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1、ICS 71.100. 40CCS Y40QB中华人民共和国轻工行业标准QB/T2738-2023代替QB/T2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法Evaluatingmethodsforantibacterialandbacteriostaticefficacyofdailychemicalproducts2023-04-21 发布2023-11-01实施中华人民共和国工业和信息化部发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14检验抗菌、抑菌日化产品效果的实验室及无菌操作的基本要求25样品采集26日化产品抗菌、抑菌效果评价原则27日化产品抗菌、抑菌效果检验方法38日化产
2、品抗菌、抑菌效果稳定性检验方法21附录A（资料性）统计检验示例22参考文献25本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替QB/T2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法，与QB/T2738-2012相比，除编辑性改动外，主要技术变化如下：a）更改了检验用指示微生物（见6.3,2012年版的6.3）;b）增加了菌落计数规定（见6.6）;c） 更改了日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类（见7.1,2012年版的7.1）;d） 更改了试验用设备、试剂（见7.2.1、7.2.2,2012年版的7.2.1、7.2.2）;e） 更改了菌
3、液制备（见7.2.2.5,2012年版的7.2.2f）;f） 更改了中和剂鉴定试验方法（见7.2.3,2012年版的7.2.3）;g） 删除了抗抑菌结果保留整数的规定（见7.2,5、7.3.4）;h） 增加了抑菌效果检验方法（悬液定量法）特殊情况下的菌落计数（见7.3.3.6）;i） 更改了抑菌效果评价表述（见7.3.6,2012年版的7.3.6）;j）更改了抑菌环法试验菌悬液浓度（见7.5.4.3,2012年版的7.5.4c）;k）更改了部分培养温度及培养时间见7.2.2.5、7.2.4.6、7.3.3,6、7.4.4.47.4.5.6、7.5.4.k7.5.4.4、7.6.5.3,2012
4、版的7.2.2f）、7.2.4f）、7.3.3f）、7.4.4d）、7.4.5g）、7.5.4a）、7.5.4d）、7.6.5.C）；1）增加了持续抑菌效果检验方法（体外模拟法，适用于皂类产品）、抗菌型日化产品的杀菌效果检验方法（载体浸泡定量法）及抑菌型日化产品的杀菌效果检验方法（载体浸泡定量法）（见7.7、7,8、7.9）;m）更改了日化产品抗菌、抑菌效果稳定性检验方法及评价标准（见第8章，2012年版的第8章）；n）删除了对于抗菌剂含量测定等内容（见2012年版的附录A）;0）增加了统计检验示例（见附录A）。本文件由中国轻工业联合会提出。本文件由全国表面活性剂和洗涤用品标准化技术委员会（S
5、AC/TC272）归口。本文件起草单位：中国日用化学研究院有限公司、上海开米科技有限公司、广东省微生物分析检测中心、北京宝洁技术有限公司、蓝月亮（中国）有限公司、山东泰和水处理科技股份有限公司、完美（广东）日用品有限公司、广州超威生物科技有限公司、广东利诚检测技术有限公司、中轻检验认证（太原）有限公司。本文件主要起草人：王杰、于文、谢小保、黄亮、张靖峰、雷帅、郁晓艺、刘亚军、钟美媛、姚晨之。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：2005年首次发布为QB/T2738-2005,2012年第一次修订；本次为第二次修订。日化产品抗菌抑菌效果的评价方法1范围本文件描述了具有特殊卫生功能的日化产品抗
6、菌、抑菌效果的检测方法，规定了评价标准。本文件适用于常见洗涤用品的抗菌、抑菌性能的测试和评价，其他日化产品抗菌、抑菌性能的测试和评价根据用途选择使用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检测菌落总数测定QB/T2153工业油酸QB/T2850抗菌抑菌型洗涤剂通用技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1抗菌antibacterial采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖
7、及其活性的过程。来源：消毒技术规范（2002年版），1.3.303.2抑菌bacteriostasis采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。来源：消毒技术规范（2002年版），1.3.313.3载体carrier试验微生物的支持物。来源：消毒技术规范（2002年版），1.3.293.4菌落形成单位colonyformingunit,（CFU）在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的表达活菌数量的集落。来源：消毒技术规范（2002年版），1.3.13,有修改3.5中和齐IJneutralizer在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与杀菌剂
8、的混悬液中和微生物表面上残留的杀菌剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。来源：消毒技术规范（2002年版），L3.113.6中和产物productofneutralization中和剂（3.5）与杀菌剂作用后的产物。来源：消毒技术规范（2002年版），1.3.124检验抗菌、抑菌日化产品效果的实验室及无菌操作的基本要求4. 1微生物实验室应采取封闭式布局，建筑应便于清洁、消毒。为避免污染，试验应在相对正压洁净条件下进行。因特殊需要用致病菌作指示菌时，应在生物安全柜（负压）内进行。4.2 试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒。4.3 实
9、验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，应经风淋后进入实验室。然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩。4.4 每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）应在火焰上烧灼灭菌后，方可再次使用。4.5 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸镭水或去离子水或相当纯度的水。4.6 要求无菌的试剂，如蒸储水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均应灭菌或过滤除菌。4.7 无菌器材和试剂，使用前应检查容器或包装是否完整，有破损者不应使用。4. 8正在使用的无菌器材和试剂不应长时间暴露于空气中。4.9 移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染。4.10 所
10、有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中,以防止对周围环境和清洁物品造成污染4.11 若不慎发生微生物培养物摔碎或其他试验微生物泄漏事故，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理。4.12全部试验结束后，应对室内空气和环境表面进行消毒处理。5样品采集为使样品具有良好的代表性，应于同一批号3个运输包装中至少随机抽取12件最小销售包装样品，其中4件留样，4件做抑菌或杀菌性能测试，4件做稳定性测试。抽样的最小包装不应有破裂，检验前不应启开。6日化产品抗菌、抑菌效果评价原则6.1 杀菌试验测定方法文件中杀菌试验测定方法用于考核产品的抗菌作用。6.2 抑菌试验测定方法文件中抑
11、菌试验测定方法用于考核产品的抑菌作用。6.3 检验用指示微生物依据产品执行标准或说明书适用范围进行表1中试验菌的选择检测，也可根据产品的使用要求增加其他菌种作为检验菌种。表1抗菌、抑菌日化产品试验中微生物的选择试验菌名称菌株标准号金黄色前萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538或ATCC27217大肠埃希氏菌（大肠杆菌）（Escherichiacoli）8099或ATCC25922或ATCC11229白假丝酵母菌（白色念珠菌）（Candidaalbicans）ATCC10231铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）（Pseudomonasaeruginosa）TCC15442或AT
12、CC90276.4 作用浓度按产品明示的标准要求进行，未明示的执行QB/T2850。6.5 作用时间按产品明示的标准要求进行，未明示的执行QB/T2850。6.6 菌落计数按GB4789.2中规定计数。6.7 结果报告测试结果报告是试验情况和结果的书面表达，结果报告至少应包括:a）试验菌种，b）作用浓度，c）作用时间，d）效果评价结果，e）对测定结果有影响的其他因素。7日化产品抗菌、抑菌效果检验方法7.1 日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类日化产品抗菌、抑菌效果检验方法分类见表2。表2日化产品抗菌、抑菌检验方法分类类另U方法名称表示形式适用范围本文件对应条杀菌试验悬液定量法计时杀菌抗菌型日化产
13、品7.2模拟法计时杀菌抗菌型织物类洗涤剂7.4载体浸泡定量法计时杀菌抗菌型口化产品7.8抑菌试验悬液定量法计时抑菌抑菌型日化产品7.3模拟法计时抑菌抑菌型织物类洗涤剂7.4抑菌型皂类产品7.7抑菌环法计时抑菌抑菌型日化产品7.5滞留法滞留抑菌抑菌型人体皮肤清洁产品7.6载体浸泡定量法计时杀菌抑菌型日化产品7.97.2日化产品的杀菌效果检验方法（悬液定法）7.2.1设备主要设备有：a）锥形烧瓶，b）平皿（直径9cm）,c）量筒，d）精密PH试纸，e）无菌试管，f）无菌刻度吸管（LomL、5.0mL、10.OmL）或相应的可调量程移液器,g）恒温培养箱，h）冰箱，i）菌落计数器，j）酒精灯，k）电
14、动混合器，1）恒温干燥箱，m）恒温水浴锅，n）湿热灭菌锅，o）电子天平，p）生物安全柜等微生物试验必备仪器。7.2.2试剂7.2.2.1培养基商品化的合格市售培养基：a）营养琼脂培养基，b）营养肉汤培养基，c）沙氏琼脂培养基，d）沙氏液体培养基。7.2.2.20.03moVL磷酸盐缓冲液（PBS）称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g,加蒸储水100OmL,待完全溶解后，调PH至7.27.4,经121C压力蒸汽灭菌20min后备用。7.2.2.3标准硬水（硬度342mgL）称取氯化钙（CaCI2）0304g、氯化镁（MgCI26H20）0.139g,加蒸储水100OmL,经121C
15、压力蒸汽灭菌2（）min后备用。7.2.2.4中和剂几种常见中和剂：a）硫代硫酸钠5.0g、蒸储水IooOmL（用于氯型杀菌剂）；b）磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐温（80）30.0g、蒸储水100OmL（用于非氧化型杀菌剂）；O磷酸二氢钾1.36g、磷酸氢二钠2.83g、卵磷脂3.Og、吐温（80）20.0g、蒸储水100omL（用于非氧化型杀菌剂）；d）吐温（80）20.0g、硫代硫酸钠10.0g、PBSlOOOmL（用于氧型杀菌剂）。7.2.2.5菌液制备7.2.2.5.1细菌繁殖体悬液的制备细菌繁殖体悬液的制备步骤如下。a）取冻干菌种
16、管，在无菌操作下打开，加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.OmL10.OmL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置（36土D培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于（361）C培养18h24ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于（361）C培养18h24ht即为第3代培养物。b）取菌种第36代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h）,用5.0mL吸管吸取3.0mL5.0mL稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.OmL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s,或在手掌上振
17、敲80次，以使细菌悬浮均匀。c）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。d）细菌繁殖体悬液应保存在4。C冰箱内备用，当天使用不应过夜。e）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。7. 2.2.5.2白假丝酵母菌（白色念珠菌）悬液制备白假丝酵母菌（白色念珠菌）悬液制备步骤如下：a）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.OmL10.OmL沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置（361）C培养18h24ho用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基
18、平板上，于（361）C培养18h24ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于（361）C培养18h24h,即为第3代培养物。b） 取菌种第36代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物18h24h,用5.OmL吸管吸取3.0mL5.0mLPBS稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.OmL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌悬浮均匀。c） 菌悬液保存在4C冰箱内备用，当天使用不应过夜。d）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可
19、用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。7. 2.3中和剂鉴定试验8. 2.3.1总则为准确评价所测样品对微生物的杀灭作用，杀菌试验中要求选择适当中和剂。所选中和剂不仅能及时中止抗菌洗剂对微生物的抑杀作用，且中和剂本身与所测样品的反应产物（即中和产物）对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响。9. 2.3.2试验分组试验分为以下4组：a）第1组：5.0mL中和剂+菌液-培养；b）第2组：（0.5mL抗菌剂+4.5mL中和剂）+菌液-培养；c）第3组：5.OmL稀释液+菌液一培养；d）第4组：稀释液+中和剂+培养基一培养。7.2.3.3试验步骤根据试验分组，准备试管和平
20、皿，依次进行编号。a）第1组：取5.0mL中和剂于试管中，置（201）C水浴5min,加入O.ImL菌悬液，混匀，作用IOnIin。用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取LOmL,分别接种于2个平皿中，做活菌培养计数。b）第2组：取5.0mL中和产物溶液（取试验样液1.OmL与中和剂9.OmL混合，作用10min后制成中和产物）于试管中，置（201）C水浴5111讯加入0.1mL菌悬液，混匀，作用10mine用中和产物做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取LOmL,分别接种于2个平皿中，做活菌培养计数。c）第3组：取5.OmLPBS于试管中，置（20l）C水浴5min,加入0.
21、ImL菌悬液，混匀，作用10min。用PBS做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取LOmL,分别接种于2个平皿中，做活菌培养计数。d）第4组：分别吸取PBS与中和剂各1.0mL于同一无菌平皿内，倒入同批次的培养基15mL20mL,培养观察。7.2.3.4结果判定7.2.3.4.1第1、2、3组菌数相似，回收菌量在1X104CFUmL9xl（）4CFUmL,并且其组间菌落数误差率不大于15%。第1、2、3组间菌落数误差率按公式（1）计算：E=F00（1）3V式中：E组间菌落数误差率；y3组间菌落算术平均数，单位为每亳升菌落形成单位（CFU/mL）;Y各组菌落算术平均数,单位为每亳升菌落形成单
22、位（CFUmL）o7.2. 3.4.2第4组无菌生长。7.2.3. 4.3连续3次试验取得合格评价。7.2.4杀菌试验操作步骤7.2.4.1用PBS液将试验菌悬液（7.2.2.5）稀释，要求浓度为：取O.ImL滴于5.OmL对照样液（PBS）内，回收菌数为IXlO,CFU/mL9x104CFUZmLo7.2.4.2将试验样品用无菌标准硬水稀释至规定的浓度。7.2.4.3吸取试验样品原液或其稀释液5.0mL放入灭菌试管中，20恒温5min（皂类产品30）。7.2.4.4吸取试验菌液O.ImL加入到含5.OmL样品的试管中，迅速混匀，并立即计时。7.2.4.5作用至设定时间后，取试验菌与样品的混合
23、液0.5mL,加入到含4.5mL经灭菌的中和剂中，混匀。1.1.1.6 中和Iomin后，吸取样液（或作适当稀释后，取其中23个稀释度的稀释液）ImL,置于灭菌平皿内，每个样液或稀释液接种两个灭菌平皿。用凉至40C45的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（白色念珠菌）15InL20矶作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平m,（36l）0C培养（482）h（细菌）或（723）h（白色念珠菌）后，做活菌菌落计数。1.1.1.7 以PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。1.1.1.8 实验重复3次，求其算术平均值。7.2.5 计算公式杀菌率按式（2）计算，结果以百分数（
24、%）表示，保留两位小数。S=三100%式中：S杀菌率；对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFUAnL）;jf试验样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFUmL）o7.2.6 活菌计数中误差评价活菌计数中平板间菌落数误差率、稀释度间菌落数误差率不宜超过10%,对误差率的自检，可按式（3）式（8）计算。-=Z（3）式中:vp平板间菌落平均数，单位为每毫升菌落形成单位(CFUInL);T各平板菌落，单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);n平板总数。n式中：S平板间菌落数平均差，单位为每亳升菌落形成单位(CFUmL)1平板间菌落平均数，单位为每亳升菌落形成单位(CFUInL);T
25、各平板菌落，单位为每毫升菌落形成单位(CFUmL);n平板总数。E=100%式中：Ep平板间菌落数误差率；S平板间菌落数平均差，单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);vp平板间菌落平均数，单位为每亳升菌落形成单位(CFUmL)o(6)式中：单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);V4稀释度间菌落平均数,D各稀释度平均菌落数,d稀释度数。.=工1；一_(7)式中：Sa一一稀释度间菌落平均差，单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);vs一一稀释度间菌落平均数，单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);D各稀释度菌落数，单位为每毫升菌落形成单位(CF
26、U/mL);d稀释度数,Ed=100%(8)匕式中：Ea-稀释度间菌落数误差率；Sa稀释度间菌落数平均差，单位为每亳升菌落形成单位(CFU/mL);V1稀释度间菌落平均数，单位为每毫升菌落形成单位(CFU/mL),7.2.7产品抗菌效果评价将测试结果填入表6,评价产品的抗菌效果。当杀菌率不低于90%,表明此条件下产品有抗菌效果。表6抗菌效果评价试验菌种作用时间/（Inin）作用浓度效果评价a试验由一栏填入具体的测试菌种，对于多个菌种的测定结果，分别进行效果评价7.3日化产品的抑菌效果检验方法（悬液定量法）7.3.1设备同7.2.1。7.3.2试剂同7.2.2。7.3.3抑菌试验操作步骤7.3.
27、3.1用PBS液将试验菌悬液（7.2.2.5）做适当稀释，要求浓度为：取0.1mL滴于5.0mL对照样液（PBS）内，回收菌数为lXl（TCFUmL9xl（）4CFU/mL。7.3.3.2将试验样品用无菌标准硬水稀释至规定的浓度。7.3.3.3吸取试验样品原液或其稀释液5.0mL放入灭菌试管中，20恒温5min（皂类产品30）。7.3.3.4吸取试验菌液0.ImL加入到含5.OmL样品的试管中，迅速混匀，并立即计时。7.3.3.5作用至设定时间后，取试验菌与样品混合液0.5疝，加入到含4.5mL经灭菌的PBS试管中，充分混匀。7.3.3.6吸取样液（或作适当稀释后，取其中23个稀释度的稀释液）
28、1mL,置于灭菌平皿内，每个样液或稀释度接种两个灭菌平皿。用凉至40C45C的营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（白色念珠菌）15mL20mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿，（361）*C培养（482）h（细菌）或（723）h（白色念珠菌）后，做活菌菌落计数。若接种低稀释度样液的平板无菌落生长，但接种高稀释度样液的平板有菌落生长，按无菌落生长计数。7.3.3.7以PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。7. 3.3.8试验重复3次，求其算术平均值。8. 3.4计算公式。抑菌率按公式（9）计算，结果以百分数（%）表示，保留2位小数。r=-oo%（9）式中：抑
29、菌率；1 对照样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFU/mL）;D_试验样品平均菌落数，单位为每毫升菌落形成单位（CFUmL）07.3.5误差评价7.3.6产品抑菌效果评价将测试结果填入表7,评价产品的抑菌效果。当抑菌率不低于90乳表明此条件下产品有强效抑菌效果；当抑菌率不低于50%且不足90%时，表明此条件下产品有抑菌效果。表7抑菌效果评价试验菌种作用时间/min作用浓度效果评价a试验菌一栏填入具体的测试菌科U对于多个菌种的测定结果，分别进行效果评价，7.4织物类洗涤剂抗菌或抑菌效果检验方法（模拟法）7.4.1原理本方法通过模拟洗衣机的洗衣过程，检测洗衣粉（液）等织物类洗涤产品的抗菌
30、或抑菌效果。7.4.2设备7.4.2.1不锈钢转轴（由一条直径0.16Cm不锈钢丝制成，如图1所示）。a）俯视图b）侧面图图1缠绕测试布条的不锈钢转轴7.4.2.2有金属螺盖的玻璃罐（容积为470mL,能高压灭菌，并能放入转轴的广口罐），将罐口覆盖牛皮纸，加盖，于121灭菌25min备用。7.4.2.3转动速度为45rmin60rmin的滚动摇床。7.4.2.4可调恒温水浴箱。7.4.2.5吸管（ImL、5mL、IOmL）O7.4.2.6培养皿。7.4.2.7铺有滤纸的玻璃培养皿。7.4.2.8细菌保存管。7.4.2.9细菌培养箱。7.4.2.10涡流振荡器。7.4.2.11棉布（32支纱cm
31、x32支纱/cm平织棉布）。7.4.2.12别针、镶子、无菌手套、3mm5mm玻璃珠、秒表、2.5cm3.8cm载体布片（见测试棉布制备）。7.4.3试剂7.4.3.1培养基（商品化的合格市售培养基）：营养琼脂、胰蛋白陈大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白陈大豆肉汤培养基（TSB）o7.4.3.2牛血清白蛋白溶液（浓度3给：称取牛血清白蛋白3.0g,加蒸储水100mL溶解后用微孔滤膜（孔径为0.45Hm）过滤除菌，冰箱保存备用。7.4.3.3标准硬水（7.2.2.3）。7. 4.3.4非离子浸湿剂：称取5.Og烷基酚聚氧乙烯酷，5.Og碳酸钠，加蒸储水IoOOmL溶解。8. 4.3.5洗涤液：移取
32、1.5g非离子浸润剂（7.4.3.4）,L5g碳酸钠，加蒸储水300OmL溶解。9. 4.3.6中和剂（经中和剂鉴定试验合格,同7.2.3）。10. .3.7吐温80（过滤除菌）。7.4.4 试验准备7.4.4.1 测试棉布的制备将大约30Og测试棉布加入3L洗涤液（7.4.3.5）,加热煮沸lh。取出棉布，在煮沸的去离子水中清洗5min然后放入凉的去离子水中5min,以去除残留的洗涤液，最后将棉布晾干。7.4.4.2 测试棉布和转动支架的准备取处理过的棉布，剪成5cm宽，质量为（15l）g的布条，将其一端插入固定在测试转动支架的水平方向的外边，然后在3条水平支架间以足够的张力缠绕12个整圈，
33、将布条的另一端用不锈钢别针固定在前一圈布条上。最后以121C压力蒸汽灭菌15min,备用。7.4.4.3 4.3细菌悬液的制备用PBS液将试验菌悬液（7.2.2.5）稀释，要求浓度为IX108CFUmL5xl（）8CFUmL,然后加入等体积的牛血清白蛋白溶液（3%）。7.4.4.4 染菌载体的制备每片载体布片（7.4.2.11）接种20HL菌悬液，放回培养皿中，加盖，于（361）C培养箱中干燥20min7.4.4.5 4.4.5测试样品的制备试验开始前20min,将盛有265mL硬水的玻璃罐放入水浴中恒温至测试温度（251）C的玻璃罐，然后将被测试样品按规定的浓度（即抗菌、抑菌试验的作用浓度）
34、加入混合溶解，保持该溶液的温度与测试温度一致。7.4.5 杀菌或抑菌试验操作步骤7.4.5.1将2片染菌载体（7.4.4.4）放入转动支架的第6和7层布条之间，将第3片放入第7和8层布条之间。7.4.5.2以无菌操作方式将转动单元（支架、布条和染菌载体）放入含有测试样品的玻璃罐中，加盖。玻璃罐固定在摇床上，滚动旋转洗涤至设定时间（即抗菌、抑菌试验的作用时间），取下玻璃罐。7.4.5.3以无菌操作方式，取出转动单元，取下3片染菌载体，放入到含有30mL中和剂（在测试抑菌产品的抑菌作用时，以含0.5%吐温80的PBS30mL代替中和剂，其他操作步骤均与测试抗菌产品试验相同）的试管中，在振荡器中混合
35、10s,然后振打200次，用PBS做10倍系列稀释，并选择适宜稀释度样液接种TSA平板，每个稀释度接种2个平板。7.4.5.4以含0.5%吐温80的PBS代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品组。7.4.5.5菌数对照组：将3片染菌载体加入含有30mL0.5%吐温80的PBS试管中，在振荡器振荡20s,然后振打200次，用PBS做10倍系列稀释，并取适宜稀释度样液LOmL以倾注法接种TSA平板，每个稀释度接种2个平板。7.4.5.6将试验组、对照组及菌数对照组平板倒置于（361）C培养箱中，培养（482）h,计数菌落数。7.4.5.7试验重复3次，求其算术平均值。7.4.6计算公式杀菌
36、率和抑菌率分别按公式（2）和公式（9）计算，结果以百分数（%）表示，保留2位小数。7.4.7产品抗菌或抑菌效果评价抗菌效果评价见7.2.7,抑菌效果评价见7.3.6o7.5日化产品的抑菌效果检验方法（抑菌环法）7.5.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。7.5.2 设备7.5.2.1刻度吸管（1.0mL、5.0mL）。7. 5.2.2抑菌剂载体（5mm直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120C烤干2h,保存备用）。7.5. 2.3电动混合器。7.5.2.4微量移液器（5HL50L,可调式）。7.5
37、.2.5游标卡尺。7.5.3试剂7.5.3.1营养琼脂（7.2.2.1）。7.5.3.2设备菌悬液（7.2.2.5）。7.5.4抑菌试验操作步骤7.5.4.1抑菌片的制备液体抑菌试验样品，取无菌干燥滤纸片，每片滴加实际使用浓度的抑菌试验样品溶液20UL,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温箱（361）。C中烘干，或置室温下自然干燥后备用。固体抑菌试验样品，直接制成直径为5mm,厚度不超过4mm圆片（块）备用。7.5.4.2对照样的制备液体抑菌试验样品，取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸储水20L,干燥后备用。固体抑菌试验样品，取同种材质不含抑菌成分的样本，制成与试验组大小相同的圆片（块
38、）备用。7.5.4.3试验菌的接种用无菌棉拭子蘸取浓度为lX105CFUmL9X105CFUInL试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂沫3次。每涂抹1次，平板应转动60,最后用棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。7.5.4.4抑菌试验样片贴放每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片对照样片，共计5片。用无菌镜子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镜子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置（361）C恒温箱，培养16h18h后观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。试验重
39、复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。7.5.5产品抑菌效果评价抑菌环直径大于7mm者，产品有抑菌作用。抑菌环直径不大于7mm者，产品无抑菌作用。7.5.6注意事项7.5.6.1每次试验均应设置对照组，不应省略。在报告中亦应将对照组的结果列出。7.5.6.2接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可能减小。7.5.6.3应保持琼脂浓度的准确性，同时培养皿中倾倒琼脂量为15mL20mL,否则可能影响抑菌环的大小。7.5.6.4培养时间不应超过18ho培养过久，部分细菌可能恢复生长，抑菌
40、环变小。7.5.6.5抑菌环直径可能受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌片应在试验当天制备。7.6人体皮肤清洁类产品抑菌效果检验方法（滞留法）7.6.1 原理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法检测人体皮肤清洁类产品在一定时间内作用于人体皮肤上的滞留抑菌效果。7.6.2 设备7.6.2.1 恒温箱。7.6.2.2金属筒（直径2.2cm、高度3cm）。7.6.2.3一次性接种环（直径4mm）。7.6.2.4小塑料碗（直径2.2cm,高2.5mm）。7.6.2.5胶带。7.6.2.6尼龙刮菌棒。7.6.2.7玻璃弯棒。7.6.3试剂7
41、.6.3.1培养基（商品化的合格市售培养基）：胰蛋白陈大豆肉汤培养基（TSB）.胰蛋白陈大豆琼脂培养基（TSA）o7.6.3.20.03mol/L的磷酸盐缓冲液（同7.2.2.3）。7.6.3.370%75%酒精。7.6.3.4羊血。7.6.3.5脂肪醇聚氧乙烯酸。7.6.3.6外用抗生素软膏。7. 6.4样品试验品按顺序编号分为25组。每组2个，一个为按规定的作用浓度配制的测试样品，另一个为不含抑菌剂的对照样。8. 6.5抑菌试验操作步骤9. 6.5.1调整阶段试验开始前7d至14d,受试者使用不含抗菌、抑菌成分的日化产品进行日常肤发的清洁。此阶段持续至少7d,但不超过14d010. 6.5
42、.2清洗阶段清洗阶段共3d,受试者每天用抑菌样品清洗一侧前臂，用对照品清洗另一侧前臂，清洗过程如下：a）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在35C37C）打湿前臂内侧；b）用样品从手腕至臂肘上下摩擦15s;c）用手在涂有样品的手臂上上下摩擦泡沫45s;d）用流动的清水冲洗前臂15s,不应搓擦；e）用纸巾沾干前臂，不应搓擦；f） 重复a）e）步骤清洗右臂；g） 按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少Ih,记录最后一次清洗时间。然后按规定的作用时间间隔要求，进行滞留效果检测。第9次清洗前臂以后，受试者不应洗澡、沐浴或洗净前臂，直到试验结束。清洗前后每组试样的质量及受试者完成清洗的情况，
43、应记录。7.6.5.3试验阶段清洗阶段的第4天（最后一次清洗后的12h24h内），在受试者每只前臂上划出一个试验区并进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下：a）将金黄色葡萄球菌（ATeC27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白陈大豆内汤培养基（TSB）中，在（361）C的条件下培养（202）h.然后用胰蛋白陈大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为IX10CFUmL-510CFUmLob）细菌接种。在受试者的每只前臂中间部位（不应在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.0Cm的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样器取IOUL上述菌悬液，接种于前臂试验区，菌数为IX10
44、6CFU/试验区5X106CFU/试验区。用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有4mm5mm的距离。c）封包。细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。d）回收存活细菌。接种2h5min后对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位，不应接触到盖有印墨的边缘。将ImL含0.1%脂肪醇聚氧乙烯酸（AEo9）的003mol/L磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s,将筒内液体吸移至试管内，再加ImL含。.质AEo9的003mol/L磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第2次刮洗30s,将第2
45、次擦洗的液体，注入含第1次刮洗液体的试管中。e）试验区试验后的消毒处理。一个试验区采样之后，应用70%的酒精对试验区进行消毒。然后对另一个试验区以同样方法进行采样，采样结束后，先用70%的酒精对试验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。f）平皿接种与培养。对每一个取样进行平皿接种，以0.03molL磷酸盐缓冲液（PBS）对样品进行10倍系列稀释。选适当稀释度取0.ImL接种于2个含5%羊血的TSA平皿表面，用玻璃弯棒涂匀，在（361）C的培养箱中培养（482）h,计数菌落数。7. 6.6计算公式抑菌率按公式（9）计算，结果以百分数（%）表示，保留2位小数。8. 6.7产品抑菌效果评价同7.3.6o9. 6.8试验要求10. 6.8.1试验人次不应少于16人次。11. 6.8.2受试者录用标准受试者录用标准如下：a）年龄介于18岁至65岁的男性或女性的身体健康者；b）前臂应完好无损且没有皮肤病及其他皮肤问题；c）同意在整个试验期间，避免使用抗菌、抑菌洗液和乳膏、局部固醇类药物和全身或局部使用抗生素；d）同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但受试者不应清洗前臂。在第9次洗完前臂后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束。
