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1、医院消毒效果监测第一节医院消毒效果监测概述医院消毒是预防医院内感染的重要措施之一，消毒效果的监测是评价消毒设备运转是否正常、消毒药剂是否有效,消毒方法是否合理、消毒效果是否达标的唯一手段，因而在医院消毒、灭菌工作中必不可少。一、医院消毒效果监测的特性1.必要性(1)消毒灭菌效果监测方法专业性强，不检验不知道结果。(2)新建病房、新消毒设备、新消毒剂均应做效果监测。(3)特殊对象、特殊需要，必做效果监测。如移植术前、ICU病房、危重患者等。2 .科学性以科学的试验设计、熟练的技术、可靠的结果、确切地分析，得出结果评价。3 .规范性以权威规范为依据，符合其基本原则要求。如检测时机的确定、标准菌株的
2、选择、标本数、重复次数、实验方法等确立。二、医院消毒效果监测应遵循的原则(1)监测人员需经过专业培训，掌握一定的消毒知识，具备熟练的检验技能。(2)选择合理的采样时间(消毒后、使用前)。(3)遵循严格的无菌操作。三、监测方法的分类L根据检测方法性质分(1)物理方法：测量压力灭菌温度、测量紫外线强度等。(2)化学方法：各种化学指示卡。(3)生物方法：嗜热/枯草芽抱灭菌效果监测自然菌存活数监测。4 .根据消毒灭菌对象性质分(1)空气消毒。(2)表面消毒。5 .根据具体消毒对象分(1)压力蒸汽灭菌。(2)各种器械。(3)化学消毒剂。(4)紫外线灯杀菌效果。(5)手和皮肤消毒效果。(6)空气消毒效果。
3、(7)物体表面消毒效果。四、医院消毒效果监测的必要条件(1)专业实验室。(2)必备设备器材。(3)选择实验方法。(4)熟练实验技术。五、卫生部对500张床位以上医院感染管理的质量指标规定(1)医院感染率10%,灭菌切口感染Wo.5%。(2)医院感染的漏报率W20%,调查样本量不少于年监测患者数的10%o(3)医院必须对消毒、灭菌效果定期进行监测，灭菌合格率必须达到100%。(4)使用中的消毒剂、灭菌剂应进行生物和化学监测。消毒剂每季度生物监测1次，细菌含量必须V100CfU/ml,不得检出致病微生物；灭菌剂每月检测1次，不得检出微生物。化学监测应根据消毒、灭菌剂的性能定期监测。(5)压力蒸气灭
4、菌进行工艺、化学和生物监测。环氧乙烷必须每锅进行工艺监测，每包进行化学监测，每月进行生物监测。压力蒸气锅每天第一锅必须做B-D试验。(6)紫外线灯强度监测。每季度1次；30W新灯管N90W/cm2,旧灯管270uWc112。(7)胃肠镜等诊疗器材消毒标准不得检出致病微生物；腹腔镜、关节镜等应灭菌处理，不得检出任何微生物。(8)进入人体组织、血液、器官的医疗用品应灭菌处理，不得检出致病微生物；接触黏膜医疗用品细菌总数W20CfU/g(或200CfU100c11)2)；接触皮肤的医疗用品细菌总数200CfUg(或200cfu100cm2),不得检出致病微生物。(9)母婴同室、婴儿室物体表面和医护人
5、员手不得检出沙门氏菌。(10)医院各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌数标准。第二节紫外线消毒效果监测一、物理学监测方法灯管的紫外线强度(uWc112)用中心波长为253.7nm的紫外线强度测定仪(标定有效期内)，在灯管垂直位置Im测定。在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定。表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。对大肠杆菌，照射剂量应达到20000W/cm2,对枯草杆菌黑色变种芽抱应达到IOoOOoUW/cm?o(1)检测方法：开启紫外线灯5min后，将测定波长为254nm的紫外线辐照计探头置于被检紫外线灯下垂直距离Im的中央处，待仪表稳定后，所示数据即为
6、该紫外线灯管的辐照度值。(2)结果判定：普通30牝直管型紫外线灯，新灯辐照强度，90uWcm2为合格；使用中紫外线灯辐照强度N70HWcm2为合格；30W高强度紫外线新灯的辐照强度218OUWcm2为合格。(3)注意事项：测定时电压220V5V,温度2025C,相对湿度60%,紫外线辐照计必须在计量部门检定的有效期内使用。二、生物学监测方法(1)采用载体定量消毒试验。指示菌：大肠杆菌(8099或ATCC25922)。枯草杆菌黑色变种芽抱(ATCC9372)。(2)检测方法：开启紫外线灯5min后，将8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于4个不同间隔时间各取出2个染菌玻片，分别投
7、入2个盛有5ml洗脱液(1%吐温80,1%蛋白陈生理盐水)试管中，振打80次。经适当稀释后，取05ml洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种2个，放37。C培养48h作活菌计数。阳性对照，除不作照射处理外，取2个染菌玻片分别投入2个盛有5ml洗脱液中振打80次，余按以上方法进行。(3)判定标准：对指示菌杀灭菌299.9%判为消毒合格。达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准。第三节热力灭菌效果监测一、压力蒸汽灭菌效果监测方法压力蒸汽灭菌效果监测是一组综合措施，包括工艺监测、化学监测、生物监测。1 .工艺监测满足必要的灭菌参数、正确的包装、合理装载、设备运行正常。(1)灭菌包装要求。包装材料：透
8、气性好且能阻隔微生物。包装容器：带通气孔铝饭盒和搪瓷桶。灭菌包大小：下排气W30cmX30cmX25cm;预真空W30cmX30cmX50cmo化学指示器材：包内放指示卡，包外贴指示胶带。(2)装载要求：摆放要求：小包在下，大包在上，器械包在下，敷料包在上，开口容器口向下或侧放，所有包应该竖放，包与包之间留有空隙，勿贴靠柜壁。装量要求：下排气式不超过柜内容积80%,预真空式不超过90%且不少于柜内容积5%(脉动预真空)或10%(预真空)。(3)设备运行良好：排气系统通畅；仪表和温度时间程控反应正常；蒸气饱和度符合要求；柜门橡胶垫圈无损坏；柜门锁扣灵活有效。2 .化学监测法（1）化学指示卡（管）
9、监测方法：将既能指示温度，又能指示温度持续时间的化学指示卡（管）放入每一待灭菌的物品包中央，经一个灭菌周期后，取出指示卡（管），根据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。（2）化学指示胶带监测法：将化学指示胶带粘贴于每一待灭菌物品包外，经一个灭菌周期后，观察其颜色的改变，以指示是否经过灭菌处理。（3）结果判定：检测时，所放置的指示卡（管）的性状或颜色均变至规定的条件，可认为该包灭菌合格。（4）注意事项：监测所用化学指示剂须经卫生部批准，并在有效期内使用。3 .生物监测法（1）指示菌株：指示菌株为嗜热脂肪杆菌芽泡（ATCC7953或SSIK31株），菌片含菌量为5.01055.0XlOCfU/
10、片,在1210.5C条件下，D值为1.31.9min,杀灭时间（KT值）19min,存活时间（ST值）为23.9min0（2）培养基：试验用培养基为溟甲酚紫蛋白豚水培养基。溟甲酚紫蛋白脓水培养基配制：蛋白陈10.0g,葡萄糖5.0g,溶于100mI蒸锵水中，调PH值至7.07.2,然后再加2%溟甲酚紫酒精溶液0.6ml,摇匀后，按5d管，分装包口，置压力蒸汽灭菌器中，于115。C灭菌40min后备用。(3)检测方法：将两个嗜热脂肪杆菌芽抱菌片分别装入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位。灭菌柜室内，排气口上方放置一个标准试验包(由3件平纹长袖手术衣,4块小手术巾，2块中手术巾，1块大手术中，3
11、0块IOCmX10cm8层纱布敷料包裹成25cm30cm30cm大小)。手提压力蒸汽灭菌器用通气储物盒(22CmXI3cmX6cm)代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位的两只灭菌试管内(试管口用灭菌牛皮纸包封)，将储物盒平放于手提压力蒸汽灭菌器底部。经一个灭菌周期后，在无菌条件下,取出标准试验包或通气储物盒中的指示菌片，投入溟甲酚紫蛋白陈水培养基中，经56。C培养7d(自含式生物指示物按说明书执行)，观察培养基颜色变化。检测时设阴性对照和阳性对照。(4)结果判定：每个指示菌片接种的澳甲酚紫蛋白陈水培养基都不变色，判定为灭菌合格；指示菌片之一接种的澳甲酚紫蛋白陈水培养基，由紫色变
12、为黄色时，则灭菌不合格。(5)注意事项：监测所用菌片须经卫生部认可，并在有效期内使用。二、干热灭菌效果监测方法1 .化学检测法(1)检测方法：将既能指示温度又能指示该温度持续时间的化学指示剂分别放入待灭菌的物品中。经一个灭菌周期后，取出化学指示剂，据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。(2)结果判定：检测时，所放置的指示管的颜色及性状均变至现定的条件，则可认为该包达到灭菌条件。(3)注意事项：检测所用的化学指示剂需经卫生部认可，并在有效期内使用。2 .物理检测法(热电偶检测法)(1)检测方法：检测时，将多点温度检测仪的多个探头分别放于灭菌器各层内、中、外各点。关好柜门；将导线引出，由记录仪
13、中观察温度上升与持续时间。(2)结果判定：若所示温度(曲线)达到预定温度，则灭菌温度合格。3 .生物检测法(1)指示菌株：枯草杆菌黑色变种芽抱(ATCC9372),菌片含菌量为5.0义1055.OX1()6CfU/片。其抗力应符合在温度1602。C时，其D值为1.3L9min,存活时间23.9min,死亡时间WL9mi11o(2)检测方法：将枯草杆菌芽抱菌片分别装入灭菌中试管内(1片/管)。灭菌器与每层门把手对角线内，外角处放置2个含菌片的试管，试管帽置于试管旁，关好柜门，经一个灭菌周期后，待温度降至80。C时，加盖试管帽后取出试管。在无菌条件下，加入普通营养肉汤培养基(5ml管)，以37。C
14、培养48h,观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7do(3)结果判定：若每个指示菌片接种的肉汤管均澄清，判为灭菌合格，若指示菌片之一接种的肉汤管混浊，判为不合格,对难以判定的肉汤管，取0.Iml接种于营养琼脂平板，用灭菌L棒涂匀，放37。C培养48h,观察菌落形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长；若有指示菌生长，判为灭菌不合格；若无指示菌生长，判为灭菌合格。(4)注意事项：检测所用的指示菌片需经卫生部认可，并在有效期内使用。第四节医疗器械灭菌效果监测一、采样时间在灭菌处理后，存放有效期内采样。二、常规监测(1)检测方法：用无菌的方法将拟检缝合针、针头、手术刀片等小件医疗器械各5支，分别
15、投入5ml的无菌洗脱液中；注射器则取5副在5ml无菌肉汤中分别抽吸5次；手术钳、镶子等大的医疗器械在无菌操作下取2份以上用蘸有无菌洗脱液的棉拭子反复涂擦采样，并将棉拭子投入5l无菌洗脱液中。将采样管用力振打80次，用无菌吸管吸取InII待检样品放于灭菌平皿内，加入已熔化的4548。C的营养琼脂1518ml,边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置37。C温箱培养48h,计数菌落数。（2）结果判定：平板上无菌生长为灭菌合格。（3）注意事项：若消毒因子为化学消毒剂时，采样液中应加人相应中和剂。三、无菌检验L无菌检验前准备（1）洗脱液与培养基无菌性试验：无菌试验前3d,于需一厌氧培养基与真菌培养基内各接种InI
16、I洗脱液，分别置3035与2025培养72h,应无菌生长。（2）阳性对照管菌液制备：在试验前Id取金黄色葡萄球菌（26003）的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种1环至需一厌氧培养基内，在3035培养1618h备用。2 .无菌操作取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直接浸入6管需一厌氧培养管（其中一管作阳性对照）与4管真菌培养管，培养基用量为15ml管。取5副注射器，在5ml洗脱液中反复抽吸5次，洗下管内细菌，混合后接种需一厌氧菌培养管（共6管，其中1管作阳性对照）与真菌培养管（共4管）。接种量：Iml注射器为05ml,2ml注射器为lml,5-10ml注射器为2nd,2050ml注射器为5ml,
17、培养基用量：接种量为2nd以下为15ml管,接种量5ml为40ml管。手术钳、镜子等大件医疗器械取2件用蘸有无菌洗脱液的棉拭子反复涂抹采样，将棉拭子投人5ml无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需一厌氧培养管（共6管，其中1管作阳性对照）与真菌培养基（共4管）。接种量为InlI/管，培养基用量为15l管。3 .培养在待检样品的需一厌氧培养管中，接种预先准备的金黄色葡萄球菌阳性对照管液1：1000稀释Im1,将需一厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于3035。C培养5d,真菌培养管与阴性对照管于2025。C培养7d,培养期间逐日检查是否有菌生长，如加入供试品后培养基出现混浊或沉淀，经培养后不能从外观
18、上判断时，可取培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养4872h后，观察是否再现混浊或在外面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。4 .结果判定阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需一厌氧菌及真菌培养管内均为澄清或更显混浊但经证明并非有菌生长，判为灭菌合格；如需一厌氧菌及真菌培养管中任何1管显混浊并证实有菌生长,应重新取样,分别同法复试2次，除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。5 .注意事项（1）送检时间不得超过6h；若样品保存于04t,则不超过24h。（2）被采样本表面积VloOCnI?取
19、全部表面；被采样本表面积NlOOcni?,取100cm2。（3）若消毒因子为化学消毒剂，采样液中应加入相应中和剂。四、热原检查法（鲨试验）本法系利用赏试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。细菌内毒素国家标准品（RSE）系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。以细菌内毒素国际标准品为基准，经过协作标定，使其与国际标准品单位含义一致。RSE用于标定、复核、仲裁赏试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品（CSE）oCSE系经RSE为基准进行标定，确定其重量的相当效价。每毫微克（Ing）CSE的效价应为不小于2EU,不大于5
20、0EU,并具备均一性和稳定性的实验数据。CSE用于试验中空试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的阳性对照。L试验准备试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250。C干烤至少Ih或180。C干烤至少2h,也可用其他适宜的方法。试验所用器皿应确证无吸附细菌内毒素的作用。试验操作过程应防止微生物的污染。2 .赏试剂灵敏度复核根据尝试剂灵敏度的标示值（入），将RSE或CSE用细菌内毒素检查用水（与批号鲨试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用水，以下简称BET水）溶解，在旋涡混合器上混合15min,然后制备成2.0入、入、0.5人和0.25人等4个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在
21、旋涡混合器上混合30s,按“检查法”项下试验，每一浓度平行做4管，同时用BET水做4管阴性对照，如最大浓度（2.0入）4管为阳性，最低浓度（0.25）4管均为阴性，阴性对照4管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲨试剂灵敏度的测定值（）oc=lg-（2X/4）式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当入C在0.5入2.0入（包括0.5人和2.0入）时，方可用于细菌内毒素检查，并以人为该批空赏剂的灵敏度。每批新的鲨试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。鲨试剂灵敏度定义为在本检查法规定的条件下能检测出标准溶液或供试品溶液中
22、的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。3 .供试品干扰试验按“鲨试剂灵敏度复核”项下试验，用BET水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液分别制成合CSE2.0入、入、0.5人和0.25人等4种浓度的内毒素溶液。用BET水和供试品溶液或稀释液制成的每一浓度平行做4管，另取BET水和供试品溶液或稀释液各做4管阴性对照。如标准溶液最大浓度（2.0入）4管均为阳性，最低浓度（0.25入）4管均为阴性，两种阴性对照8管均为阴性时，按下式计算用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Er
23、）。Es=Ig1（EX/4）Ep=Ig（2X7/4）式中X/Xr分别为用BET水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（1g）。当ET在O.5E2.OE（包括0.5E,和2.OE,）时测认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需进行适当处理后重复试验，或使用更灵敏的鲨试剂，对供试品进行更大倍数稀释,是排除干扰因素的简单有效的方法。每个品种要求至少对三个批号的供试品进行干扰试验，若邕试剂的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重复进行干扰试验。供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD=L/入L为供试品的细菌内毒素限值，以EUl表示，当正文中的限值以EU/mg或EU/
24、U表示时,应乘以供试品溶液的浓度，再以所得值代入上式。检查法：取装有OJml赏试剂溶液的10mm75mm试管或0.Iml/支规格的赏试剂原安甑6支，其中2支加入0.Iml或0.2ml供试品溶液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支分别加入0.Iml或0.2ml用BET水将CSE制成的2.0人和0.25人浓度的标准内毒素溶液，一支加入0.Iml或0.2InIBET水作为阴性对照，1支加入0.Iml或0.2InI供试品阳性对照溶液（相当于用供试品溶液将CSE制成2.0入浓度的内毒素溶液）作为阳性对照管，将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口，垂直放入371。C水浴或适宜恒温器中，保温602min
25、o保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。4 .结果判断将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）;凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）o供试品2管均为（一）,应认为符合规定。当供试品的稀释倍数等于MVD时，如2管均为（+）,应认为不符合规定；如2管中1管为（+）,1管为（一）,按上述方法复试，其中供试品管增加为4管，供试品4管中如有1管为（+）,即认为不符合规定。若第一次试验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为（+）或2管中1管为（+）1管为（一）时，按同样方法复试和判定，复试时要求将其稀释至MVD。加入标准内
26、毒素溶液的2管中最大浓度（2.0）管应为（+）,最低浓度（0.25）管应为（一）,供试品阳性对照均应为（+）,阴性对照均应为（一）,否则试验无效。五、动物试验法1 .原理将一定剂量的供试品，在规定的时间内，观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。2 .供试家兔试验用的家兔应健康无伤；体重1.73.0kg,雌兔应无孕。预测体温前7d起，即应用同一饲料饲养。在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未经使用于热原检查的家兔，或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6。C的家兔；或供试品判定为不符合规定，但其组内家兔平均升温未达0.8。（2,且已休息两周以上
27、的家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前37d内预测体温，进行挑选。挑选试验的条件与检查供试品时相同；但不注射药液，每隔Ih测量体温1次，共测4次，4次体温均在38.039.6。（：的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4。C的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少休息2d方可供第2次检查用。用于热原检查后的家兔，如供试品判定为不符合规定,且其组内家兔平均升温达0.8。C或更高时，则组内全部家兔不再使用，每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。3 .试验前的准备在做热原检查前l2d,供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和
28、饲养室的温度相差不得大于5,实验室的温度应在1728t,在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3,应避免噪声干扰。家兔在试验前至少Ih开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。家兔体温应使用精密度为0.1。C的肛温计或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约为6cm,时间不得少于Imin,每隔3060min测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过02七，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38.039.6。（2的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过4 .试验用器材要求试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿,
29、应置烘箱中用250。C加热30min或用180。C加热2h,也可用其他适宜的方法除去热原。5 .检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15min内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38。C的供试品溶液，然后每隔Ih按前法测量其体温1次，共测3次，以3次体温中最高一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6。C或0.6。C以上，或3只家兔体温升高均低于0.6,但升高的总数达L4。C或L4。C以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。6 .结果判定在初试3只家兔体温升高均低于0.6C,并且3只家兔体温升高总数低于1.49，或在复试的5只家兔中，体温升高0.6。C或0
30、.6。C以上的兔数仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数为3.5。C或3.5。C以下，均认为供试品符合热原检查条例规定。在初试3只家兔中，体温升高0.6。C或0.6。C以上的家兔超过1只，或在复试的5只家兔中，体温升高0.6。C或0.6。C以上的兔数超过1只，或在初试、复合并8只家兔的体温升高总数超过3.5C,均认为供试品的热原检查不符合规定。第五节环氧乙烷(EO)灭菌效果监测一、仪器监测法按照GB18279-2000医疗器械，环氧乙烷灭菌附录C中C3.1的要求进行。二、化学监测法将化学指示卡放于常规测试包内，与待灭菌物品包放入柜室内，经一个灭菌周期后，取出指示卡，与标准色板进行比
31、较，当指示卡上的色块与标准色板上的色块颜色一致，则判定为消毒工艺符合要求，产品可以放行；否则判定为消毒工艺不符合要求，产品不予放行。三、生物监测法(1)指示菌株为枯草杆菌黑色变种芽抱(ATCC9372)菌片。含菌量为5.01055.0X10CfU/片。抗力要求为在环氧乙烷剂量为60030mgL,作用温度为542,相对湿度为60%10%的条件下，杀灭90%的该微生物的D值为2.65.8min,存活时间7.8min,死亡时间58minc(2)在消毒效果监测时菌量为5.0IO35.0X10*CfU/片。放置菌片的数量应足够多，通常情况下，柜室容积Vlm3时至少放置io片，5IOnI3每增加1113增
32、加1个菌片；大于IOnI3时每增加2113增加1个菌片。(3)检测方法：将菌片放入待灭菌物品包内，经一个灭菌周期后，取出指示菌片小纸袋，送实验室，在无菌操作条件下，取出指示菌片，投入含复方中和剂的0.5%葡萄糖肉汤培养基试管中，经361。C培养5d。同时设阳性对照管。(4)结果判定：经培养，阳性对照在24h内有菌生长，监测样品全部无菌生长，则判定为灭菌过程合格；若监测样品有一管有菌生长，则判定为灭菌过程不合格。(5)注意事项：所用化学指示卡或生物指示菌片，必须经卫生部批准，并在有效期内使用。每个灭菌物品包均应粘贴化学指示胶带，作为程序监测指示物。每月应做一次生物监测。移植物必须等生物监测结果为
33、阴性时方可使用。第六节内镜消毒效果监测一、采样时间在消毒后，使用前。二、采样方法用复方中和剂灌洗管腔内表面，收集洗液于无菌试管中,立即送检。三、检测方法与手表面消毒效果监测相同。四、结果判定细菌总数20cfu件，并未检出致病菌为合格。五、注意事项样品记录时以件记，而不是以ml或面积记。第七节手和皮肤黏膜消毒效果监测一、采样时间在消毒后立即采样。二、采样方法（1）手的采样：被检人五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面积约30c11）2）,并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入IOml含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即
34、送检。（2）皮肤黏膜采样：用5cmX5cm灭菌现格板，放在被检皮肤处;用没有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子1支,在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动棉拭子,剪去手接触部位后，将棉拭子投入IOml含相应中和剂的无菌洗脱液的试管内，立即送检。不规则的黏膜皮肤处可用棉拭子直接涂擦采样。三、检测方法（一）细菌总数检测将采样管用力振打80次，用无菌吸管吸取LOnlI待检样品接种于灭菌平皿内加入已熔化的4548。C的营养琼脂1518ml,边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置37。C温箱培养48h,计数菌落数。采样结果计算方法：细菌总数(cfucm2)二平板上菌落数X稀释倍数/采样面积(Cm2)(二)致病
35、菌检测检测原则：致病菌的检测依据污染情况进行相应指标的检测。将做细菌总菌后的剩余样本液，分别分作几份，1份作大肠菌群测定，其余根据不同致病菌加等量相应的双倍浓缩的增菌液，经36tl。C增菌培养24h后，转划分离鉴别培养基，再经361。C培养24h,进行菌种鉴定。1 .金黄色葡萄球菌检测(1)增菌、分离：取采样液1ml,接种于5dSCDLP液体培养基中，于361。C增菌24h。取1白金耳上述增菌液，在血平板上作划线分离，361。C培养24h。(2)观察菌落特征：在血琼脂平板上菌落形态为金黄色、圆形凸起、表面光滑、周围有溶血圈。(3)镜检：挑取典型菌落作涂片染色镜检，镜下为革兰阳性、成葡萄状排列的
36、球菌。(4)生化反应：取可疑菌落作触酶、葡萄糖发酵、血浆凝固酶、甘露醇发酵、新生霉素敏感试验，均为阳性者即为金黄色葡萄球菌。甘露醇发酵试验。取上述可疑菌落接种于甘露醇培养基，于361。C培养24h,发酵甘露醇产酸者为阳性。血浆凝固试验。a.玻片法：洁净玻片一端滴一滴灭菌生理盐水，另一端滴一滴血浆，用白金耳挑取菌落分别与生理盐水和血浆混匀，5min内观察有无固体颗粒状物,若血浆出现凝块，生理盐水均匀混浊为阳性，两者均混浊为阴性。b.试管法：吸取1：4新鲜血O.5ml,放在灭菌小试管中，再加入等量待检菌24h肉汤培养物，混匀后放入361孵箱中，同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌肉汤培养物作对照，每3
37、0s观察一次，6h内出现凝块者为阳性。2 .乙型溶血性链球菌检测(1)增菌、分离：取样品1ml,接种于1%葡萄糖肉汤，37。C增菌24h。取1白金耳增菌液在血平板上作划线分离，361培养24h。(2)观察菌落特征：菌落形态为灰白色、半透明或不透明、针尖状突起、表面光滑、边缘整齐、周围有B溶血圈。(3)镜检：挑取典型菌落作涂片染色镜检，镜下为革兰阳性、呈链状排列的球菌。(4)生化反应：取可疑菌落作如下生化试验，如触酶阴性、链激酶试验阳性、对杆菌肽敏感者，即为乙型溶血性链球菌。链激酶试验：吸取草酸钾血浆02ml(0.02g草酸钾加5ml人血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清)，加入08ml灭菌生理盐水混
38、匀后再加入待检菌24h肉汤培养物O.5ml和0.25%氯化钙0.251111,混匀，放入361水浴中，每2min观察一次(一般IOmin内可凝固)，待血浆凝固后继续观察并记录溶化的时间，如2h内不溶化，移入孵箱观察24h的结果，如全部溶化为阳性；24h仍不溶解者为阴性。杆菌肽敏感试验：将被检菌浓菌液涂于血平板上，用灭菌镜子取含菌0.04单位杆菌肽纸片放在平板表面上。同时以已知阳性菌株作对照，于361C1824h,有抑菌带者为阳性。3 .沙门菌检测参照GB4789.4(食品中沙门菌检测方法)。注意：采样用品用具须预先进行灭菌处理并进行检测，合格后才能用于采样；采样人员禁穿长裙、高跟鞋，禁戴手饰、
39、耳环，步履平缓，用力适度；样本记录要简捷、准确无误；样本在采回实验室后应充分振打、洗脱、混匀。四、结果判定1 .消毒洗手(1) I、II类区域工作人员：细菌总数W5cfuCnI2,并未检出致病菌为消毒合格。(2) In类区域工作人员：细菌总数WIOCfU/cm?,并未检出致病菌为消毒合格。(3) IV类区域工作人员：细菌总数W15cfuc11)2,并未检出致病菌为消毒合格。（4）母婴同室/婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员手上，不得检出沙门氏菌及其他致病菌。2 .皮肤黏膜参照手的卫生学标准执行。五、注意事项皮肤黏膜采样处，若表面不足5cm5cm可用相应面积的规格板采样。第八节消毒剂含量及消毒
40、效果监测一、常用消毒剂有效成分测定1 .有效氯含量测定配制2molL硫酸、10%碘化钾与0.5%淀粉等溶液。配制并标定0.lmolL硫代硫酸钠标准溶液。对液体含氯消毒剂，吸取0.Iml放容量瓶中，加蒸锵水至刻度，混匀。对固体含氯消毒剂，称取lg（精确至0.001g）,置研钵研磨后以蒸偏水溶解，转入100nII容量瓶中（溶水中无残渣者可免研磨）。称量杯及研钵需用蒸镭水洗3次，洗液全部转入容量瓶。向100ml碘量瓶中加2molL硫酸IOnI1,10%碘化钾溶液IOml和混匀的消毒剂稀释液IOmlo此时，溶液出现棕色。盖上盖并振摇混匀后加蒸储水满于碘量瓶盖缘，置暗处5min,打开盖，让盖缘蒸锵水流入
41、瓶内。用硫代硫酸钠标准溶液（装于25ml滴定管中）滴定游离碘；边滴边摇匀。待溶液呈淡黄色时加入0.5%淀粉溶液10滴，溶液立即变蓝色。继续滴定至蓝色消失，记录用去的硫代硫酸钠溶液总量。重复测3次，取3次平均值进行以下计算。因lmolL硫代硫酸钠标准溶液InII相当于0.03545g有效氯，故可按下式计算有效氯含量：有效氯含量=CxVXO.03545/WX100%C为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度（molL）,V为滴定用去硫代硫酸钠标准溶液毫升数，W为碘量瓶中所含消毒剂原药克数（液体消毒剂则为毫升数）2 .有效碘含量的测定配制0.5%淀粉溶液。备36%醋酸溶液。配制并标定0.lmolL硫代硫酸钠
42、标准溶液。向碘量瓶中精确加含碘消毒剂样液50ml及醋酸1滴。用0.lmolL硫代硫酸钠标准溶液滴定（通常用25ml滴定管，若预计有效碘浓度5%时用50ml滴定管），边滴边摇匀。待溶液呈淡黄色时加入0.5%淀粉溶液10滴（溶液立即变蓝色）,继续滴定至蓝色消失，记录用去的硫代硫酸钠溶液总量。重复测3次，取3次平均值进行以下计算。由于lmolL硫代硫酸钠标准溶液IInI相当于01269g有效碘,故可按下式计算有效碘含量：有效碘含量=CxVXO.1269/WXlO0%C为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度（mol/L）；V为滴定用去硫代硫酸钠标准溶液毫升数；W为碘量瓶中所含消毒剂原药克数（液体消毒剂则为毫
43、升数）】3 .戊二醛（Csh8O2）含量的测定配制6.5%三己醇胺溶液、0.04%澳酚蓝乙醇溶液与盐酸羟胺中性溶液（17.5g盐酸羟胺加蒸储水75ml溶解，并加异丙醇稀释至500ml,摇匀。加0.04%澳酚蓝乙醇溶液15ml,用6.5%三乙醇胺溶液滴定至溶液显蓝绿色）。配制并标定0.25molL硫酸标准溶液。取戊二醛消毒剂样液10.OnII（非消毒浓度的浓溶液需用50ml容量瓶稀释后取样）置25OnII碘量瓶中，精确加6.5%三乙醇胺溶液20.Oml与盐酸羟胺中性溶液0.25ml,摇匀。静量反应Ih后，用0.25molL硫酸标准溶液滴定。待溶液显蓝绿色，记录硫酸溶液用量。同时，以不含戊二醇的三
44、乙醇胺、盐酸羟胺中性溶液重复上述操作（空白对照）。重复测3次，取3次的平均值进行以下计算。由于InloI/L硫酸标准溶液InII相当于0.10OIg戊二醛，因此可按下式计算戊二醛含量：戊二醛含量（WV）=Cx（V2-v1）x.1001W100%【C为硫酸标准溶液物质的量浓度（mol/L）；V1与V2分别为样品与空白对照滴定中用去的硫酸标准溶液毫升数;W为戊二醛样品毫升数。】4 .过氧化氢（H2O2）浓度的测定配制2molL硫酸与10%硫酸镒等溶液。另外配制并标定0.02molL高镒酸钾标准溶液。取LOmI过氧化氢样液，于100nII容量瓶中用蒸储水稀释至刻度，混匀。取过氧化氢稀释液10.0ml
45、,置100nII碘量瓶中，加入2molL硫酸20ml与10%硫酸镒3滴，摇匀。用002molL高镒酸钾标准溶液（装于25ml滴定管中）滴定至溶液呈粉红色，记录高镒酸钾溶液用量。重复测3次，取3次平均值进行以下计算。因lmolL高镒酸钾标准溶液Iml相当于0.08505g过氧化氢，故可按下式计算过氧化氢含量：过氧化氢浓度（WV）=CxV0.08505W100%【C与V分别为高镒酸钾标准溶液物质的量浓度（molL）与滴定中用去的毫升数W为碘量瓶中所含过氧化氢样液毫升数】5 .过氧乙酸（C2H4O3）浓度的测定配制2molL硫酸、10%碘化钾、0.0hnolL高镒酸钾、10%硫酸镒、3%铝酸核与0.
46、5%淀粉。配制并标定0.05molL硫代硫酸钠标准溶液。取LOmI过氧乙酸样液，于100nII容量瓶中用蒸锵水稀释至刻度，混匀。向100ml碘量瓶中加2molL硫酸5ml,10%硫酸镒3滴,混匀的过氧乙酸稀释液5.0ml,摇匀并用001molL高镒酸钾溶液滴定至溶液呈粉红色。随即加10%碘化钾溶液IOml与3%钳酸锭3滴，摇匀并用0.05molL硫代硫酸钠标准溶液(装于25ml滴定管中)滴定至淡黄色。加入0.5%淀粉溶液3滴(溶液立即变蓝色)，继续用硫代硫酸钠滴定至蓝色消失，记录硫代硫酸钠标准溶液的总用量。重复测3次，取3次平均值进行以下计算。由于lmolL硫代硫酸钠ImI相当于0.03803
47、g过氧乙酸，故可按下式计算过氧乙酸含量：过氧乙酸浓度(WV)=CVO.03803W100%C与V分别为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度(molL)与滴定中用去的毫升数；W为碘量瓶中所含过氧乙酸样液毫升数。二、生物学检测方法及其评价标准1 .理化指标将消毒剂置202。C水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达到消毒或灭菌所需的最短时间(min)o2 .指示微生物(1)细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌(ATCC6538).大肠杆菌(8099或ATCC25922)。(2)细菌芽抱：枯草杆菌黑色变种芽抱(ATeC9732)。(3)真菌:白色念珠菌(ATCC10231)o(4)乙型肝炎表面抗原:纯化抗原(1.0mgml)o3 .检测方法(1)中和试验(见附录A)。(2)消毒剂定性消毒试验(见附录B)。(3)消毒剂定量消毒试验(见附录C)。(4)消毒剂杀菌能量试验(见附录D)。(5)乙型肝炎表面抗原(HBSAg)抗原性破坏试验(见附录E)。4 .消毒效果评价标准(1)对细菌和真菌的杀灭率299.9%；对HBsAg,将检测方法灵敏度10*倍或5X10*倍(载体试验)的HBSAg抗原性破坏，可判为
