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1、北京油鸡鸡汤滋味物质分析鸡肉具有胆固醇含量低、蛋白质含量高、氨基酸种类全等特点，深受大众喜爱北京油鸡，又名中华宫廷黄鸡，是北京地区特有的肉蛋兼用型鸡种。在炖煮过程中鸡肉可释放小肽、游离氨基酸、无机盐、核酸代谢物等物质，以赋予鸡汤一定的风味和营养特性，使得鸡汤滋味鲜美可口，营养价值提高3。与其他众多品种鸡肉相比，北京油鸡鸡肉肉质细嫩、味道鲜美，尤其炖煮鸡汤风味更佳4,目前，对于鸡汤中呈味物质的研窕己有一些相关报道。如王琳涵等采用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HP1.C)分析不同煮制时间鸡汤呈味物质变化，发现在5h内5。胞昔酸(5z-cyti
2、dylatemonophosphate,5-CMP)、5。鸟在酸(5,-guanosinemonophosphate,5。GMP)、乳酸和游离氨基酸含量随着煮制时间的延长而增加，而5,肌昔酸(5,-inosinemonphosphate,5,-IMP)和5。腺甘酸(5细胞色素(1250ODa)上海曦玉分析仪器科技有限公司；虱基4羟基肉桂酸(纯度99%)德国Merk公司。5,-AMP,5,-GMP.5,-IMP(纯度均为99%)科技有限公司。1.2 仪器与设备A1.PHA241.SC冷冻干燥机德国ChriSt公司；330K高速离心机美国Sigma公司；1200型HP1.C仪美国Agilent公司
3、；PHSJ3F实验室PH计仪电有限公司；5800型MA1.DI-ToFMS仪美国ABSCieX公司；MD99自动液相色谱分离仪仪器厂。13方法13.1 样品制备北京油鸡(1kg)去除内脏、清水洗净后，按质量比1：2将油鸡和水置于炖煮锅中，95C炖煮3h。炖煮后将鸡汤过滤，石油酸(1：1,V/V)萃取3次除脂，再冻干成粉待用。13.2 游离氨基酸分析取3g冻干粉置于烧杯中，加入32m1.磺基水杨酸溶液(质量浓度36g1.)混匀，静置10min,020000r/min离心15min,取上清液，0.22Hm聚酸碉膜过滤，待分析。HP1.C条件：POrOShellHPH-C18分析柱(4.6mm100
4、mm,2.7m);柱温40；流速1.5m1./min；二极管阵列检测器，检测器程序：011.0min,波长338nm；11.0-18.0min,波长262nm(仅用于分析脯氨酸)。流动相A：IommoI/1.磷酸氢二钠-10mmol/1.硼酸钠缓冲液(pH8.2)；流动相B：甲醇乙月青-水(45:45：10,V/V)；梯度洗脱程序：00.35min,2%B；0.3513.4min,2%57%B；13.413.5min,57%100%B；13.515.7min,100%B;15.7-15.8min,100%2%B；15.8-18.0min,2%B衍生化试剂：9笏甲基氯甲酸酯和邻苯二甲醛，质量浓度
5、分别为2.5、10mg/m1.：进样12。重复测定3次。将氨基酸标准品用蒸馅水逐级稀释，配制胱氨酸标准溶液浓度为1.250、0.625、0313、0.156、0.078molm1.,其他16种氨基酸标准溶液浓度为2.500、1.250、0.635、0.313、0.150molm1.o以浓度(molm1.)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制17种氨基酸标准曲线，外标法进行定量分析。1.3.3 核甘酸测定样品为冻干粉加蒸馈水更溶的鸡汤，质量浓度25mgm1.0HP1.C条件：WatersXbridgeAmideft(4.6mm150mm,3.5m);柱温40；流动相为0.0ImOI/1.甲
6、酸锈溶液(PH4.5)乙晴(15：85,V/V)；流速1.Om1.min,等度洗脱15min；二极管阵列检测器，检测波长260nm；进样20瓜。重更测定3次。采用外标法定量分析。用蒸储水配制5。AMP、5。GMP、5。IMP的混合标准溶液储备液16mg/100m1.,然后稀释为0.5、1、2、4、8mg/100m1.以质量浓度(mg100m1.)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。加标回收实验：准备4份鸡汤样品，3份分别加入5。AMP、5。GMP和5FMP标准品至最终质量浓度2.5、37、1.5mg/100m1.,1份作为空白实验。4份样品均采用以上HP1.C条件进样分析。1.
7、3.4 葡聚糖凝胶色谱分离装有SePhadeXG-15葡聚糖凝胶的色谱柱(玻璃管3.0CmX60Cm),超纯水洗脱，流速3.0m1./min,紫外检测波长220nm,鸡汤除脂冻干粉用蒸储水配成质量浓度100mg/m1.的溶液，经0.45um聚酸飒膜过滤上样，上样量5m1.。根据检测到的谱峰进行福分收集，共收集了3个谱峰的馈分，收集到的谯分冻干待用。1.3.5 高效凝胶液相色谱分析取一定量的1.3.4节获得的冻干馆分以及一定量的原始鸡汤除脂冻干粉，用蒸馆水配成质量浓度为10mg/m1.溶液，过0.22m聚酸飒膜后，待HP1.C分析。色谱柱TSKgelG2000SWX1.柱(7.8mm300mm,
8、5Um)；流动相为水乙晴-三氟乙酸(80：20：0.1,V/V)；流速0.5m1./min；柱温25；进样量IOlI1.；二极管阵列检测器，检测波长22Onm。绘制分子质量校正曲线所用标准品：乙氨酸乙氨酸乙氨酸(189Da)、乙氨酸乙氨酸酪氨酸精氨酸(451Da).杆菌酶(1450Da)、抑肽酶(6500Da)、细胞色素(12500Da)o标准曲线:lgm=-0.2947x6.8583,R2=0.9972(m为分子质量/Da,X为保留时间/min)。将样品组分HP1.C分析的保留时间代入此方程，计算分子质量m。1.3.6 感官评价取一定量1.3.4节获得的冻干微分以及一定量的原始鸡汤除脂冻干粉
9、，加蒸储水配成质量浓度Iomgm1.的溶液，待分析。感官评价小组由6位经培训后筛选出的具有感官分析经验的成员组成，年龄在2127周岁，其中男性3人，女性3人。滋味评价描述词为：鲜味、甜味、苦味、咸味、醇厚感和持续性。滋味强度分为5个等级：无味、弱、一般、较强、强。评价小组成员先用纯净水漱口后，取23m1.样品置于口中，15s后吐出，2个样品评价时间间隔2min。1.3.7 MA1.DI-TOFMS分析经葡聚糖凝胶柱分离收集的2#峰馈分冻干的样品，加蒸储水配成10mg/m1.溶液。5800型MA1.DMrOFMS仪，以60%乙月青溶液配制的饱和-氟基4羟基肉桂酸溶液作为基质，将基质溶液与样品溶液
10、1：1（V/V）混合，取l1.点在MA1.Dl靶板上，在室温下自然干燥“一级质谱分析：激光光源为固态激光光源，脉冲加速电压7kV,波长349nm,采用正离子反射模式采集数据，分子质量扫描范围2003000u。二级质谱（MS/MS）分析：选择一级谱中强度高的母离子峰（m/z522.5616、550.5925、888.0854和935.9778）,加速电压2kV,采用ClD碰撞裂解获取母离子的离子碎片。根据母离子及其碎片峰，推测呈味肽组分结构。1.4数据处理图表采用MiCrOSOftExcel2017软件绘制。游离氨基酸、核甘酸含量均为3次测定结果的平均值。各种氨基酸的呈味特性参照文献9。游离氨基
11、酸或呈味核甘酸的滋味活性值（tasteactivevalue,TAV）,采用测定浓度除以阈值计算得到,氨基酸、核昔酸的呈味阈值参考文献。2结果与分析2.1 鸡汤的游离氨基酸组成如表1所示，按照滋味类型，分为鲜、甜、苦、无味氨基酸。鸡汤中质量浓度最高的为丙氨酸（60.79mg100m1.）,其次为酪氨酸（54.84mg/100m1.）、谷氨酸（53.66mg100m1.）等，其中鲜、甜味氨基酸总量为201.75mg/100m1.,占比为54.52%；苦味氨基酸总量为127.58mg/m1.,占比为34.47%。据报道6,滋味鲜美的黄羽鸡炖煮鸡汤中，含量最高的为赖氨酸，其次为谷氨酸，而鲜甜味氨基酸
12、占比（49.28%）也远高于苦味氨基酸占比（8.45%）,与炖煮北京油鸡鸡汤一致。但炖煮三黄鸡鸡汤与北京油鸡鸡汤不同，其含量最高的为组氨酸，其次为谷氨酸、丙氨酸，而鲜甜味氨基酸占比为39.85%,苦味氨基酸占比4810%8,即苦味氨基酸占比高于鲜甜味氨基酸。以上游离氨基酸组成的特点可能是造成北京油鸡鸡汤滋味佳的原因之一。翅某酸质证浓度/(mg/100m1.)TAVMKft/(mg/100m1.)鲜味大冬荻酸26.330.930.26100谷氨酸53.66l.9l1.7930甜味丝气酸27.830.630.19ISO苏氨酸21.30l.790.08260甘氨酸11.850.300.09130丙氨
13、酸60.790.801.0160小计（蚱、甜味）201.756.363.42苦味缎男酸18.841.050.4740甲破秋酸6.413.580.2130异亮亚酸5.503.80.0690亮氨酸I3.62I.I80.07190茶丙l酸4.291.320.0590组氨酸13.805.740.6920酪氨酸54.840.36精氨酸10.272.090.2150小计（苦味）127.5619.111.76无味腼犯酸7.826.440.03300胱四酸3.602.64赖疑酸29.352.190.5950小计（无味）4O.77I1.270.61总计370.0836.745.80表1鸡汤中游离氨基酸组成Tab
14、le1Compositionoffreeaminoacidsinchickenbroth物质对滋味的贡献可采用TAV进行评估，一般TAV值大于1时，该成分对样品滋味有贡献；当TAV值小于1时，该成分对样品滋味几乎无贡献。由表1可知，所有氨基酸中，仅鲜、甜味氨基酸谷氨酸和丙氨酸的TAV值大于1,分别为1.79和1.01,说明二者对鸡汤滋味贡献大。苦味氨基酸中的最高TAV值仅为0.69（组氨酸），且异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸TAV值均很小（V0l）.另外，鲜、甜味氨基酸TAV值总和大于苦味氨基酸TAV值总和。以上TAV分析进一步表明，鲜甜味游离氨基酸占比高可能是北京油鸡鸡汤有较强鲜味的原因之一。2
15、.2 鸡汤中核苜酸含量核甘酸是肉中主要呈鲜味物质之一，其中代表性呈鲜味核甘酸主要为5。AMP、5MMP和5z-GMP10o核甘酸常采用C18反相色谱柱方法测定1113,如QiJun等先采用高氯酸溶液前处理，然后C18反相色谱柱分析了黄羽鸡炖煮鸡汤的核甘酸组成。C18反相色谱柱方法缺陷是使用磷酸盐溶液作流动相，不利于液相色谱泵的寿命，且对于有些样品分离效果欠佳14。Amide柱采用键合酰胺官能团固定相，分离机理为近年发展的替代反相色谱，用于强极性亲水性化合物分离的亲水作用色谱（hydrophilicinteractionliquidchromatography,HI1.IC）模式。常使用有机溶剂
16、水作流动相，能较好地分离极性化合物如氨基酸和核酸等15-16。本实验尝试用Amide柱，以乙月青甲酸较为流动相对未经前处理的样品中的5。AMP、5FMP和5。GMP进行分析，所得HP1.C图见图1,测定结果如表2,可知样品组分得到了较好分离，且基质干扰较小。进一步在所测定核甘酸含量范围，采用加标回收方法验证准确性，得出3种核昔酸的加标回收率为93.5%IOl.3%,表明此分析方法可靠。图1鸡汤中3种核昔酸含量的HP1.C图Fig.1HP1.CchromatogramsofthreenucleotidesinchickenbrothWa献nl00m1.W5WnJ-5UI-JWlltfh孰aJ川3
17、WUflIW%112S闺I143e理SSFJlASlMM1.I5ft11Iu3337.55(x2).392.46(ZJ)2X21.eujValjGln2Tyrab25550.590OM+H,71.81(a,).241.52(y,)、308.29(bj),312.07(y3)434,45.)乙y力VaUHisaHis-Scralb,888.080OM+H,286.51(a,)321.79(%)、676.64(C6).714.77(、843.10(x7)1*yiAla5kDa和13kDa的肽组分含量高，二者占比达85.85%,但采用葡聚糖凝胶色谱分离收集馈分,发现鲜味、醇厚感和持续性均最强的组分主
18、要为寡肽类(V3kDa),占比达84.29%。对最强的呈味储分采用MA1.Di-TOFMS/MS分析,鉴定出4个肽,分别为1.eu-Val-Gln-TyrVal-HiS-AIa-HiS-Ser、Ala-Gln-Asn-Ser-Tyr-Pro-His-Ala和Ala-Glu-Gln-Tyr-Arg-1.eu-Val-Glye因主要由谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸等鲜甜味氨基酸构成，推测可能对鸡汤鲜味有贡献。附参考资料：北京油鸡煲汤过程中鸡汤的风味变化北京油鸡一宰杀，去内脏、鸡头、鸡脖、鸡爪一切块一焯水!成品鸡汤小火慢炖大火煮沸一加水和盐沥干图1北京油鸡鸡汤的制备工艺流程图Eig.1ProCesSflo
19、wchartfortheproductionofBeijing-Youchickenbroth0.0h1号传感器6号传感器图3电子鼻传感器对北京油鸡鸡汤的响应雷达图Fig.3RadarchartofelectronicnosesensorresponsestoBeijing-YouchickenbrothcookedfbrdifferentdurationscH4*Mfl-uin31二十1.mo-.*44b*lKltftMMIR*al*U1.11MMT”二”口MFitMWFtM川HlIU*tlXrtaFtMWtWMttMIiBtminMBt3lMItMMWW二HlBWf日MJfltfWW(XM
20、IHXHdUU如MMWwm。认“修总XBAIfHIMMItMIHIWl-mn-*u!- -6Katta-di- flftJB-ihimH- IMialfUHW-Jh-CtMI-uHir-t11虹-Mtr-231W-的”IfsertHrostterKef-3iHWif-4WtW-ibm11,mr-IXiw-2M3- -W2tJ-UTiM-ot-MBKifIeMlrTJJterMmlrihj,UM0-i11H4J,BWT-UMfl- -U)Mn-USiUi-CHKAMtU-U2M-2MilSt-U9AWPtr-gMetor-in-IDiUfMSMUtVHtfMHC*-ICitMR-tiHt2Ull
21、-=HtUIRMmyAatuMitH-1.lH211HV-5”好-itur刮/-liUfMaKfr-CtfHTft3H5H0BalItOtUT-St3-noiurt4uMttufmtturutjr6”“XlMMfTJJtlJf*t9-IAHJr-J9Hi-OAHxR)%5腺昔酸(5-adenosinemonophosphate,AMP)、5鸟昔酸(5-guanosinemonophosphate,GMP)标准品科技有限公司;37种脂肪酸标准品、正庚烷、异辛烷、2甲基3庚酮、十一碳酸甘油三酯美国Sigma公司;庚烷磺酸钠、三氟化硼二水合物化工产品有限责任公司。1.2 仪器与设备pibONeH20
22、01电磁炉电器有限公司;DZQ4002D真空包装机轻工机械公司;电子秤电器有限公司;41.陶瓷砂锅陶瓷有限公司;AY220万分之一电子天平日本ShimadZU公司;BS210S百分之一天平天平仪器厂;移液器德国EPPendorf公司;DK-8B电热恒温水槽精密实验设备有限公司;1260超高效液相色谱仪、7890-5977B气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometry)仪(配备DVBCARPDMS萃取头(50/30m,2cm,灰色)美国Agilent公司;1.-8900氨基酸自动分析仪日立高新技术公司;ASrreeH/1.S16电子舌法国AlphaMO
23、S公司;PEN3电子鼻德国AirSenSe公司;G1.20G冷冻离心机科学仪器厂。1.3 方法1.3.1 鸡汤的制备北京油鸡鸡汤制备工艺如图1所示。操作要点：切块：切块前去除鸡头、鸡脖和鸡爪，以其余胴体为原料，将鸡翅、鸡琵琶腿及其他部分分别切块，大小约为3cm3cm3cm丁焯水：将鸡翅、鸡琵琶腿和其他部分分别焯水，焯水时间60s,水温100e沥干：将焯过水的鸡肉置于滤水筛中沥干，分别取40g鸡翅肉、80g鸡腿肉和380g其他部位肉置于砂锅中;加水和盐：料水比1：4.5(mV),加盐量0.4%(以鸡肉和水总质量为基准)；大火煮沸、小火慢炖：采用240C高温煮沸，小火煲汤，煲汤时间共3.5h(水烧
24、开计为Oh,采用电磁炉进行加热，240对应1600W,小火对应400W)o取样时间点为煲汤0.0、1.0、2.0、3.0、3.5ho1.3.2 电子舌检测参照张璨琳等14的方法并略作改动。取鸡汤20m1.,水浴加热到50C,进行电子舌测定，每个样品重更测定56次，数据采集时间为180s,以水为清洗溶液清洗20s。鸡汤酸味、咸味、鲜味响应值分别由AHS-SoUmess、CTS_saltiness和NMS_umami探头测定。1.3.3 呈味核甘酸含量测定参照杨肖等口5的方法并略做改动。取鸡汤5m1.,8000rmin4离心IOmin,取上清液进行冷冻干燥过夜，得到冻干粉后用5m1.超纯水溶解，然
25、后将溶液过0.45m滤膜，贮存于4冰箱中待检测。核甘酸的液相分析条件为：C18色谱柱(46mm250mm,5m);柱温25C;检测器:紫外检测器;检测波长254nm;流动相：流动相A为甲醇、流动相B为磷酸二氢钾溶液(0.1mol1.),采用梯度洗脱：。12min,100%B;1215min,90%B;1519min,50%B;1926min,100%B;流速1m1./min;进样量101.;每个样品分别测定3次。标准曲线的绘制：采用外标法进行定量分析，配制IMP、Hx、HxR、AMP和GMP标准混合溶液，每种物质的质量浓度梯度均分别为1、50、100.150、200、250mg1.0将不同质量
26、浓度的呈味核昔酸标准溶液在相同条件下进样,将得到的色谱图峰面积对质量浓度进行作图，绘制5种核甘酸的标准曲线。参照YamaglJChi等16的方法，采用滋味活性值(tasteactivevalue,TAV)对呈味核甘酸的滋味进行评价，呈味核甘酸TAV按式(1)计算。(1)1.3.4游离氨基酸含量测定和滋味评价参照丁奇等口刀的方法并略做改动。取鸡汤5m1.,8000rmin.4离心IOmin,取上清液进行冷冻干燥过夜，得到冻干粉后用氨基酸分析仪专用缓冲液溶解，过0.45Hm水系滤膜，采用氨基酸自动分析仪测定样品中游离氨基酸含量。参照Rotzoll等18的方法,采用TAV对氨基酸的滋味进行评价,呈味
27、氨基酸TAV按式(2)计算。(2)1.3.5 电子鼻检测参照邙格灵等19的方法并略作改动。取5m1.鸡汤，置于15m1.顶空萃取瓶中，50水浴加热，然后使用电子鼻进行检测，电子鼻参数为：样品间隔时间1s,清洗时间60s,归零时间Ie)S,样品准备时间5s,测定时间98s,载气流速200mlmin,进样流速200m1.min(,10种传感器所对应的相应物质敏感程度为：1号传感器：对芳香成分、苯类敏感;2号传感器：对氮氧化合物敏感;3号传感器：对芳香成分、氨类敏感;4号传感器：对氧化物敏感;5号传感器：对短链烷烧、芳香成分敏感;6号传感器：对甲基类成分敏感;7号传感器：对硫化物敏感;8号传感器：对
28、醇类、醛酮类成分敏感;9号传感器：对芳香成分敏感;10号传感器：对长链烷烧敏感。1.3.6 挥发性风味物质含量测定参照张慢20、FanMengdie21等的方法并略做改动，采用固相微萃取-GC-MS(solidphasemicroextraction-GC-MS,SPME-GC-MS)法检测鸡汤的挥发性风味物质。SPME条件：取5m1.鸡汤，置于15m1.顶空萃取瓶中，将老化好的固相微萃取头插入顶空瓶中，50条件下振摇萃取吸附30min,在进样口处解吸，并进行测定。GC条件:DB5MS弹性毛细管柱(30.0m0.25mm,0.25m);载气为氮气,不分流，流速Im1.min;进样口温度250C
29、,解吸时间5min;程序升温:初温40,保持2min;以5min升至90C,保持5min;再以8C/min升至250,保持2min。MS条件：电子轰击离子源;传输线温度280C,离子源温度230;四极杆温度150;电子能量70eV;溶剂延迟3min;单离子检测扫描模式。定性及定量分析：根据计算机谱库(NISTO5、NIST05s)进行化合物的质谱鉴定，检测出挥发性成分匹配度大于85%的化合物;采用峰面积归一法进行定量分析。1.4数据处理利用SPSS25.0软件对数据进行方差分析，并应用DUnCanS法进行多重比较，分析结果的差异显著性。2结果与分析2.1 煲汤时间对鸡汤滋味的影响注：同列小写字
30、母不同，表示差异显著(P0.05)o表2同。由表1可知，煲浸过程中鸡汤的酸味和咸味在一直增加，鸡汤咸味增加是由于煲汤过程中水分不断挥发(水分蒸发量(0260.02)kgh),而盐留在锅内浓缩，导致咸味一直增加。鸡汤酸味的增加可能是由于在煲汤过程中鸡汤中的含硫氨基酸甲硫氨酸、牛磺酸等含量增加22O而鸡汤的鲜味开始时增加，然后略有下降(P005),在煲汤结束时鲜味达到最高值。2.2 煲汤过程中鸡汤的呈味核甘酸含量及TAV变化呈味核苜酸是肉类重要的滋味呈味物质。IMP是一种鲜味化合物，是衡量肉鲜味的重要指标，IMP可以与谷氨酸单钠结合产生协同效应23。由表2可知，煲汤过程中鸡汤的呈味核甘酸GMP和AMP含量均上升，IMP含量先上升后下降，这可能是由于随着煲汤时间延长
