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1、类风湿关节炎新型标志物临床应用与展望类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是以手足小关节慢性炎症、骨质破坏受损为特征的自身免疫疾病。中国RA发病率0.42%,总患病人群约500万，男女比约1：4o目前RA的治疗原则是早诊断、规范治疗和定期监测病情，以实现缓解疾病发展、降低致残率。类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CyCIecitruIIinatedproteinantibodies,CCP)是国内外指南中明确的诊断标志物1。新近发现的抗氨基甲酰化蛋白抗体、14-3-3蛋白等在RA诊断，特别是CCP抗体阴性RA早期诊断和预后评
2、估具有重要潜在应用价值2。近十余年治疗RA的疾病改善抗风湿药(disease-modifyinganti-rheumaticdrug,DMARD)取得突破性进展，对接受甲氮蝶吟(methotrexate,MTX)为代表的传统合成药(conventionaIsyntheticDMARD,csDMARD)治疗效果不佳患者，在继续MTX治疗基础上，分别联合肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF-)抑制剂英夫利昔单抗(Inf1.iximab,IFX)、阿达木单抗(AdaIimumab,AD1.)、依那西普(Etanercept,ETA)、抗11-6受体单抗托珠单抗(Toci1.i
3、zumab,TCZ)和抗CD20单抗利妥昔单抗(Riti1.Ximab,RTX)等生物类药(bi01OgiCa1.DMARD,bDMARD)和包括JAK抑制剂(托法替尼,Tofacitinib)、T细胞共刺激抑制剂(阿巴西普，Abatacept)在内的靶向合成类药(targetedsyntheticDMARD,tsDMARD)等治疗，使部分常规传统药难以控制的患者病情得到有效缓解，但各种疗法存在个体差异，例如抗TNF-Q疗法约30%40%患者无效1,3o因此，RA标志物研究又迎来新挑战，即伴随诊断标志物。伴随诊断是指通过检测标志物预测患者对某类治疗药物的反应性。本文围绕新近发现的具有辅助早期诊
4、断、伴随诊断、评估病情的新型标志物，包括血清蛋白、细胞膜蛋白、非编码RNA,bDMARD及其抗药抗体(anti-drugantibodies,ADA)检测的研究进展、应用前景进行分析，以期推动有应用价值标志物早日转化、应用，实现RA早期精准诊疗，提高缓解率、降低毒副作用。一、血清蛋白指标1. 14-3-3蛋白：14-3-3蛋白是一类胞内分子伴侣蛋白，存在7种亚型：q/B、e、Y、Xt、和,此类蛋白可通过调控细胞的增殖、分化、代谢等多种途径参与机体生理病理过程，其中14-3-3蛋白被发现在RA患者血清和关节滑膜液中特异性升高。机制研究发现巨噬细胞在受到TNF-Q诱导发生坏死性凋亡时大量表达14-
5、3-3,而14-3-3以剂量依赖性诱导促进关节损伤直接相关的因子，如白介素(inter1.eukin,I1.)-1B、I1.-6、基质金属蛋白酶(matrixmeta1.Ioproteinase,MMP)1MMP3、MMP9和核因子B受体活化因子配体(receptoractivatorfornucIearfactor-BIigand,RANK1.)表达，促进RA发生和发展4o目前已明确14-3-3是极具应用价值的RA诊断标志物，14-3-3联合CCP抗体与RF联合CCP抗体相比，前组敏感度71%、特异度92%,后组虽然敏感度相同，但特异度仅84%。在特异度90%的前提下，早期RA血清14-3-
6、3阳性率58%,特别是在早期未分类关节炎中，血清14-3-3基线水平可作为预测患者发展成RA的风险评估指标。此外，血清14-3-3基线水平可评估关节滑膜炎症和骨质侵蚀程度和预测预后5,6o有学者分析149例RA患者分别接受MTX、AD1.TCZ.Tofacitinib治疗1年前后包括血清指标变化，发现治疗前血清14-3-3阳性(I1.o例，截断值WO.19ng/m1.)病情更重，14-3-3与C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)联合能有效评估疾病活动性。治疗后绝大多数患者14-3-3有不同程度降低，14-3-3水平阳性转阴患者患者具有更好的临床反应，其中TCZ治疗组(50例
7、)达到DAS28-ESR缓解患者(30例)的14-3-3的治疗前基线水平W0.4ng/m1.,表明14-3-3(0.4ng/m1.)是预测TCZ治疗缓解的独立预测指标7o2. MMP3:MMP家族是一类结构相似，能降解细胞外基质的内肽酶统称，其中MMP3亚型主要由关节滑膜细胞、软骨细胞产生，直接参与软骨胶原蛋白降解，是RA骨关节破坏的重要因子8o有研究证实RA关节滑膜及血清中MMP3水平与骨关节损伤程度呈正相关，血清MMP3指标单独应用诊断RA效能不及CCP抗体和RF,但在CCP抗体阴性RA中有较好的应用价值，其敏感度和特异度分别达63.6%和81.5%2oMMP3联合CRP和ESR可有效评估
8、RA疾病活动状态，甚至在早期RA患者CRP和红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,ESR)水平均正常，血清MMP3水平已出现异常9o有多个临床研究显示，经MTX治疗、或MTX联合IFX、AD1.TCZ.TOfaCitinib等治疗病情缓解者血清MMP3水平显著下降，在治疗过程中MMP3持续高水平预示治疗失败8,10o因此，MMP3不仅是CCP抗体阴性RA的有效诊断指标，也是评估疾病活动状态、预测预后的有效指标，常规临床应用有助于RA患者个性化医疗管理。3 .钙结合蛋白S100A89:S100A8/9是由S1.oOA8蛋白和SIOOA9蛋白组成的异二聚体，主要在
9、中性粒细胞、单核细胞、活化的巨噬细胞等髓系细胞表达且具有钙结合特性，因此又称为髓系相关蛋白8/14或钙卫蛋白。SIOOA8/9在中性粒细胞和单核细胞胞浆蛋白中各占45%和1%。已有研究证明，在RA、骨关节炎、强直性脊柱炎、炎症性肠病、多发性硬化症等活动期患者血清S1.oOA8/9升高11,但在RA患者滑膜中SIOoA8/9水平升高更为显著，并促进RA体内的炎症反应和骨损伤，通过检测血清S100A8/9含量可以反映RA滑膜炎症活动状态。RA血清S100A8/9水平与多项临床疾病活动度指标，包括CRP、ESR.RF、肿胀关节总数和超声检测的炎症评分呈正相关，可作为评估及预测RA关节炎症活动程度及治
10、疗监测的有效标志物12o4 .软骨寡聚基质蛋白(cartiIageoIigomericmatrixprotein,COMP):是一种非胶原基质糖蛋白，主要在软骨中表达。AbataCePt是选择性T细胞共刺激抑制剂，属于tsDMARD,适用于MTX+抗TNF-Q等治疗应答不足的中、重度活动性RA患者。采用蛋白质谱检测技术发现患者血清COMP基线水平可有效预测Abatacept疗效，预测敏感度和特异度分别为75%和77%13o5 .细胞因子：细胞因子在RA关节炎症中发挥重要作用，活动期RA患者血清I1.7、I1.-6、I1.-8、TNF-a等水平升高，其中I1.-6水平是患者受累关节骨质侵蚀进展的
11、强预测因子，并且血清I1.-6基线水平可有效预测TCZ疗效，动态检测I1.-6水平变化可预测对药物的反应性14o二、细胞膜蛋白标志物调节性T淋巴细胞(regu1.atoryTce1.1.,Treg)能够控制机体过度自身免疫反应，对维持机体免疫稳态至关重要。有多个研究报道活动期RA特别是并发心血管病等重症RA患者外周血Treg数量减少和/或免疫抑制功能低下，在病情得到缓解后Treg细胞数量和功能得到改善3o1 .淋巴细胞活化基因-3(IymPhOCyteactivationgene-3,1.AG-3):1.AG-3又称CD223,是免疫球蛋白超家族成员，表达在T细胞、自然杀伤细胞、B细胞等膜表面
12、。由于1.AG-3与CD4有高度同源结构，成为天然CD4竞争者。研究发现1.AG-3主要在抑制性T细胞亚群上表达，对于TregS抑制功能至关重要15。包括RA在内的多种自身免疫病存在1.AG-3+Treg频率降低，尤其是临床疾病活动指数评分较高者。临床研究显示，1.AG-3+Tregs增加可作为抗TNF-Q方案治疗RA病情缓解的监控指标16,也适用于Abatacept治疗对MTX+抗TNF-Q等治疗应答不足的RA患者疗效评估，在AbataCePt治疗6个月后，1.AG3+Tregs显著增加、CD25+Tregs数量下降预示疾病活动缓解17。2 .CD39：MTX是RA的首选一线药物，然而有约4
13、0%的RA患者对MTX治疗无反应。MTX治疗RA的机制之一是通过维持高水平的细胞外腺首(adenosine,ADO)来抑制效应T细胞增殖并诱导凋亡、从而发挥抗炎作用。MTX促进细胞内ATP释放到胞外，CD39是T细胞膜上ATP.ADP水解酶，将胞外ATP、ADP水解、最后降解为ADO,因此CD39表达量与MTX疗效相关3。临床研究显示在MTX治疗前外周血中CD39+表达平均荧光强度(meanfIUorescenceintensity,MFD和CD4+CD25+CD39+Tregs的数量可预测RA患者对MTX疗法的反应性18o三、非编码RNA非编码RNA包括微小RNA(microRNA,miRN
14、A)、长链非编码RNA(Iong-noncodingRNA,IncRNA)等。近年来研究发现多种非编码RNA参与RA发生、发展，已显示出其辅助RA精准诊疗的潜在应用价值。1.miRNA:miRNA是单链、保守的非编码RNA,长度为2022个核甘酸。与RA病理机制、诊断、疗效相关的miRNA均有报道。研究发现miR703a-3p在RA患者和无症状一级亲属血清中表达增加，可能是一种潜在的预测RA疾病风险标志物。RA不同病程中miRNA表达谱不同，早期RA患者血清miR-16、miR-223水平降低、在MTX或糖皮质激素治疗病情缓解后血清水平回升，提示血清miR76和miR-223可作为早期RA鉴别
15、诊断和疗效监测的潜在标志物19miR-551b、miR-448和miRT24组合，对辅助诊断RA、S1.E.干燥综合征均有辅助诊断价值，阳性率88.4%91.3%、特异度73.5%82.4%20。miR-22低表达结合miR-8863p高表达组合预测AD1.疗法对RA有良好缓解率。此外，miR-16-5p.725b-5p、-223-3p、-23-3p、726-3p和-146a-5p组合可作为预测和监测抗TNF-QDMARD治疗RA疗效19o2.IncRNA:InCRNA在机体中广泛存在且高度稳定，是极具潜能的标志物。有报道RA患者外周血单个核细胞和关节滑膜细胞中InCRNA生长阻滞特异转录物(
16、growtharrest-specifictranscript,5GAS5)低表达，IncRNAGAS5能够激活单磷酸腺甘激活蛋白激酶途径、负调节I1.-6和I1.-17表达、并减轻炎症反应RA疾病活动，推测GAS5参与RA发病机制并可作为RA潜在生物治疗靶点和疗效评价指标21oRA中炎症反应增强与NF-B信号活性增加相关，长链基因间非编码RNA(Iongintergenicnon-codingRNA,IincRNA)-p21靶基因是核因子KB(nucIearfactorkappa-B,NF-KB)信号通路关键基因。活动期RA中IinCRNA-p21低表达，MTX可通过促进IinCRNA-p2
17、1水平增加来抑制NF-KB活性、抑制炎症反应，因此RA中IinCRNA-p21水平可作为MTX疗效的预测指标22o四、生物类药物及抗药抗体在传统的合成类DMARD一线治疗失败后，生物类DMARD二线治疗使部分RA患者疾病活动或严重程度得到有效缓解。有多个研究发现抗体类DMARD存在免疫原性，诱导机体产生的ADA是导致部分患者二线治疗失败的关键原因之一。一项多中心研究显示，366例活动期RA患者分别接受IFX(200例)、AD1.(166例)治疗,随访18个月发现患者血清中针对IFX、AD1.的ADA阳性率分别达19.2%和29.4%,ADA产生与用药时间、患者病程及疾病活动度呈正相关，与血药浓
18、度呈负相关，IFX或AD1.与MTX联用较抗体单用，可有效降低ADA产生23。ETA是一种可溶性人源TNF-Q受体与Fc1融合蛋白，现有研究虽未检测到ETA-ADA,但在ETA治疗失败的RA患者血清中ETA浓度显著低于治疗有效组24o另有研究发现接受RTX治疗的系统性自身免疫病患者，多数在第二疗程时出现输液反应，约2.4%RA和14.7%非RA患者出现与疗效降低相关的RTX-ADA25o然而TCZ为例外，在接受TCZ治疗的RA中TCZ-ADA约1.3%,并且TCZ-ADA对疗效影响尚不确定26。因此，建立生物类DMARD及其ADA检测方法、动态监测，有助于预测疗效并辅助临床调整治疗方案。五、总
19、结及展望RA作为一种具有多种临床表现的异质性疾病，缺乏具有高敏感性和选择性的早期诊断和伴随诊断、评估病情生物标志物，这在一定程度上妨碍RA的早期规范诊疗。本文总结和分析了一系列可能有助于RA诊疗的新指标，其中特别关注了伴随诊断指标的应用价值（表1）。在最新的RA诊疗指南中明确，对经规范的csDMARD一线规范治疗疾病缓解未达标患者，联合应用一种bDMARD或tsDMARD治疗。伴随诊断标志物的应用将大大减少DMARD的不当使用、提高缓解率并减轻患者的经济负担。然而，在将这些指标正式运用到临床诊疗之前，还有比较长的路要走，例如加强非编码RNA的临床应用研究，从中筛选到真正高选择性和敏感性的miR
20、NA和InCRNA标志物，建立适应于临床常规检测的标准化、自动化检测技术，实现自身抗体、蛋白指标、非编码RNA和血药浓度及其ADA等多种类型标志物有机组合，为RA的精准诊疗提供更有价值的临床信息。表1新型标志物在RA诊疗中应用价值甘MTXmi1.-6R)CD20ABATAK1.弹后TNF-Q14-3-3Y-Y-Y2,5,6MMP3Y-Y2,8,9,10S100A89YI1.12COMP-Y(13I1.-6Y-Y141.A&3YY16,17CD39YY18miR-16.-223Y-19miR551A-448,-124Y-20m1.R2165p.125t5p,1263p.146a5p2233p,-233pY-Y19JIncRNAGASS-Y(21)1.ncRNA-p21YY-Y22ADAYYY-Y23,24,25,26注：W育价值：二话无相关报遒.MTX力甲氨Ja华,抗TNFC力抗膝痛坏死到子9,抗I1.f昉抗自介素f受优单抗,8力3i施分化抗原，ABA为T/8S共制出抑制剂.TAK1.为谢饯长因子.MMP3SSaB.SIOaA8杓为幅S合蚩白，8MP软骨募聚芟细白,I1.6为全介素6.1.AG3为淋巴妣g活化基53.OiR为微，JvRNA.IncRNA为长链台有RNA,ADA力抗药物抗饮
