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1、最新重症肌无力自身抗体实验室诊断专家共识（完整版）摘要重症肌无力（MG）是一种由自身抗体介导的神经-肌肉接头（NMJ）信号传递障碍的获得性自身免疫性疾病。自身抗体检测是国内外MG诊治指南推荐的关键辅助诊断指标。MG自身抗体的检测方法包括放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法和细胞免疫荧光法等，研究表明这些检测方法的特异度和敏感度存在客观差异，需要结合临床诊断需求来选择不同的检测方法学。为此，中华医学会神经病学分会神经免疫学组基于国内外MG自身抗体诊断指南、检测技术研究进展和充分征求学组专家意见的基础上形成重症肌无力自身抗体实验室诊断专家共识2022。本专家共识对MG自身抗体的检测方法学选择给出指导
2、性建议，进一步促进我国MG自身抗体诊断的规范化。重症肌无力（myastheniagravis,MG）是一种由自身抗体介导的神经-肌肉接头（neuromuscularjunction,NMJ）信号传递障碍的获得性自身免疫性疾病。临床上，MG患者呈现波动性的骨骼肌疲劳无力症状，而自身抗体检测是国内外MG临床诊断的重要辅助检查之一。目前,MG患者血清中发现的与神经-肌肉接头结构或骨骼肌胞质成分相关的自身抗体达10余种，包括乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor,AChR）抗体、肌肉特异性受体酪氨酸激酶（muscle-specificreceptortyrosinekinase,Mu
3、SK)抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low-densityIipoproteinreceptor-relatedprotein4,LRP4)抗体、连接素(titin)抗体、兰尼碱受体(RyR)抗体、聚集蛋白(agrin)抗体、Kv1.4抗体、CoIQ蛋白抗体、皮质蛋白(Cortactin)抗体、胶原(collagen)抗体和突触受体关联蛋白(rapsyn)抗体等10欧美国家如美国和英国等将AChR和MuSK抗体作为临床表现高度提示MG患者的首选诊断指标2,3,抗体阴性患者再进行其他辅助诊断如重复神经电刺激、单纤维肌电图等来进行MG诊断3,4,5,61我国MG诊断和治疗指南(2020版)提到
4、在患者具有典型MG临床特征(波动性肌无力)的基础上,满足药理学检查、电生理学特征以及血清抗AChR和MuSK等抗体检测中的任意1项即可作出MG诊断7o因此，抗AChR和MuSK抗体是国内外MG诊断的重要实验室检测指标。在实验室检测中，AChR和MUSK抗体具有多种检测方法学。本专家共识结合当前MG自身抗体诊断方法学研究进展，对MG自身抗体的检测方法学选择给出指导性建议。一、AChR和MUSK抗体检测方法学概况对于AChR抗体和MuSK抗体常见的检测方法包括放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimm
5、unosorbentassay,ELISA)和细胞免疫荧光法(cell-basedassay,CBA),既往研究表明这些检测方法的特异度和敏感度存在客观差异。方法学选择影响自身抗体检测结果的准确性。以MG最常见的AChR抗体检测为例，国内外研究结果表明：(1)AChR抗体的RIPA检测方法具有高特异度(99%)8o在敏感度方面,RIPA可以在约85%的全身型MG和50%的眼肌型MG患者血清中检测到AChR抗体9oRIPA的自身局限性包括放射性核素的使用、对眼肌型MG的AChR抗体检出率偏低和不能完全避免假阳性等101(2)AChR抗体的ELISA检测具有易操作的标准化试剂盒和可以抗体定量分析等
6、优势。在敏感度方面除个别研究外11,多数研究结果提示EUSA对检测MG患者AChR等抗体的敏感度低于RIPA或CBA5,12,13,14,15(3)AChR抗体的CBA检测方法有10余年的发展历程。与RIPA相比，CBA对AChR抗体具有相似的高特异度，同时CBA能显著提高RIPA血清阴性MG样本的AChR抗体检出率。例如，国内外研究表明CBA可以从21%56%的RIPAAChR阴性血清中检测到AChR抗体16,17,18,19o这种敏感度差异主要在于CBA提高了对低丰度或聚集性AChR抗体的检出率17z20o聚集性AChR抗体具有致病性和激活补体反应21,常见于眼肌型MG患者(68.8%),
7、也可存在于全身型MG患者(18.8%)220这种CBA阳性、RIPA阴性的聚集性AChR抗体越来越受到临床关注21,部分国家已将CBA作为低丰度或聚集性AChR检测的推荐方法写入MG诊断指南23oCBA的局限性在于标准化产品少，在国内外主要以临床实验室自建项目(laboratorydevelopedtest)提供诊断服务。MuSK抗体常见于部分AChR抗体阴性的MG患者(10%40%)20,24,25,少数情况下与AChR抗体或LRP4抗体共同存在13,26,270RIPA对MUSK抗体检测的特异度接近100%28,但在不同研究中RIPA对MuSK抗体的检出率存在较大差异(0-70%)29z3
8、0,31,32,33,34,35,因此RIPA对MuSK抗体检测的敏感度仍待进一步研究。MuSK抗体的ELISA检测具备商业化试剂盒，研究提示EUSA对MuSK抗体检测的敏感度略低于RIPA和CBA13,360CBA对MuSK抗体同样具有类似RIPA的高特异度，在敏感度方面也有一定程度改善。例如，一项包含633例经RIPA法检测AChR和MuSK抗体双阴性的MG样本研究结果显示,CBA对MG抗体双阴性患者的MuSK抗体的检出率提高了13%(83/633),同时CBA对RIPA检测结果为MuSK抗体阳性患者的检出率为100%(79/79),正常对照的MuSK抗体阳性率为1.9%(3/162)26
9、L另外，在包含11例和177例RIPAMUSK抗体阴性的小样本研究中，CBA对MuSK抗体的检出率比RIPA提高8%9%,同时特异度达100%37,381综上所述，RIPAxELISA和CBA对AChR和MuSK抗体的诊断效能存在差异，在对AChR和MUSK抗体进行定性和定量分析时，需要结合各方法的优势提高抗体诊断的准确性。本专家共识有关MG自身抗体实验室诊断推荐内容的推荐级别和证据级别划分见表1。表1本专家共识的推荐级别和证据级别划分Table1Classificationandrecommendedlevelsofevidenceinthisconsensus证据敢别伍癖粒秘I侬：准存Ia
10、质量一流的诊断性用交的茶统库述3一证的线搭西Ib渗新1询克：纳入对象适刍.且与金坛宸花行同步.三tt三II级：建议2a质量水平低于1!I三卸多JFfeS充基统咛述2b多新性格充：纳入对髭三国有制演性.与金齿准艺行同步.宫法比我mj:可近择3：纳入对AiSS迤胤竦SS金格室,IVjB:不准存4诊断性研充：纳入对t范雷不活刍S珠与”金欣tiS行面三.同步比蛟写韭濠新性行竞.包括专宗堂五立衰于生理.腐击：!HfiIF充的国涔二、MG自身抗体的实验室诊断推荐1 .临床表现高度提示MG的患者，在条件允许的情况下建议将AChR抗体和MuSK抗体检测作为首选辅助检测手段（I级推荐，1a级证据推荐说明：本推荐
11、意见参考了MG相关诊疗指南和专著2,3,4oAChR抗体和MuSK抗体具有高度的MG疾病诊断特异度，是国内外指南普遍认可的MG诊断指标之一。结合患者临床特征，血清AChR或MuSK抗体是MG诊断和鉴别诊断的重要参考依据。2 .MG患者血清AChR抗体或MuSK抗体的定性分析，建议：（1）在条件允许的情况下优先考虑高敏感度的CBA法；（2）若诊断方法为ELISA或RIPA,建议对检测结果为阴性的样本用CBA进一步验证，或结合临床表现和其他辅助诊断结果进行综合判定。AChR抗体或MuSK抗体的定量分析，建议用ELISA或RIPA进行抗体定量，用CBA进行抗体半定量。AChR抗体或MuSK抗体的定性
12、分析可用于MG的诊断和鉴别诊断等,定量分析可用于监测MG患者的疾病进展或疗效评估等（I级推荐，1b级证据I推荐说明本推荐内容参考国内外AChR和MUSK抗体诊断指南和方法学研究进展11,12,13,16,17,18,22,23,26,35,38,39,40oAChR和MuSK抗体的定性和定量分析策略兼顾了RIPA.ELISA和CBA的技术优势、时效性和临床可及性差异。需要注意的是本推荐内容不涉及RIPA、ELISA和CBA的产品来源和诊断机构选择,临床诊断时要根据检测结果的临床符合度自行选择具体的产品服务和检测机构。3 .LRP4抗体在MG中的致病性有待进一步研究RP4抗体也常出现于其他疾病如
13、肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis,ALS在MG自身抗体检测中，单纯LRP4抗体阳性应结合临床进行诊断，并注意与ALS的区分（I级推荐，1b级证据1推荐说明：LRP4抗体对MG疾病诊断的特异度偏低，不同研究结果的检出率也存在较大差异。例如有研究结果显示2%45%的AChR和MuSK抗体双阴性MG患者存在LRP4抗体41,42,43o同时，9.8%23.4%的ALS患者血清内也存在LRP4抗体44,4504 .除AChR抗体和MUSK抗体外,MG其他相关自身抗体的实验室诊断方法学选择证据不足，目前尚无明确的方法学推荐建议。5 .临床诊断为抗体阴性的MG患者，建
14、议间隔612个月或症状进展后进行MG相关抗体复测（II级推荐，2b级证据推荐说明:研究结果表明部分RlPA检测结果为AChR和MuSK抗体双阴性的MG患者，间隔12个月后重新采样的血清中存在抗体转阳的情况46o需要注意的是，ELISA和CBA检测缺乏相关的研究,尚无证据提示ELISA和CBA检测最初抗体为阴性的患者何时复查可能发现阳性，需要进一步的研究证据支持。三、影响RIPA、ELlSA和CBA检测准确性的共性因素分析在MG自身抗体实验室诊断中,一些常见的共性因素可能影响RIPAxELISA和CBA检测结果的准确性，包括：（1）各检测方法抗原的选择。抗原的含量、序列和空间构象等影响血清抗体的
15、结合和检出率，因此检测时要考虑抗原抗体最适比例（等价带抗原的抗体识别区和抗原表位特征等。例如，CBA通过表达聚集性AChR抗原能够提高RIPA抗体阴性血清中AChR抗体的检出率。（2）检测限（limitOfdetection）的限制。任何检测方法对血清中抗体含量的敏感度都是有限的，当血清中目标抗体的浓度接近或低于检测限时会存在无法准确判读的临界结果，造成假阴性或假阳性，这些情况需要结合临床或用其他辅助检测进行进一步诊断确认。（3）室间检测条件的差异。如前所述各检测机构间的检测设备、试剂选择、检测环境、操作规范和人员专业化程度等因素差异会影响检测结果的准确性或室间一致性。（4）血清抗体的非特异交
16、叉反应。临床上，待检测血清成分复杂且个体差异大。血清中大量的非目标抗体具有与靶抗原或检测基质非特异交叉反应结合的可能性，当检测方法无法区分这种非特异性结合时（如ELISAxRIPA或单荧光CBA）,会造成检测结果的假阳性。一些措施被用于改善检测结果的特异度。例如，适当提高检测方法（如ELlSA、RIPA或CBA）的判读界值来提升检测结果的特异度，但相应地会降低抗体的检出率。止匕外，采用含内参的双荧光CBA替代单荧光CBA,从而实现对靶抗原表达细胞和非表达细胞的区分，在检测时可以分辨血清测的双荧光判读示意图（本图为原创图片如图所示，体外培养的293细胞转染人完整的AChR和突触受体关联蛋白（ra
17、psyn）z并采用绿色荧光蛋白（GFP）作为AChR抗原阳性细胞的标记。当AChR抗原阳性细胞与待检血清进行孵育后,血清内的AChRIgG抗体特异结合到293细胞表达的AChR抗原上。再通过孵育荧光或辣根标记抗人IgG二抗，直接通过荧光显微镜或进一步利用酪胺信号放大技术（TSA）把结合到细胞上的AChR抗体转化为红色荧光信号，实现对血清内AChRIgG的定性和半定量判读。血清AChR抗体弱阳性放射免疫沉淀法（RIPA）阴性且临床症状符合MG患者的代表性图片（ACX红色信号与AChR-GFP绿色信号完全重合提示血清内存在和AChR抗原特异性结合的抗体。血清AChR抗体假阳性代表性图片（DFI红色
18、信号与AChR-GFP绿色信号不完全重合，提示患者血清内没有和AChR抗原特异性结合的抗体，红色信号为非特异性信号。血清AChR抗体阳，性对照（GI%血清AChR抗体阴性对照（JL）Figure1Schematicdiagramofserumacetylcholinereceptorantibodyinmyastheniagravisinterpretedbycell-basedassay临床上存在各检测方法检测AChR和MuSK抗体均为阴性的MG患者。AChR和MuSK抗体阴性的主要原因包括：（1）MG患者体液内AChR或MuSK抗体含量过低，无法达到当前检测方法的检测下限；（2）采样时间差
19、异,MG患者病程及治疗的不同阶段体内AChR或MuSK抗体含量存在有无和高低的波动；（3）其他MG致病性抗体的存在。对于AChR和MuSK抗体双阴性的MG患者，抗体复测的时间间隔和作用有待更多的研究明确。需要注意的是，MG的临床诊断不能完全依赖自身抗体的检测结果。一方面，部分抗体阴性患者的临床表现符合MG的疾病特征，无法排除患MG的可能性。另一方面,AChR抗体阳性并不一定是MG患者。一些研究表明，少数非MG人群（1.44%）以及其他自身免疫病患者（如6.25%的视神经脊髓炎患者）的血清中存在AChR抗体47,48o止匕外,受抗体检测机构质控和临界值判读标准差异的影响，抗体检测结果不是绝对准确的,存在假阳性和假阴性的可能性。因此，MG临床诊断除了参考自身抗体指标，一定要结合患者的临床表现和其他非抗体诊断指标和随访等进行综合判定。近年来,国内外有关AChR和MuSK抗体的诊断方法学研究为本专家共识提供了参考依据。除了AChR和MuSK抗体，目前MG其他自身抗体的实验室诊断方法学比对研究较少，推荐证据不足，仍有待于进一步研究。
