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1、血流导向装置内皮化过程的动物研究进展2023摘要:血流导向装置(FD)为颅内动脉瘤的治疗带来了革命性的改变,其致密的网丝不仅有利于支架表面的内皮化,亦可实现闭塞动脉瘤。内皮化是指内皮细胞发育的过程,近年来FD置入治疗颅内动脉瘤的内皮化机制研究受到关注,该文基于相关动物研究从FD置入后内皮化的发展过程、时间节点、细胞来源及影响因素方面进行综述和展望,以期为其临床应用提供指导。血流导向装置(fl。Wdiverter,FD)是基于血流动力学研发的一款动脉瘤闭塞装置,与传统颅内支架相比,FD具有更密的网丝特性,可对动脉瘤瘤颈处的血流产生更强的阻力。FD置入后血流的变化促进了瘤囊内进行性血栓形成,随着瘤
2、颈处新生内皮逐渐覆盖FD表面,最终可实现动脉瘤闭塞1。研究表明,瘤囊内稳定的血栓形成是动脉瘤瘤颈处闭塞、愈合过程中的初始步骤,瘤颈处完全的内皮化可能在FD置入后动脉瘤闭塞过程中起着更为重要的作用2-3。内皮化是指支架置入后内皮细胞的发育过程,是在一氧化氮和前列腺素等因子作用下调节血管张力并防止血栓形成的物理屏障4-5。FD置入后内皮化可以分为内膜增生和再内皮化两个过程,根据部位可分为FD与载瘤动脉接触区域的内皮化和FD覆盖的动脉瘤瘤颈处的内皮化。如何在更短的时间内实现动脉瘤瘤颈处完全的内皮化对于提高动脉瘤闭塞率和降低卒中风险起着至关重要的作用6-7。在FD应用于人体研究之前FD相关动物研究为F
3、D的作用机制以及潜在风险提供了重要信息8。本文基于动物研究,从FD置入后内皮化的发展过程、时间节点、细胞来源和影响因素4方面进行综述。1内皮化的发展过程FD置入血管后在体内主要经历3个阶段:血管机械性损伤、FD表面内膜增生、血管重塑与愈合9。首先,在血管内置入FD后,血管壁的正常结构被破坏,在FD和血管的接触部位形成分散的炎性细胞簇,随后,未分化细胞在FD的随机部位黏附进而内膜增生3。Matsuda等10利用光学相干断层扫描(OPtiCalcoherencetomography,C)CT)对FD置入后的猪动脉瘤模型的新生内膜发育情况进行观察,结果显示,内膜增生始于FD与血管壁接触的随机部位。一
4、项研究在兔动脉瘤模型中置入FD,术后第7天通过组织学观察到分化的平滑肌细胞在载瘤动脉接触区和瘤颈处发生渐进性黏附,进而形成初始的新生内膜层;在第8周,瘤颈处平滑肌细胞上又覆盖了内皮细胞特异性抗体CD31阳性的内皮细胞,表明内皮细胞的生长需要平滑肌细胞作为基底并且可能和血管壁的解剖结构有关。LiU等11在体外动脉瘤样血管模拟物中观察FD置入后的细胞反应,结果显示,FD置入后7d,内皮细胞出现在FD与载瘤动脉接触的部位,置入后14d在瘤颈处的外围区域出现内皮细胞,置入后28d瘤颈处中心区域出现内皮细胞;而在瘤颈处的内皮化过程中,观察到内皮细胞特异性抗体CD31阳性的内皮细胞在置入后14d首先分布在
5、瘤颈处外围区域的网丝交叉处,FD置入后28d内皮细胞才逐渐出现在FD的孔隙处,说明FD的网丝可为瘤颈处内皮细胞的生长提供支撑,且FD网丝上的内皮化先于孔隙处的内皮化。此外,另一项在22只兔动脉瘤模型中进行血流重定向腔内装置的动物研究,组织学分析发现,瘤颈处FD表面的新生内皮是连续的,并与载瘤动脉段FD表面覆盖的内皮细胞相连口2。动脉瘤内血栓形成和瘤颈处的内皮化均为FD治疗动脉瘤的主要机制2,二者之间也相互联系。KadirVel等在20只兔动脉瘤模型中研究PiPeIine血流导向装置(PiPeIineembolizationdevice,PED)治疗卢页内动脉瘤的机制,结果显示,FD置入后的动脉
6、瘤闭塞主要依靠瘤颈处的组织生长,即瘤颈处内皮化,其作用大于瘤囊内血栓形成。SZikora等13对1例行PED置入治疗的梭形动脉瘤患者进行了尸检和组织病理学分析,该患者在术后13个月死于FD内突然血栓形成后发生的严重大脑中动脉梗死,其术后12个月DSA显示巨大梭形动脉瘤完全闭塞,但在术后13个月的尸检中,未在瘤囊内发现任何机化的血栓提示在动脉瘤的愈合过程中,瘤颈处内皮化可能发挥更为重要的作用。Lee等14对犬动脉瘤的组织病理学研究显示,FD表面的内膜增生在FD的网丝上进行,与动脉瘤内的血栓形成无关。FD置入术后动脉瘤的闭塞主要通过动脉瘤内血栓形成和瘤颈处的内皮化完成口L由于动物研究中的样本量较小
7、,且不同研究中的动物种类不同,动脉瘤的大小、形态和位置均存在差异,因此可能导致各项动物研究对于瘤囊内血栓形成和瘤颈处的内皮化的研究结果不同。2内皮化的时间节点关于FD置入后内皮化过程中的时间节点,不同动物模型中的临床前研究得出了不同的结论。KadirVel等关于FD置入后动脉瘤愈合的细胞机制研究显示,FD置入后第1天便可发现FD与载瘤动脉接触处内皮细胞的完全剥脱以及炎性细胞的黏附;第3天,平滑肌细胞开始在FD的网丝上生长,并与载瘤动脉直接接触;第7天,与载瘤动脉的血管壁相接触的FD表面完全内皮化,而瘤颈处的FD区域则散在分布着由炎性细胞组成的分散组织;4周时,瘤颈处的FD被薄的半透明组织覆盖,
8、内皮细胞组成的片状组织分散覆盖了与载瘤动脉相接触的FD,而缺少内皮细胞的区域被平滑肌细胞覆盖;8周时,完全闭塞的动脉瘤瘤颈处被半透明组织覆盖,与载瘤动脉相接触的FD表面被内皮细胞和平滑肌细胞组成的白色新生内膜覆盖,而未完全闭塞的动脉瘤瘤颈处区域的FD上则被不连续的组织所附着,位于瘤颈处中间区域的FD表面上的组织主要由单核细胞和巨噬细胞组成提示瘤颈处的中间区域可能仍存在着炎性环境,而在瘤颈处的周围区域则发现了与载瘤动脉相连接的内皮细胞。总之,该项研究表明,在完全闭塞的动脉瘤中,载瘤动脉段FD在置入后1周表面完全内皮化,而瘤颈处FD在置入8周时完全内皮化,瘤颈内皮化不完全可能导致了动脉瘤的不完全闭
9、塞。另一项在4只猪动脉瘤模型中利用OCT分析FD置入后新生内膜发育的研究则显示,在FD置入后第7天内膜开始增生10。不同临床前动物研究中内皮化时间节点的不同可能与随访时间的设置、OCT成像和组织病理学之间的差异有关。此外,对动物动脉瘤模型进行血管内治疗的研究,采用OCT等进行观察,存在时间延迟,无法即时反应结果的问题,也可能会对实验结论产生影响。3内皮细胞的来源FD置入后在其表面观察到的内皮细胞的来源目前仍未明确,目前研究认为来源于邻近载瘤动脉内皮细胞的旁分泌以及循环系统中骨髓来源内皮祖细胞的分化,主要通过免疫组化检测CD34抗体和内皮细胞特异性抗体的表达以及未分化内皮祖细胞和成熟内皮细胞表达
10、的信号分子来寻找内皮细胞的来源2。冠状动脉系统的研究显示,支架置入后的内皮化产生于周围的内皮细胞迁移以及在血管生成因子的作用下内皮细胞的黏附15。KadirVel等在兔动脉瘤模型中置入PED,对PED网丝进行免疫荧光染色,但未发现CD34抗体阳性的细胞提示观察到的内皮细胞并非源自骨髓来源内皮祖细胞。但在兔动脉瘤中置入FD后,从兔骨髓中分离自体内皮祖细胞进行体外扩增,采用赫斯特荧光染料33342和细胞内荧光染料竣基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯进行双重标记后移植到兔体内,在内皮下间隙和FD网丝周围发现了双重标记阳性内皮祖细胞,术后4周,实验组瘤颈处新生内膜每个高倍镜视野观察到的细胞个数与未输入骨髓来
11、源的的内皮祖细胞的对照组差异无统计学意义（33个比29个,P0.05提示骨髓来源的内皮祖细胞参与FD置入后的内皮化16。一项在9个体外模型中进行的FD临床前研究中,通过免疫荧光染色后的共聚焦显微镜观察到了FD上的内皮细胞与载瘤动脉中的内皮细胞直接相连提示FD表面的内皮细胞可能直接来自于邻近的载瘤动脉口引。在22只兔动脉瘤模型中进行的血流重定向腔内装置临床前动物研究中,研究者也通过观察组织病理学切片发现,内皮细胞覆盖了瘤颈处的血流重定向腔内装置,且与载瘤动脉中的内皮细胞相连口2。各研究中FD内皮化来源存在差异的可能原因如下。首先,在未观察到CD34抗体阳性的内皮祖细胞的实验中,可能使用了过量的阿
12、司匹林。一项实验在16只兔动脉瘤模型中应用扫描电子显微镜和免疫标记技术,探究内皮生长模式与FD的关系,观察到CD34抗体阳性的内皮祖细胞在术后第10、20、30、60天均同时出现在包括动脉瘤瘤颈中心在内的整个FD上,该项研究中所有兔模型从术前5d至随访时,均每日口服一次阿司匹林(1mg/kg)和氯毗格雷(10mg/kg)17。而另一项研究中,20只兔动脉瘤模型从术前2d至随访时,均每日口服一次阿司匹林(10mg/kg)和氯毗格雷(10mg/kg),通过1、3、7d以及第4和第8周的组织学随访发现,FD内皮化中的细胞仅来自载瘤动脉3,两项研究中所用的阿司匹林剂量不同。在一项临床研究中,10例2型
13、糖尿病患者在接受阿司匹林(300mg/d)治疗6周后,通过流式细胞术观察到其循环系统中CD34抗体阳性和激酶插入结构域受体抗体阳性细胞较接受阿司匹林治疗之前数量减少了47%18o内皮祖细胞的动员和分化能力可能受到阿司匹林的限制,但是需要更多的研究验证这一假设。其次,骨髓来源的内皮祖细胞在参与FD置入后内膜增生和再内皮化时可能发生了转分化,而CD34抗体阳性只是转分化进程中相对早期的标志物。Li等16将兔骨髓中分离的自体内皮祖细胞分为两组,分别在FD置入后第1天（第1组）和第15天（第2组）移植到10只兔动脉瘤模型中（各5只）,第1组的5只在移植后2周（即FD置入后2周）进行随访,有3只检测追踪
14、到了赫斯特荧光染料33342和细胞内荧光染料竣基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯双重标记的自体移植骨髓源性内皮祖细胞,主要分布在内皮下间隙和FD的金属丝的周围;透射电子显微镜显示,增生的内膜主要由巨噬细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成,且细胞排列混乱;免疫化学结果显示,平滑肌细胞位于内皮下间隙,巨噬细胞位于FD金属丝周围,较少观察到内皮细胞。第2组的5只在移植后2周（即FD置入后4周）进行随访,结果显示,有2只检测追踪到了赫斯特荧光染料33342和细胞内荧光染料竣基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯双重标记的自体移植骨髓源性内皮祖细胞,主要分布在内膜表面;透射电子显微镜结果显示,增生的内膜主要由内皮细胞、平滑
15、肌细胞和巨噬细胞组成;免疫化学结果显示,内皮细胞分布在内膜表面。以上结果说明骨髓来源的内皮祖细胞可能根据内膜增生的阶段分化为不同的细胞类型。此外,内皮祖细胞分化后,标记的荧光随着时间逐渐减弱,也可进一步降低内皮祖细胞的追踪敏感度19o4内皮化的影响因素目前,对于影响FD置入术后内皮化的因素尚无系统归纳,作者归纳总结FD置入术后内皮化的影响因素如下。4.1抗血小板聚集药物与药物基因组学FD临床前研究的动物模型,一般在FD置入前23d和FD置入后1个月内使用抗血小板聚集药物12。MatSUda等20在一项研究中将FD置入10只猪的正常颈动脉并分为两组,一组（6只）接受双联抗血小板聚集药物治疗（du
16、alantiplatelettherapy,DAPT）另一组（4只）接受单联抗血小板聚集药物治疗（SingIeantiplatelettherapy,SAPT）,于FD置入后第7、14、21天进行DSA和OCT随访,结果显示,FD置入后第7天与DAPT组（14枚FD,无血栓堵塞）相比,SAPT组中置入的12枚FD中有8枚被血栓堵塞,虽然在血管成形术后均成功恢复通畅,但是这项研究仍决定在第8天开始将SAPT均修改为DAPToFD置入术后第14.21天的OCT和DSA随访中,均未发现FD内进一步的血栓形成才是示FD置入后采用DAPT是必要的。一项研究纳入20只兔囊状动脉瘤模型,FD置入术后,将重组
17、人基质细胞衍生因子1（recombinanthumanstromalcell-derivedfactor10rhSDF-10）按照50g/（kgd）连续7d静脉注射至10只兔动脉瘤模型中,分别在FD置入术后第2周和第4周对动脉瘤瘤颈处进行扫描电子显微镜的观察,发现rhSDF-1c（9个动脉瘤）瘤颈处的每高倍镜视野下内皮细胞平均数量均多于对照组（10个动脉瘤,注射相同剂量的等渗盐水）,差异有统计学意义（2周时与5比13个,P0.01;4周时:104比60个,P0.01）提示静脉注射rhSDF-1何以加速瘤颈处的再内皮化21。因此FD置入后应用rhSDF-IO（可能是促进FD表面内膜增生和再内皮化
18、的可行策略。普乐沙福（AMD3100）是SDF-Ie（/趋化因子受体4的特异性拮抗剂,还可动员造血干细胞进入血液22。一项研究探索普乐沙福在FD治疗兔囊状动脉瘤（20只）后内膜增生中的作用,FD置入后普乐沙福组（4只）立即皮下注射普乐沙福5mg（kgd）,而对照组（4只）立即注射等渗盐水,直至FD置入后2、4周,将两组囊状动脉瘤瘤颈处新生内膜制成切片并染色观察,发现两组新生内膜均呈圆形且4周时厚度均较2周时增加,但普乐沙福组的新生内膜较对照组增厚明显（均P0.01）,提示普乐沙福可促进FD置入后FD表面内膜增生和再内皮化23。4.2贴壁性FD与载瘤动脉的贴壁性是影响FD置入后内皮化的一个关键因
19、素。一项研究将PED置入41只患有动脉瘤的兔体内,分别在术后30（18只）、90（11只）、180d（12只）进行DSA和组织学随访,根据随访时组织学观察的结果分为贴壁性良好（FD完全贴合在载瘤动脉上及动脉瘤瘤颈的整个平面）和贴壁性较差（FD无法完全贴合在载瘤动脉上及动脉瘤瘤颈的整个平面）,根据随访时DSA结果将动脉瘤分为完全闭塞（动脉瘤完全不显影）和不完全闭塞（动脉瘤有显影）,共38只兔子均完成了DSA和组织学评估,结果显示,完全闭塞的25个动脉瘤中有21个动脉瘤FD贴壁性良好,4个动脉瘤FD贴壁性较差;不完全闭塞的13个动脉瘤中有3个动脉瘤FD贴壁性良好,10个动脉瘤FD贴壁性较差,贴壁性
20、与动脉瘤的闭塞程度显著相关（P0.01提示良好的贴壁性与FD置入后动脉瘤的闭塞密切相关24。FD与载瘤动脉之间良好的贴壁性,有利于动脉瘤瘤颈处的内皮化,达到治愈动脉瘤的目的。4.3FD涂层和材料近年来,表面进行修饰的FD逐渐受到重视7。MedtroniC公司将其FD产品PipelineFlex用磷酸胆碱进行表面修饰以减少FD表面的血栓形成,研发了产品PipelineShieId25。一项研究在10只猪模型中探究FD置入正常颈动脉后内膜增生和血栓形成情况,其中6只采用DAPT治疗(共置入7枚PiPelineFlex、7枚PiPelineShield),并于FD置入术后第7、14、21天进行DSA
21、和OCT随访,结果显示,行DAPT后,与PipelineFlex比较,PipelineShield在置入术后7、14、21d的内膜覆盖率(OCT图像中被内膜覆盖的FD金属丝数量/FD金属丝总数)均更高(P0.05),而置入术后7d内总血栓形成率(先判断OCT图像中每1毫米管腔横截面中是否存在血栓,再计算总管腔长度中含有血栓长度的百分比)较低(19.4139.63)%tt(39.0248.90)%zP0.OlL提示在DAPT条件下,相比于PipelineFIexrPipeIineShield能够加速FD置入后表面的内皮化并减少FD内的血栓形成20。Cortese等26在18只兔动脉瘤模型中发现,
22、FD置入后4周时扫描电子显微镜和多光子显微镜观察到CD31模拟涂层FD组(3只)瘤颈处内膜厚度高于无涂层FD组3只;(42.925.0)m比(25.512.O)mzP=0.01”提示CD31模拟涂层FD可以改善FD置入后动脉瘤瘤颈处的内皮化,进而可促进动脉瘤愈合。目前已经上市的FD支架主要由银钛合金、钻铭合金、粕等材料组成7。Kallmes等27将由粕和不锈钢制作的第T弋PED置入17个弹性蛋白酶法诱导的兔动脉瘤后,分别于手术后1、3、6个月进行扫描电子显微镜和组织学随访,结果显示,瘤颈口处被新生内膜覆盖的比例分别为3/6、2/4、4/6oPipelineShield由48或64根钻铝合金丝组
23、成每根金属丝的内侧都有粕,其临床前的动物研究中将PipelineShield（60枚）和PipelineFlex（56枚）分别置入29只兔的右锁骨下动脉和降主动脉,置入后90d采用扫描电子显微镜观察FD中未被内膜覆盖的部分,计算其面积与置入血管总的表面积的百分比,结果显示,PipelineShield的未被内膜覆盖率低于PipelineFlex（O.861.01）%比（3.643.22）%,P0.05,提示PipelineShield的内皮化程度较高28。血流重定向腔内装置采用独特的双层设计,由具有48条银钛合金编织丝的低孔隙率内部结构和具有16条镇钛合金编织丝的高孔隙率外部支架组成,其临床前
24、研究显示,86.4%（1922）的动脉瘤内膜增生和内皮覆盖明显（新生内膜和内皮所覆盖的FD管腔周长的百分比大于75%）12o由聚左旋乳酸纤维等新型可生物降解材料制作的FD的临床前研究在18只兔动脉瘤中进行,分别在FD置入后1（5只）、3（5只）、6个月（5只）和1年（3只）采用免疫组织化学方法随访到4、4、3、2只兔动脉瘤模型,其随访时内皮化程度（内皮细胞覆盖的FD管腔周长的百分比）中位数分别为63.0%（43.5%,78.3%）.61.1%（55.8%,78.3%）、59.7%（45.4%z67.7%）和53.8%（22.9%z69.3%）29。在人体血液生理流动条件下的体外模型中,分别置入
25、PipelineFlex.PipelineShield及血流重定向腔内装置,采用凝血酶-抗凝血酶复合物和-血小板球蛋白水平评估不同装置的血栓形成性,结果显示,PipelineShield的血栓形成性低于PipelineFlex和血流重定向腔内装置凝血酶-抗凝血酶复合物:(0.40.3)g/ml(13.94.4)gmk(30.32.9)g/ml,P0.05;B-血小板球蛋白:(16.23.5)Il比(92.841.0)IUL(148.045.0)IU/l,P0.0525.不同材料的血栓形成性可能会影响FD的内皮化但目前尚无研究直接比较不同材料FD的内皮化的差异。4.4血流动力学FD置入后,瘤颈处
26、血流动力学发生改变,对瘤颈口处的内皮化具有重要作用Akimot。等30在牛主动脉和人脐静脉内皮细胞中掺入3H胸昔发现,内皮细胞暴露于30达因/cm2的剪应力后,内皮细胞的DNA合成能力下降,4h后达到静态对照水平的40.4%;而且剪应力(30达因/cm2)增加了内皮细胞中p21mRNA的数量,在开始暴露于剪应力后4h达到最高水平,与静态对照相比增加了2.3倍提示高剪应力可通过上调p21蛋白诱导细胞周期停滞,进而抑制内皮细胞的DNA合成,最终抑制血管内皮细胞增殖,但对于FD置入后血流动力学变化与内皮化之间的联系尚需进一步研究证实。4.5金属覆盖率FD的金属覆盖率为置入FD的血管被FD网丝所覆盖面
27、积的百分比,目前临床中常用FD的金属覆盖率为30%55%7,31。MatSUda等10在4只猪模型中置入PipelineFlex（6枚）、PiPeIineShield（6枚）、SolitaireAB支架（4枚）,在术后21d采用OCT观察新生内膜比率（平均FD横截面面积-平均血管腔面积即血管腔轮廓的面积）/平均FD横截面面积,采用组织学分析动脉瘤囊内成分,结果显示,术后第21天,PipelineFlex组和PipelineShield组的新生内膜比率均明显高于SOlitaireAB支架组分别为（0.1600.110）0.2100.096）.（0.0640.120）;均P0.05,可能原因为Pi
28、pelineShield和PipelineFlex的金属覆盖率均大于SolitaireAB支架,其金属丝为内皮细胞的黏附和生长提供了更多的表面积。5总结与展望FD置入后内皮化可以分为内膜增生和再内皮化两个过程。内皮化在FD表面的内膜增生后,呈现从载瘤动脉与FD的接触部位向动脉瘤的瘤颈处、从FD的网丝交叉处向FD的孔隙处、从FD瘤颈处的周围区域向FD瘤颈处的中心区域的发展过程。FD在发生内皮化时,其表面的内皮细胞可能来源于邻近载瘤动脉中内皮细胞的旁分泌和循环系统中骨髓来源的内皮祖细胞。除此之外,内皮化还受到抗血小板聚集药物及FD贴壁性、金属覆盖率等多种因素影响。在临床上应用FD时所遇到的焦点问题如FD置入术后的随访时间32、FD置入术后抗血小板聚集药物的应用方案33-34、支架内狭窄的治疗方法35-36等可以在FD内皮化的动物研究中获得启发;FD内皮化的动物研究中的最新发现也可以指导FD的进一步开发与应用。但是由于动物实验的样本量往往较小,且动物模型与人体的颅内动脉瘤在动脉瘤尺寸、血液环境、血流动力学、载瘤动脉直径等方面均存在差异,因此,对于FD置入后的内皮化机制仍需进一步研究。
