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1、美国天使男孩 大卫威特,1971年9月21日，他出生在美国德克萨斯州休斯敦市的圣鲁克医院 1983年底，新任主治医生为“泡泡男孩”移植了姐姐凯瑟琳的骨髓干细胞手术后，凯瑟琳骨髓内潜伏的致命病毒就侵入了他的身体医生放弃了治疗，把“泡泡男孩”从禁锢了他12年的泡泡里抱了出来 1984年2月22日，与病魔和孤独斗争了12年半的“泡泡男孩”享受着生命的尊严与自由，静静地离开了人世,严重联合免疫缺陷病,严重联合免疫缺陷病（severe combinedim-munodeficiemcy，简称SCID）是以各种获得性免疫功能都明显丧失为特征的先天性疾病，若不移植免疫活性组织以重建免疫，或无菌隔离，患者将均
2、在1岁以内天折 2000年，法国最早开始尝试用基因疗法治疗免疫缺陷。但由于接受治疗的2名婴儿先后患上了白血病，使基因疗法的安全性受到质疑。但有专家认为，出现这种情况的原因是接受治疗的患儿年龄太小，还不到3个月大,2004年12月27日，英国柳叶刀杂志报道，英国伦敦的医生近日用基因疗法为严重联合免疫缺陷儿童进行治疗获得成功4位患有严重联合免疫缺陷的儿童已被基因疗法治愈，使利用基因疗法治疗严重联合免疫缺陷的成功案例增加到了18例,第九章 基因治疗与反义药物,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗的概念,凡是将新的遗传物质转移得到某一个体的细胞内，使功能不正常的基因、功能正常的基因但表达量很低的基因、机
3、体本身不存在的外源基因得到正常表达，或者降低、抑制机体基因的表达，从而达到治疗的目的，这种治疗方法就称为基因治疗,基因治疗的对象是人体，因此基因治疗要求确保有效和安全，其难度远远高于在表达系统中表达的基因工程技术近些年来，基因治疗取得了重大进展，研究内容也已经从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管和神经系统等方面疾病,p53,2004年月日重组人p腺病毒注射液已于获得国家食品药品监督管理局的准字号生产批文，从而标志着我国也是世界上第一个获得国家批准的基因治疗药物业已正式上市“今又生”是由深圳市赛百诺基因技术有限公司研制成功的,二、基因治疗的方法,1.基因增补,基因增补就是将正常的基
4、因导入病变细胞或其他细胞，以补偿缺陷基因的功能或调整细胞的某些功能基因增补是目前最常用的基因治疗方式,基因治疗实例,复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,ADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%,2.基因替换,用同源重组或者基因打靶技术，用正常基因替换整个致病基因，使致病基因得到永久更正这种以正常基因替换致病基因的方法是最为理想的基因治疗，但是目前技
5、术手段，体内重组的频率还太低，只有百万分之一左右,3.基因修复,是指将致病基因的突变碱基在原位进行纠正，而正常的部分予以保留这种方法是最理想的基因治疗方法，但是目前还没有成功的报道，只是一种理论上的理想的方式,4.基因失活,利用反义技术将反义寡聚核苷酸或反义RNA导入细胞，特异性地封闭某些基因的表达，以达到抑制有害靶基因的表达作用，也就是人们通常意义上所说的反义疗法 引入的反义物质，可以通过和基因组DNA结合，降低或阻止转录的发生，也可以通过和mRNA的结合，阻止或降低蛋白质的翻译，还可以通过核酶降解mRNA 许多肿瘤的发生都涉及多重癌基因及相关基因的激活并过度表达，抑制这些基因的表达导致肿瘤
6、细胞发生逆转,5.免疫基因的治疗,将抗体、抗原、细胞因子的基因导入患者的体内，改变免疫状态，以达到预防和治疗疾病的目的,黑色素瘤的基因治疗,肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,6.自杀基因治疗,这是一种肿瘤的治疗方法，是指向肿瘤细胞中导入一种基因，基因产物为一种酶，它可以将无细胞毒性的药物前体转化为毒性代谢产物，将
7、肿瘤细胞杀死，又称为活化前体药物基因治疗，这种基因也就被称为“自杀基因”,“自杀基因”疗法,“自杀基因”疗法,“自杀基因”疗法,“自杀基因”疗法,7.耐药基因治疗,耐药基因的治疗是指为了提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力，将产生抗毒性的基因导入人体细胞如向骨髓干细胞中导入多药抗性基因mdr-1，使机体耐受更大剂量的化疗,三、基因治疗的途径,ex vivo(体外途径）in vivo（体内途径）,1.ex vivo,是指将含外源基因的载体外导入到人体自身或异体细胞（异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体 这种方法简单，容易操作，而且外源物质能被稀释并清除。但是载体系统不易形成规模，而且需要专门的临床基
8、地,乙型血友病,XR，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止 发病率为1/30000 我国学者薛京伦实施的F的基因治疗,逆转录病毒载体+FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3导入仓鼠细胞（CHO）F表达；导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达；91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。,2.in vivo,将外源基因装配与特定的真核表达载体，直接导入体内 载体可以是病毒型的或者非病毒型的，甚至可
9、以是裸露的DNA 这种方式比较容易大规模生产。但是必须保证载体的安全性，而且进入人体后，能导入靶细胞并稳定表达达到治疗目的,单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,第二节 基因治疗的步骤和问题,一、基因治疗的步骤,基因治疗的步骤,分离出具有特定功能的特异性基因获得足够量该基因的载体或细胞建立有效的途径将外源基因导入机体内 进入宿主细胞的外源基因必须产生足够量的产物，维持适当的时间，且不产生有害的副作用,二、基因
10、治疗中的问题,安全性 高效的靶向性基因导入 外源基因表达的可控性 治疗基因过少 伦理学问题,第三节 疾病的基因治疗,一、基因治疗与肿瘤,肿瘤的基因治疗，根据作用机制可以分成两类调节机体免疫利用正常细胞和肿瘤细胞的差异,1.导入细胞因子基因进行治疗,许多细胞因子，如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等，都有提高人体免疫力，抑制肿瘤的作用,2.导入MHC的基因治疗,主要组织相容性抗原是具有个体特性的抗原系统 每种生物的个体都有复杂的的组织相容性抗原，一整套这样的抗原系统就称为组织相容性系统能引起快速而且强烈的应答的抗原系统，就成为主要组织相容性系统（MHS）编码MHS基因的编
11、码群就称为主要组织相容性复合物,MHC表达的抗原分为I类和II类I类抗原分子的正常功能是提供递呈抗原肿瘤细胞上I类抗原的MHC表达很弱或者不表达，使机体免疫应答不能发生 导入MHC的I类抗原基因，可以诱导机体对肿瘤细胞的免疫应答，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的,3.导入抑癌基因的基因治疗,很多肿瘤细胞的某些基因异常表达，被称为癌基因，当他们处于正常状态时，就称为原癌基因机体正常细胞存在抑制细胞异常增殖的基因，即抑癌基因，它们在细胞周期的调控和细胞凋亡中，起着非常重要的作用肿瘤细胞中，抑癌基因往往会产生突变、重排或缺失或者表达异常,p53基因,P53是1979年被发现的核内蛋白质，相对分子量为5.3
12、X104 在正常的细胞中，P53水平很低，当射线或其他因素引起DNA损伤时，P53就大量增加，P53可诱发两种不同的细胞结局，即停止生长或细胞凋亡,p53基因的突变以点突变为主，基因重排和缺失很少见结肠、肺、膀胱、乳腺、干、食管、卵巢、皮肤等组织中p53基因的突变率非常高 p53基因产物是393个P53蛋白将野生型的p53基因导入细胞进行表达，从而达到基因治疗的目的,RB基因,RB基因是在1986年分离得到的第一个抑癌基因 成视网膜母细胞（RB）瘤是小而最常见的眼内肿瘤之一 RB基因位于第13号染色体上，其产物是928个氨基酸残基的蛋白质，为P105RB,RB蛋白是一种DNA结合蛋白，调节多种
13、与细胞周期增值有关基因的转录，并最终影响细胞周期的进程 RB蛋白有磷酸化和非磷酸化两种形式，非磷酸化状态的RB蛋白为活性形式蛋白，具有抑制细胞增殖的功能 成视网膜母细胞瘤中，30是缺失了该基因，而有些病变的基因是发生了点突变,乳腺癌、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤中往往也能发现RB基因的失活可以将野生型的RB基因导入到病变的肿瘤细胞中，可以逆转由于RB基因失活引起的癌变,除了p53基因、RB基因外，还有WT基因、NF-1、p16基因等抑癌基因,4.自杀基因的治疗,自杀基因疗法的基本思想就是将编码某种特殊酶的基因导入细胞，使无毒的前体药物转变为有活性的毒物，引起靶细胞的死亡 对消化系统的肿瘤包括肝、结直
14、肠、胃、胰癌的治疗，都证明了确切的疗效,自杀基因+病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,自杀基因的作用机制尚不完全清楚，有可能是直接细胞毒性效应、旁观者效应、促进免疫反应等的综合结果 直接细胞毒性是指高毒性的药物直接将肿瘤细胞杀死 在前体药物存在的情况下，基因改造的肿瘤细胞能引起未经改造细胞的细胞毒性和死亡 自杀基因前体药物促发的免疫反应的原理目前也不分清楚,5 导入耐药基因的治疗,二、基因治疗与艾滋病,艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，是由于人免疫缺陷病毒HIV感染，特异性地破坏了免疫细胞CD4，使机体发生免疫缺陷，造成机体发生肿瘤、机会性感染的一种致
15、死性疾病HIV病毒是单链的RNA逆转录病毒，其外壳糖蛋白Gp120可以和CD4特异性高亲和力结合，使CD4T细胞减少，并使细胞因子的分泌功能受阻，引起机体的免疫缺陷,1.反义核酸,用互补于mRNA的DNA或RNA，在细胞内形成双链分子，阻碍mRNA的剪接、运送、翻译，降低mRNA的稳定性，从而影响病毒基因的表达与复制。目前需要解决的问题是反义核酸的专一性转移和进入靶细胞之前的降解,2.核酶,核酶是具有催化RNA自我剪切反应的核酸，目前报道的核酶是在培养细胞上干预HIV基因的表达核酶的稳定性比较低，生理条件下反应缓慢是其用于抗HIV的不足之处，同时针对它在机体内是怎样被转录和转录后抗RnaseH
16、的能力还需进一步研究,3.可溶性CD4分子的表达,编码CD4的基因已经得到了克隆，并已经在真核系统中表达。将CD4分子的编码基因通过逆转录病毒载体导入到外周淋巴细胞、骨髓造血干细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞中得到表达，表达出来的CD4分子可以与入侵的HIV病毒包膜蛋白Gp120结合，竞争性地保护CD4T淋巴细胞不受或少受感染,4.特异性抗体的诱导,诱导机体产生抗HIV的特异性抗体也是抗HIV治疗的一个重要方法，将gp120的基因导入人体中表达，诱导抗包膜蛋白Gp120的体异性抗体，不仅可以诱导产生IgG，而且可以引发特异性的细胞免疫,5.Tat蛋白突变体表达,Tat蛋白在HIV病毒基因的复
17、制和转录过程中有着极为重要的反式调控作用，将突变体形式的tat基因导入人体后，突变体的大量表达，竞争性地结合Tat受体位点，抑制或干扰HIV病毒基因组的正常复制和转录功能,6.艾滋病疫苗,第六节 反义技术概论,一、反义技术与反义核酸,反义技术是指用人工合成或生物合成的核酸分子,抑制、封闭、破坏靶基因的技术。反义技术中的核酸分子可以是DNA，RNA或者肽核酸 反义技术中所用的核酸，一般又称为反义核酸，就是根据碱基互补配对原理，结合并调节靶基因活性的核酸分子 通过反义技术制备的药物，就是人们常说的反义药物,由于反义技术也是针对基因进行的治疗，所以反义药物从某种意义上讲，也是属于基因治疗的范畴狭义的
18、基因治疗侧重于基因表达的上调性，而反义技术则侧重于基因表达的下调性,二、反义核酸药物特点,1）高度特异性反义药物通过特异的碱基互补配对作用于把RNA或DNA，可以区分基因结构上的细微差异2）高效性反义药物是直接作用于与核酸或调控因子，可以在基因的转录或翻译水平上发挥药物作用,3）最优化的药物设计针对靶基因的序列进行简单的、理性化设计 4）低毒、安全 反义药物还没有发现有显著的毒性，最终都会被代谢掉5）制备简单核酸的合成容易，可以大规模生产，成本比较低,三、反义技术的分类,1.反义脱氧核苷酸（ODN）又称反义DNA，通过与mRNA的结合形成DNA-RNA杂合体，从而影响基因的表达调控。由于DNA
19、序列合成仪的广泛使用，所以ODN很容易获得 2.反义RNA 反义RNA是与能mRNA序列互补配对形成双链复合物的RNA片段，影响基因的翻译,3.核酶 核酶存在于生物细胞中，是一类具有催化活性的RNA分子，具有核酸酶的水解活性，可以特异性地剪切RNA分子 4.三链形成寡核苷酸（TFO）三链形成寡聚核苷酸是指可与双链或单链DNA形成三股链，从而抑制基因转录的寡核苷酸 5.肽核酸（PNAS）肽核酸是以肽为骨架的DNA类似物，是用手性不对称的中性肽链骨架置换脱氧核糖磷酸而成,第七节 反义技术原理和方法,一、反义脱氧核酸,天然存在未经修饰的磷酸二酯脱氧化核苷酸（POODN）作为反义药物虽然有和靶RNA发
20、生特异序列结合，激活Rnase H的活性，但是在生理条件下，PO-ODN对核酸酶很敏感，易被快速降解，限制了它的实际使用,1.第一代硫代寡聚核苷酸（PS-ODN）,以一个硫原子取代了核酸中磷酸的非桥羟基上的氧原子 显著地提高了化合物在各种环境中对核酸酶的稳定性，而且保留了在交亲和性以及对RnaseH的激活活性 第一个获得美国FDA批准的反义药物弗米韦新,1998年，第一个（也是至今为止唯一的一个）反义药物Vitravene（Fomivirsen）被美国FDA批准通过这种硫代磷酸酯DNA被注射入玻璃体内，以治疗由巨细胞病毒（Cytomegalovirus）引起的爱滋病人的视网膜炎Vitraven
21、e获得批准是参与反义领域的公司的一个里程碑这种药物满足了感染者的需要，但是它的用处非常稀少，2001年为ISIS制药公司（USA）和Novartis公司（Switzerland）带来了15万7千美元销售收入,2.第二代混合骨架寡核苷酸（MBO）,典型的MBO为三明治寡核苷酸 中间是PS-ODN片段，能够提供激活RnaseH活性的信息 5端和3端为对核酸酶稳定的修饰寡核苷酸，主要是对核糖的2号位烷基化的PS-ODN 一个MBO分子通常由中间810个碱基的PS-ODN和两端的46个甲基化的PS-ODN组成,二、反义RNA,反义RNA可以通过人工合成，但是更容易被细胞内的核酸酶降解一般利用基因重组技
22、术将靶基因序列反向插入到病毒载体或质粒载体的启动子和终止子之间，克隆后导入细胞内进行转录，从而源源不断地产生反义RNA 常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、HIV病毒载体非病毒载体常用的就是质粒载体,三、核酶,1990年Sarver首先报道核酶在体外培养的细胞中成功地抑制了HIV的复制，从而引起了越来越多的医学和生物工作者的重视,四、三链形成寡核苷酸,三链形成寡聚核苷酸是直接作用于DNA的转录或复制过程寡聚嘧啶或嘌呤的TFO，通过Hoogteen碱基配对规则，形成三链核苷酸，从而抑制基因的转录，转录因子或RNA聚合酶的结合位点是TFO常用的靶点 对于单链DNA或RNA，可以用两个寡聚核苷酸结合形成TFO，从而抑制单链DNA引物的延伸、单链RNA病毒的逆转录,五、肽核酸,肽核酸是以肽链骨架代替核糖磷酸骨架的DNA类似物，其骨架为电中性。1991年丹麦科学家Nielsen等首先报道了肽核酸 两个肽核酸可以和单链DNA或RNA形成三螺旋结构 PNA-RNA不是RNaseH的水解底物，所以PNA的反义作用具自己不同的机制，如空间结构上阻断核糖体或重要的翻译因子,Alpha-肽核酸的结构图,The energy minimized model of a PNA-T10 and DNA-A10,
