：提供新理论和新概念，合成新材料：如病原结构、分类、入侵细胞、与宿主互作，致病机理等应用基础研究（1）研制新型基因工程疫苗、诊断试剂盒、药物靶标发现、抗微生物制剂筛选等（2）以临床需要为导向，围绕复杂的临床现象，发现原因，寻找解决方法。应用研究 临床观察、收集数据、分析等 制定新规程和标准等,3,我国养猪生产指标的差异,2011年统计，我国母猪数量4700万头左右，母猪年提供出栏猪是14-15头左右。散养户较差的生产成绩降低了我国养猪业的整体效益。如果全群成活率达到90%以上，那么不同日龄阶段的成活率指标分别是：哺乳：96%，保育
2、：97%，育肥：98%-99%。,4,国内外生产性能差距原因的分析,虽然母猪产仔数相当，但配种分娩率低（85%）：繁殖障碍问题（传染病与饲料根源）。产房仔猪：腹泻问题保育猪与生长猪：残次率高育肥猪：呼吸道问题（综合症）,5,保育阶段猪的主要问题：,断奶后发热（4041）消瘦皮肤苍白关节肿大呼吸道症状残次率高，成活率低（5085）,6,保育猪问题的根源,疾病威胁（1）母源抗体消失（2）病原乘虚而入：猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪2型圆环病毒；副猪嗜血杆菌；链球菌管理因素：断奶和混群应激；饲料的转换；密度增加,7,1、病原学（病毒的特点）2、流行病学（如何传播）3、致病机制（如何致病）4、临床症状（有
3、哪些表现）5、诊断6.疫苗研究7、预防控制措施8.需要解决的科学问题,猪圆环病毒相关疾病Porcine circovirus-associated diseases,相关临床表现：仔猪断奶衰竭综合征皮炎肾病综合征繁殖障碍增生性肠炎先天性震颤急性肺脏水肿（Acute pulmonary edema）,8,我们在猪圆环病毒病研究的历史,2000年，陈院士获得第一个由国家资助猪圆环病毒病研究的课题-国家自然科学基金课题（30170701），开展感染性克隆和病毒基因功能、伪狂犬病-2型圆环病毒基因工程疫苗研究。2007年：分离出猪2型圆环病毒WH株和其他毒株。2007年-：国家生猪产业技术体系项目资助
4、。2012年7月，获得新兽药注册证书-现在-将来：临床应用技术的集成。,9,1、动物和人类的圆环病毒,植物：椰树叶腐烂病毒、三叶草侏儒病毒和香蕉簇顶病毒。禽类：鹦鹉喙羽病毒、鸽圆环病毒、金丝雀圆环病毒、鹅圆环病毒。鸡传染性贫血病毒()；人类：美国在人轮状病毒疫苗中发现类圆环病毒；输血传播病毒（TTV），TTV-like minivirus 猪圆环病毒起源：由植物矮缩病毒（plant nanovirus)和脊椎动物杯状病毒重组产生（Gibbs and Weiller,1999）,10,猪圆环病毒分类,分为PCV1和PCV2型等。基因组1.7kb，是目前发现最小的脊椎动物DNA病毒。PCV1目前为
5、止尚未证明致病性。PCV2存在于多个组织，有致病性。1965年：血清中发现PCV2病毒；1991年第一个圆环病毒病案例报道。1998年分离出病毒。,11,PCV2 特点,无囊膜，单股负链环状DNA，基因组大小为1767(PCV2b)-1768bp(PCV2a)能在PK15细胞生长，但无肉眼可见的病变；其生长依赖细胞周期S期表达的细胞蛋白。用D氨基葡萄糖处理感染细胞，可促进病毒的增殖。,12,猪2型圆环病毒基因组虽然小，但危害大,13,猪2型圆环病毒主要基因的功能,ORF1：编码聚合酶，与病毒复制有关ORF2：免疫原性基因和毒力相关基因 很多基因工程疫苗或亚单位疫苗使用的靶基因。如表达ORF2的
6、重组伪狂犬病毒、重组沙门氏菌、重组波氏杆菌等。ORF3：引起细胞凋亡ORF4：负调控病毒的生长其它6个ORF的功能未知,14,PCV2 毒株之间ORF2的比较,B.R.Trible,R.R.R.Rowland/Virus Research 164(2012)68 77,受体结合区,诱饵表位区,抗体结合区,ORF2与病毒毒力的关系,两个氨基酸突变：P110A（传代30代，脯氨酸P变为丙氨酸）和R191S（传代120代，精氨酸变为丝氨酸）：增殖滴度增加，毒力增强；基因组中1331-1339bp（gctgtggcc，位于ORF2基因（10331734bp）中）序列差异（Krakowka S,，Vir
7、us.Res.2012，164:9099）:蛋白构象改变-疏水变为亲水；,15,16,PCV2感染降低活疫苗免疫效果,1.Oppressing T,McKeown NE,Harmon KL,Meng XJ,Halbur PG.Clin Vaccine Immunol.2006 Aug;13(8):923-9.PCV 2感染降低了蓝耳病活病毒疫苗的功效 另一方面，蓝耳病毒感染后，促进圆环病毒在体内的增殖和分布（G.M Allan et al.,2000）2.Huang YL,Pang VF,Lin CM,Tsai YC,Chia MY,Deng MC,Chang CY,Jeng CR.Vet R
8、es.2011 Dec 1;42(1):115.PCV 2感染降低了减毒猪瘟疫苗的功效 3.影响伪狂犬病活疫苗的再次免疫应答。Kekarainen(2008)：元凶是PCV2 ORF1中的CpG基序,17,猪2型圆环病毒研究的瓶颈问题-病毒分离的影响因素,PCV1污染，干扰PCV2的分离细胞无病变，很难确定是否感染；不同毒株对细胞适应性有差异,18,猪圆环病毒2型WH株的分离,PCR阳性病料接种细胞，在第5、10、15、20 代细胞培养物中，通过间接免疫荧光试验(IFA)、普通PCR、荧光定量PCR鉴定均为PCV2阳性,于第20代后毒价显著升高。,19,PCV2-WH株分离鉴定,荧光定量PCR
9、鉴定，分离毒株(WH株)拷贝数为5.84108/0.1g,20,PCV2-WH株基因组序列,GenBank 登录号为FJ598044 PCV2-WH株基因组为PCV2b,此外，也分离了9株圆环病毒,21,我国流行毒株为PCV2b,235 ORF2PCR为阳性的病料中，9株为PCV2 2a基因型 133份为PCV2 2b基因型 98份：为非2a和2b，推测为2c（丹麦存在）PCV2b毒力高于PCV2a基因型呈地方分布特征同一个猪场有PCV2a和2b同时存在,采用：ORF2 和全基因组测序；区分不同基因型的PCR等方法,22,分离毒株接种猪的皮炎病例-分离出新的基因型毒株，PCV2d;,23,新的
10、病毒基因型不断出现,台湾：2001-2003：PCV2a:22.9%2003-2011:PCV2b:77.1%我国大陆（2012年）PCV2b-1C(2a和2b的ORF2之间重组)；PCV2d;PCV2b变异株（2a的ORF1 与2b的ORF2重组）,24,2、流行病学特征,哪些因素与疾病的发生有关？,国家生猪产业技术体系项目资助,25,流行规律,传染源传播途径易感动物其它诱发因素（X因子）共感染因子,26,2-1 传染源与传播途径,病猪的粪尿、鼻腔能排毒；带毒公猪的精液（检测到3-4log10核酸/ml精液）感染后5天可检测到。间歇排毒51天（PCV2a)和81天（PCV2b)。垂直传播：繁
11、殖障碍病乳汁带毒(Madson et al.,2009;Gerber et al.,2011).发热期猪的血清（全血）中可检测到病毒蚊子传播,27,2-2易感动物,不同年龄的猪均可感染：胎儿，哺乳舍的小猪等感染后较为严重。日龄越小，症状越严重。Catherine：17日龄；无母乳。需要大量的病毒（接种量为107.0TCID50）其它动物：小鼠为模型,28,2-3 其它因子的参与,传染性因子 协同作用：细小病毒（复制病例）促进作用：肺炎支原体感染；猪繁殖与呼吸综合征病毒非传染性因子 应激：多次注射（疫苗，药物）。X因子：其它未知因子（？）,29,PCV2和PRRSV与HPS,链球菌的混合感染,3
12、0,3、致病机理,损害免疫系统，降低机体免疫力是新的免疫抑制病之一（蓝耳病、霉菌毒素中毒、猪伪狂犬病，猪支原体肺炎）,国家生猪现代产业技术体系项目资助,主要病理特征-淋巴细胞减少，其他细胞增生（Annu.Rev.Anim.Biosci.2013.1:4364）,31,the PCV2-associated lymphoid depletion and histiocyticto-granulomatous replacement of the follicle with multinucleated giant cells in the center.,the PCV2-induced lym
13、phoid depletion in the tonsils and PCV2-specific antigen(brown staining),32,单独感染的致病机理,1、感染单核巨噬细胞和树突状细胞，但不复制。单核吞噬细胞非特异杀伤外来病原 树突状细胞：抗原递呈功能2、细胞因子的水平：IL-2、IL-4、IL-10、IL-12的mRNA 下降，T细胞免疫抑制。3、引起淋巴细胞的凋亡，导致B和T淋巴细胞数量的减少（？）4、III型过敏反应，引起皮炎和肾病：原因：早期感染或高水平抗体,致病机制-感染PCV2后PAM转录组学研究,芯片分析，发现大量的炎性相关因子上调表达，这可能是PCV2引起全
14、身性炎症反应的内在原因。大量抗原递呈相关基因上调表达，这些基因的上调会诱导机体的细胞免疫。大量细胞增殖相关及细胞凋亡基因差异表达，说明PCV2能调节细胞的生长周期，最大限度的增殖病毒。抑制NFB信号通路相关基因被鉴定，说明PCV2感染后能导致机体的免疫抑制。,炎症反应,炎症是临床常见的一个病理过程，可以生于机体各部位的组织和各器官，例如扁桃体炎、肺炎、肾炎等。急性炎症时具有红、肿、热、痛、组织/器官功能衰竭等变化，同随时常伴有发热、白细胞增多等全身反应，实质上是机体与致炎因子进行抗争的结果。,炎症反应的信号转导,图解见备注,转录因子NF-B,NF-B是最早由Sen和Baltimore首先从B淋
15、巴细胞核提取物中检测到的一种能与免疫球蛋白链基因增强子B序列特异结合的核蛋白因子。NF-B是一种重要的核转录因子,在机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等方面发挥重要作用。,NF-B/Rel family,37,实验室混合感染模型,革兰氏阴性细菌感染：副猪嗜血杆菌血清4型和5型、猪链球菌与PCV2混合感染研究：LPS为PCV2增殖促进因子，与Chang et al.,2006结果一致。,38,感染PCV2的不同结局,B.R.Trible,R.R.R.Rowland/Virus Research 164(2012)68 77,39,4、临床症状,（1）、断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）（2
16、）、皮炎与肾病综合症（PDNS）（3）、繁殖障碍：妊娠早期流产（4）、先天型性震颤：123（猪瘟？）,国家生猪产业技术体系项目资助,40,4-1、断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）,临床表现：发热，消瘦，衰竭病理变化：脾脏坏死、腹股沟或肠系膜淋巴结肿大；肺间质水肿（肺炎）,41,A thin undersized pig affected by PMWS（断奶仔猪多系统衰竭综合征）,The accentuated spine(明显突出的脊椎)reflects the growth retardation(生长停滞)in pigs with PMWS.,Clinical symptoms（Jim
17、my Kwang,TLL,NUS),相同日龄猪生长速度不同，猪群整齐度差,42,43,流行病学特征,来自临床第一线的图片：肿大的腹股沟淋巴结,44,45,心肌冠状沟胶冻样,46,圆环病毒病Vs 大肠杆菌水肿病,2011.3.23西安,47,肺间质增宽，水肿,弓形体；巴氏杆菌蓝耳病？,48,4-2、皮炎与肾病综合症（PDNS）,死亡率低，可以自行康复，影响种猪外观。；圆环斑：紫色，与周围正常皮肤的界限清楚；猪无痒感；与缺锌、疥螨病和坏死性皮炎的区别皮肤不呈油腻状（干躁）本质上是一种过敏反应（早期感染后，再次感染），免疫复合物沉积所致,49,圆环病毒：皮炎,2013-7-6,拜耳长沙BET会议,5
18、0,2013.6.18.网络咨询，50-80kg猪，死亡。PCV2引起的皮炎,2013-7-6,拜耳长沙BET会议,51,鉴别诊断：母猪锌缺乏症,2013-7-6,拜耳长沙BET会议,52,渗出性皮炎,53,4-3 母猪圆环病毒皮炎与繁殖性能下降,54,4-4 PCV2引起先天性震颤和腹泻,病毒见于神经元的胞核和胞质内，细胞核呈强阳性，少量的小胶质细胞呈阳性。,小肠：黏膜固有层内淋巴细胞和树突状细胞胞浆呈阳性,2013-6-19,株洲会议,55,（5）急性肺脏水肿,肺脏实变胸腔积液病猪突然死亡,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,May 2011,p.201220
19、16 Vol.49,No.5,56,5、诊断方法的应用,（1）病原学检测：用于精液中病毒的检查（2）血清学检测：评价免疫整齐度，不用于感染的诊断或调查。（3）综合判定：结合临床特征，排除影响猪生长的其它疾病：腹泻耐过猪、寄生虫病猪、饲料质量不良,国家生猪产业技术体系项目,57,实验室检测方法,5-1、病原检测（1）病毒分离鉴定：PCV2 WH株（2）PCR：区分PCV1和PCV2 区分PCV2病毒两种基因型（2a,2b,2c?)：不同基因型的毒力差异？（3）基因组测序：检测病毒的变异（4）荧光定量PCR：测定PCV2病毒载量（5）免疫组化：发现组织中的病毒抗原,58,PCV2全基因序列PCR扩
20、增,注：1、2、3阳性结果；大小 1767bp或1768bp,引物：P1：5-GTA CCT TGT TGG AGA GCG GG-3 P2：5-TCA CAG CAG TAG ACA GGT CA-3，,PCR反应体系50L：模板1L，10Buffer5L，dNTP4L，引物均为0.4；反应条件：952 min，941min，581 min，722 min。,59,以血液为样品进行圆环病毒2型病原学检测,60,PCV2基因分型PCR方法的初步应用,注：样品6、21 为单纯PCV2a阳性；样品1、4、5、6、7、8、9、15、16、17、18、19、20为PCV2b阳性结果；21为阳性对照；2
21、2为阴性对照；M为DL2000,PCV2a-PCR,PCV2b-PCR,61,实时定量PCR检测猪2型圆环病毒,R2：0.997178,PCV2F：5-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3；PCV2R：5-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3；Probe PCV2S：5AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCT-3 本方法用于评估感染或攻毒猪的病毒血症高低和病毒培养的含量测定。,62,5-2、抗体检测,ORF2ELISA和免疫酶单层过氧化物酶试验：未免疫猪群感染调查、免疫猪群免疫状况评估中和试验：与保护力有关（一般在免疫后3周）；同时，-干扰素水平也与保护力相关。,63,
22、6.疫苗研究,6.1、灭活疫苗（1）免疫原选择：不同病毒株；杆状病毒或PCV1表达PCV2衣壳蛋白（Cap蛋白）。（2）免疫原的制备：转瓶培养；悬浮培养（3）病毒的灭活：甲醛（使蛋白质变性）；BEI（破坏核酸）（4）剂型：水包油，油包水，,64,疫苗制备毒株的选择,欧洲的流行毒株基因型也已经从PCV2a演变为PCV2b.采用我国流行毒株PCV2b基因型来源于PCV2a的疫苗不能提供在PCV2、PPRSV 和PPV混合感染情况下，针对PCV2b毒株及PCV2a/2b的完整保护力-Opriessnig et al.,2013,A PCV2 vaccine based on genotype 2b
23、is more effective than a 2a-based vaccine to protect against PCV2b or combined PCV2a/2b viremia in pigs with concurrent PCV2,PRRSV and PPV infection,Vaccine,31(3),487-94,65,病毒的灭活方式,PCV2抵抗力强，传统方法（甲醛）很难灭活。该试剂只破坏病毒表面蛋白。BEI灭活剂的选择：可破坏核酸，摧毁病毒复制能力，但是不破坏病毒的免疫原性蛋白。作为免疫原，保持其空间构像是关键因素之一。如大肠杆菌表达的ORF2蛋白，免疫后能产生抗体
24、，但无中和活性。,66,病毒灭活后细胞传代检验-灭活彻底,67,获得国家新兽药注册证书,68,猪圆环病毒病新型疫苗研究,6.2、弱毒疫苗：PCV2 ORF3基因缺失毒株 PK-15连续传120代致弱（ORF2中：110位氨基酸:脯氨酸 to 丙氨酸;191位氨基酸:精氨酸 to 丝氨酸）6.3 基因工程疫苗 以伪狂犬病为载体 以减毒沙门氏菌为载体6.4 DNA疫苗,69,疫苗实验室评价指标,（1）体温反应（2）病毒血症（定性或定量）（临床试验中也需要测定的指标）（3）抗体水平（ELISA抗体）（4）免疫后攻毒猪的病理变化（5）免疫组化观察病毒在淋巴结的分布,70,效力试验中组织病理学评价肺脏,
25、106 TCID50,轻度肺泡壁充血,107 TCID50,未见明显的病理变化,71,效力试验中组织病理学评价-淋巴结,未免疫攻毒组,72,组织学病理变化淋巴结,正在变性,网状细胞的变性坏死,未免疫攻毒组,105 TCID50 免疫组,淋巴滤泡网状细胞变性坏死,73,组织学病理变化淋巴结,106 TCID50 免疫组,淋巴窦出血,107 TCID50免疫组,未见明显的病理变化,74,6、疫苗临床评价,（1）提高保育猪或全程的成活率（2）提高猪群的整齐度（3）提高饲料报酬（4）降低其他疾病混合发生（5）经济效益提升,75,经济效益分析,保育阶段的经济效益,育肥阶段的经济效益,对于年出栏1万头规模
26、的猪场，出栏猪的平均重95千克，将增加的效益大约为：【21.35+（23-8）0.33+11.7+（95-23）0.24】10000=552,800元,76,如何正确使用疫苗？,是否应该使用疫苗：保育阶段成活率低于90时；皮炎出现，预示保育阶段感染。疫苗只起预防作用，不作为治疗目的。高水平中和抗体可清除病毒。在34周龄使用，可取得预期的效果干扰素对本疫苗没有影响。其它注意事项：疫苗的保管，注射前平衡到室温；针头消毒,77,猪圆环病毒病疫苗不同免疫程序的优缺点,母猪免疫：节省费用；是否有繁殖障碍；仔猪能否获得均一的抗体水平，需要测定。仔猪免疫：费用相对高，工作量大；但仔猪群体免疫整齐。母猪与仔猪
27、都免疫：最佳，但成本高、工作量大。,78,7、防治措施,免疫预防：是目前公认的最适预防措施控制继发感染：主要是副猪嗜血杆菌与链球菌的感染 个人建议：猪圆环病毒+副猪嗜血杆菌：解决保育猪残次问题加强饲养管理 优质的饲料（原料）：不使用霉变饲料 添加谷氨酰胺和精氨酸减轻PCV2感染小鼠的繁殖障碍问题（Ren W,Yin.Y,2011,2012,Amino acid）,79,8.控制猪圆环病毒病，仍需解决的科学问题,（1）病毒与宿主免疫系统相互作用（2）哪些风险因子是必须条件，两者如何互作？（3）区分灭活苗免疫和感染猪的方法（4）敏感细胞系的构建与应用（5）不同基因型之间的重组和新病毒的产生（6）混合感染及其防控,
