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1、团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据广西标准化协会关于下达2023年第四十五批团体标准制修订项目计划的通知（桂标协（2023）157号）文件精神，由梧州市食品药品检验所提出，广西梧州圣源茶业有限公司、广西梧州芙叶茶叶股份有限公司、梧州市天誉茶业有限公司、广西速溶六堡茶工程技术研究中心共同起草的团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法（项目编号：2023-4502）0二、项目背景及目的意义（一）背景为贯彻落实习近平总书记重要指示精神，广西壮族自治区人民政府提出促进广西茶产业商质量发展的战略部署，经自治区政府同意，自治区农业农村厅印发了
2、加快推进广西六堡茶及特色优势茶产业高质量发展实施方案，明确把梧州六堡茶作为核心重点打造，力争到2025年，综合产值突破100O亿元，其中梧州六堡茶综合产值达到550亿元。2021年12月，格州市相继出台了梧州市六堡茶文化保护条例梧州六堡茶产业高质量发展三年行动计划（2021-2023年）梧州市支持六堡茶茶园建设政策等政策法规，为六堡茶产业高质量发展提供政策保障，对六堡茶全产业链的各个环节均给予政策、资金支持。梧州市第十四次党代会及“两会”均专门提出要大力发展六堡茶产业，实施六堡茶产业发展行动计划，从茶苗、茶园、茶企、茶师、茶市、茶城六大关键环节着手，系统推进六堡茶产业做大做强，实现六堡茶销全国
3、、卖全球。决心要把梧州六堡茶产业打造成为广西茶产业的“半壁江山(一)目的意义茶色素由茶叶中儿茶素及其衍生物氧化而成，其中水溶性产物茶黄素、茶红素和茶褐素，与茶汤的色泽、滋味和香气有着密切关系。茶红素是儿茶素和茶黄素等氧化缩聚而形成的高聚物，茶褐素是由茶多酚、茶黄素和茶红素进一步氧化聚合形成的高聚物，茶红素和茶褐素都属于多酚类物质，具有酚类物质特性，含有羟基、陵基、烷基和苯环类似物，其化学性较为稳定，具有较强的耐氧化性。茶色素具有较强的抗氧化能力和清除自由基功能，茶红素可升高血清中高密度脂蛋白、降低血脂和血清中低密度脂蛋白，具有对逆转录痞毒的逆转录幅及各种细胞的DNA和RNA聚合酶活性的抑制作用
4、，还具有溶解血管沉积物的作用。茶褐素具有增加血管韧性和弹性、修复血管内膜、防治高血压、治疗糖尿痞的作用。在六堡茶发酵过程中，茶红素和茶褐素的含量是评价黑茶发酵程度的重要指标，茶褐素含量与六堡茶的品质呈显著的正相关，加工过程中随着六堡茶涯堆时间的延长逐渐积累。不同级别和不同地区不同企业生产的六堡茶中茶红素茶褐素含量有较大差异，本标准的制定，能为测定不同茶样的茶红素茶褐素含量提供有效的技术支撑，使企业能利用茶红素茶褐素独特的多重药理功效，生产出更高品质的六堡茶产品，较大的程度提高富含该物质的六堡茶的市场占有率，具有极高的市场发展前景。（三）必要性目前茶叶中茶红素、茶褐素的测定方法在检验标准和论文研
5、究中主要有四种：1.分光光度法：传统常用的紫外分光光度法，通过检测茶叶在特定波长下的吸光度来确定其中茶红素和茶褐素的含量；2.高效液相色谱法：通过液相分离技术，DAD检测器的测定，能准确的测定茶红素和茶褐素的含量；3.毛细管电泳法：是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术,具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品少的特点；4.质谱法：顶空气相色谱-质谱联用法是一种高灵敏度的分析技术，用于测定茶叶中茶红素、茶褐素具有高选择性和高准确性的特点。农业农村部制定的农业行业推荐标准NY/T3675-2020红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法是国内唯一一个对于茶叶中茶红素茶褐素
6、进行测定的检骁标准，其基质为红茶，六堡茶属于黑茶，由于茶红素和茶褐素是一类多酚类化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素，其结构和组成复杂，故而红茶与黑茶中茶红素与茶褐素含量组成比例差异较大。目前国内缺少对黑茶中茶红素和茶褐素提取纯化和含量测定技术的研究，制定六堡茶中茶红素和茶褐素的校验方法，能针对六堡茶基质制定前处理提取方法和检测方法，为更好的研究六堡茶中茶红素和茶褐素含量提供检验技术支撑。生产企业通过了解六堡茶中茶红素和茶褐素的含量水平，调整和改进生产工艺以更好生产出高品质的六堡茶产品。三、项目编制过程(一)成立标准编制工作组团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法项目任务下达后，梧
7、州市食品药品检验所等单位成立了标准编制工作组，起草单位制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作。具体标准编制工作由梧州市食品药品检验所、广西梧州圣源茶业有限公司、广西梧州芙叶茶叶股份有限公司、梧州市天誉茶业有限公司、广西速溶六堡茶工程技术研究中心等起草单位组成标准编制工作组，编制工作组下设三个组，分别是资料收集组、草案编写组、标准实施组。资料收集组负责国内外有关六堡茶中茶红素、茶褐素的测定，紫外分光光度法的文献资料的查询、收集和整理工作，查阅前人对六堡茶中茶红素、茶褐素的测定，紫外分光光度法研究情况和进展。草案编写组负责起草标准草案、征求意见稿和标准编制说
8、明、送审稿及编制说明的编写工作，包括后期召开征求意见会、网上征求意见，以及标准的不断修改和完善。标准实施组负责六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法团体标准发布后，组织科研院所、相关企业开展标准宣贯培训会，对标准进行详细解读，让相关人员了解标准，并根据标准对六堡茶中花青素的测定进行规范化操作，保证方法的准确性，并对标准实施情况进行总结分析，不断对团体标准提出修正意见。(一)收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关花青素检测相关文献资料。主要有：NYfT3675-2020红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法；专利申请公布号：CN114397260A六堡茶中茶褐素含量的测定方法；CN1
9、12945672A一种测定普洱速溶茶中茶褐素的方法；CN107821687A一种茶红素的制备方法()研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为方法原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、分析步骤、结果计算、精密度。（四）形成草案、征求意见稿2023年1月11月标准编制组经过大量文献调研和基础实验，建立了六堡茶中茶红素和茶褐素测定的紫外可见分光光度法，2024年1月，组织了三家有资质的实验室进行方法验证，于2024年2月收回了全部的骁证报告，
10、在此基础上进行了数据的汇总和分析整理工作。2023年11月2024年2月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有参考资料中有关检测方法，并结合前期实验的实验结果，按照简化、统一等原则编制完成团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度（草案）。2024年2月2024年4月，标准编制工作组对前期的研究和数据进了整理并结合前期技术咨询会、征求意见会、技术审查会的内容针对该检测方法多次讨论、研究，最终形成团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法（征求意见稿）和编制说明。四、标准制定原则1 .实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析茶红素、茶褐素的检测方法如：分光光度法
11、高效液相色谱（HP1.C）法、液相色谱-串联质谱法（1.C-MS/MS）等，优化六堡茶中茶红素、茶褐素的检测方法，在现有国家、行业标准相关茶红素、茶褐素的检测方法的基础上，结合六堡茶基质的基质特点和提取方法起草的。符合当前六堡茶质量检测的要求，填补测定六堡茶中茶红素、茶褐素方法标准的空白，有利于行业的长远发展，具有较强的实用性和可操作性。2 .协调性原则本文件编写过程中注意了紫外分光光度法测定六堡茶中茶红素、茶褐素的技术要求与相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。3 .规范性原则本文件严格按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的要
12、求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。4 .前瞻性原则本文件以的当前茶红素、茶褐素检测方法为基础，通过紫外分光光度法测定六堡茶中茶红素、茶褐素，为六堡茶中茶红素、茶褐素检测提供检验方法，在标准中体现了特色性、前瞻性和先进性，符合提升六堡茶品牌价值的要求，由此衍生的六堡茶新型产品更能成为六堡茶的一项特色增强其品牌市场竞争力。五标准主要内容及依据来源团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法主要章节内容为原理、试剂和材料、仪器和设备、对照品制备、样品测定、结果计算、精密度、定量限。（一）原理试样中茶红素和茶褐素经沸水提取后，茶红素分别用乙酸乙酯、正丁尊和酸化正丁醇进行液液萃取得到测
13、试液，茶褐素用无水乙薛进行液液萃取得到测试液，茶红素于272nm、茶褐素于280nm处测定吸光度，根据标准曲线计算茶红素和茶褐素含量。（二）试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中三级水的要求。在使用前均进行试剂空白实验，满足方法要求才可使用。（三）仪嶷和设备紫外分光光度计（配ICm石英比色皿）0天平:精度OOlmg,0.01go真空冷冻干燥箱。数显恒温水浴锅。离心机:N4500rnin0（四）样品制备按GB/T8303的规定进行试样制备和干物质含量的测定。(五)分析步骤1 .样品测定过程条件优化1.1 萃取剂的要求本标准所使用的萃取剂乙酸乙酯、正丁醇、酸化
14、正丁醇和无水乙醉使用前应将溶剂置ICm石英吸收池中，以空气为空白，于波长280nm期测定其吸光值不得超过().10。1.2 样品量和提取次数先固定料液比为1:10,提取时间为30min,提取温度为100,C,提取次数3次，样品量分别取10g,20g,30g进行提取。以茶褐素加标样品吸光度进行分析，结果见表1。表I样品量和提取次数对茶梅素和标样品定的影响样品量料液比样品吸光度假A提取次数1提取次数2提取次数3IO1:100.53560.52010.5079200.69550.66170.6783500.61330.62550.6121由表1可见，样品量为20g时，样品吸光度值最高，随着提取次数的
15、延长，吸光度没有明显升高，确定样品量为20g,提取次数为1次。1.3 萃取剂用量与样品量的比例先固定样品量为20g,提取时间为30min,提取次数1次，提取温度为100C,料液比分别选择1:10,1:15,1:20,以茶褐素加标样品吸光度进行分析，结果见表2。表2草取剂用量与禅品量的比例对茶惕素和标禅IeIlII定的影1样品(g)率取剂用求(m1.)萃取剂与样品量的比例样品吸光度值A202001:1()0.68053001:150.62584001:200.6764由表2可见，萃取剂与试样的比例为1:10,样品吸光度值最高，提高萃取剂比例，吸光度没有明显升高，从节约试剂和可操作性的角度考虑，确
16、认萃取剂与试样的比例为1:10。1.4 提取时间提取时间是萃取过程的关键环节，直接关系着萃取效果，先固定样品量为20g,料液比为1:10,提取次数I次，提取温度为I(X),C,提取时间分别选择20min,30min,40min,以茶褐素加标样品吸光度进行分析，结果见表3。表3不同提取时间对茶梅素m标样品制定的影嘀样品球(g)暴取剂与样品的比例提取时间(min)样晶吸光度值A201:10200.6008300.7082400.6727由表3可见，提取时间小于30min时，样品的吸光度较低，提取时间为30min时，样品的吸光度达到最高，随着提取时间的延长，吸光度无明显提升，确定提取时间为30min
17、.1.5 提取温度先固定取样量为20g,料液比为1:10,提取时间为30min,提取次数1次，提取温度分别取8(C,90C,100C进行提取，以茶褐素加标样品吸光度进行分析，结果见表4。表4不同提取度对茶H素回收率的影响样品%(g)萃取剂与样品鼠的比例提取湿度CC)样品吸光度值A201:10XO0.6222900.66631000.7149由表4可见，提取温度小于Io(TC时，样品的吸光度较低，提取温度为100C时，样品的吸光度达到最高，确定提取温度为100C。2 .空白试验每批样品(20)应至少做一个实验室空白，测试结果应低于方法检出限。3 .结果计算试样中茶红素和茶褐素的含量按照公式(1)
18、计算：V_(C-Co)XPm10000(1)式中：X茶红素/茶褐素的含量，单位为百分号（%）；C一由标准曲线计算得到的目标化合物的浓度，单位为（gm1.）；8空白试样的浓度，单位为（gm1.）；m一试样的称量质量，单位为克（g）;V定容体积，单位为毫升（m1.）；干物质含量（质量分数）,单位为百分号（）。测定结果以两次测定的算术平均值表示,测定结果保留小数点后一位。4 .实骁室内定量限重熨测定空白提取试剂7次，并计算7次平行测定的标准偏差，按公式（2）计算方法检出限，定量限为检出限乘以系数f（f=103）,结果见表5、6。MD1.=n.,ttwXs（2）式中：MD1.方法检出限；n样品的平行测
19、定次数；自由度为nJ,置信度为99%时的I分布（单侧），3.143；n次平行测定的标准偏差。表5茶缸重检出餐、定崖蹲试数据表平行样品编写吸光度测定伯（10.(XM30.01020.00690.04930.00210.00640.00600.04550.00520.02960.00280.(M)770.00350.009平均值（%/0.022标准偏差S（%）/0.019，值/3.143检出限（%）/0.06定量限（%）/0.2表6茶梅素检出限、定Ift果,试数据表平行样品编号吸光度测定值（%10.00410.03220.()0460.03530.00720.05240.01110.09750.0
20、1050.()9160.00890.07370.00240.017平均值1（%/0.057标准偏差5（%）/0.031，值/3.143检出限（%）/0.1定M黑（%）/0.4由表5、6可见，茶红素方法定量限为0.2%,茶褐素的方法定量限为0.4%。5 .精密度选择低、中、高三个浓度为（2.00、5.00.IO.（X）mgm1.）的加标样品，按样品分析步骤全程序进行测定，每个浓度样品平行测定6次。计算每个浓度的平均值、相对误差，结果见表7、8。表7茶缸索精密度和准确度制定结果测定次数低浓度中浓度高浓度测定结果I1.9234.98410.01222.0015.0119.85531.9554.972
21、10.03141.9724.9669.93051.9694.99510.26761.9945.00310.059平均付工（m1.）1.9694.98810,026相对标准偏叁KS/）（%）1.50.361.4真值浓度C!().255.(X)O.3510.004).50相对误差RE（%）-1.6-0.30.3由表7可见，三个浓度的相对标准偏差为0.36%1.5%,测定浓度在真值浓度范围内，相对误差为-1.6%0.3%。表8茶*素精密度和准确度能定结果测定次数低浓度中浓度高浓度测定结果71.9894.88210.0151.9764.X9710.02952.0115.0139.8932.0055.0
22、159.8632.0195.0()99.88162.0994.94310.0272.0134.92710.03224.97810.013X2.0224.9209.9582.0024.9529.9682.0084.9609.944RSD-1.l1).160.1-1.1-0.680.90-1.2-0.260.14表2-3-2茶福素准确度测试数据汇总表单位：mg,1.样M验证单位1验证第位2验证单位3加标样I加标样2加标样3加标样4加标样S加标样6加标样7加标样8加标样9I2.0254.9(M10.0212.0314.9349.8992.0264.9629.93822.0034.X319.9222.
23、0014.98710.0182.(X)74.9()59.90731.9754.9979.8761.9754.9659.9781.9835.0129.89942.0204.83510.0071.9894.88210.0151.9764.89710.02952.0115.0139.8932.0055.0159.8632.0195.0099.X8I62.0994.94310.0272.0134.92710.0322.0344.97810.013X2.0224.92()9.95S2.()024.9529.9682.0084.9609.944K值浓度(mgl1.)2.000.255.000.35IO.O
24、O0.502.000.255.000.35IO.OO0.502.000.255.0.35I0.000.50RE(%)1.1-1.6-0.420.1()0.96-0.320.40-0.84).56结论：3家实验室对不同浓度的有证标准物质进行测定，茶红素相对误差范围为：-l2%-O.9O%,茶褐素相对误差范围为：-l.6%1.1%。2 .方法验证结论本方法验证采用六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法方法的检出限、精播度和准确度是评价方法水平的主要技术指标，经方法脸证，结果如下：2.1 3家实验室参与了方法验证工作，本课题组在进行方法验证报告数据统计时，异常值的检验和处理按照GB/T63796
25、2009标准进行，在统计分析时未发现异常值，所有数据全部采用，未进行取舍。2.2 方法检出限和测定下限：当样品量为5g,茶红素的萃取液体积为20000m1.、茶红素的萃取液体枳为100OOm1.,使用1Cm比色皿时，茶红素方法检出限的为0.06%、定量限为0.2%,茶红素方法检出限的为0.1%,定量限为0.4%。2.3 方法精密度：3家实验室对不同浓度的样品进行测定，茶红素相对标准偏差RSD范围为：0.51%-1.5%,茶褐素相对标准偏差RSD范围为：0.63%-2.l%.2.4 方法准确度：3家实验室对不同浓度的样品进行测定，测定浓度在其值范围内，茶红素相对误差范围为：-1.2%090%,茶
26、褐素相对误差范围为：”.6%1.I%。2.5 方法精密度和准确度统计结果能满足方法特性指标要求。详细结果见附件一方法脸证报告。七、国内同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系经查阅，与茶红素、茶褐素检测的相关的国家标准、行业标准、地方标准有：NYZT3675-202(H红茶中茶红素和茶褐素含量的测定分光光度法，对于黑茶中茶红素、茶褐素测定仍未有针对性的技术标准和检测方法，相关论文涉及的多数为红茶中茶红素、茶褐素测定的研究，其前处理步骤对基质针对性不够，没有考虑到红茶和黑茶中茶红素、茶相素的不同含量及结合情况，在实际应用时对黑茶中茶红素、茶褐素含量的测定可能会存在提取不完全的情况，同时也没
27、有涉及基质中其他大分子成分对茶红素、茶褐素提取的干扰。本标准利用紫外分光光度法，为黑茶中茶红素、茶褐素的准确定性和定量提供可靠依据。本标准的内容与现行的法律、法规及强制性标准无冲突，标准的编写符合GBT1.12O2O的要求。八、重大分歧求见的处理经过和依据本文件研制过程中无重大分歧意见。九、自我承诺承诺标准内容和各项指标不低于国家强制性标准。也不存在内容或某项指标低于推荐性国家标准的情况。团体标准六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法标准编制工作组2024年4月30日附件一方法验证报告方法验证报告方法名称：六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法项目主编单位：梧州市食品药品检验所脸证单位
28、：玉林市食品药品检验检测中心贺州市检验检测中心安挽伦科技（中国）有限公司项目负贡人及职称：蒋德莉（工程师）通讯地址：梧州市西环路中段198号电话:（）7743823896报告日期：2024年2月29日1 .原始测试数据本方法的3家验证实验室依次为：I-玉林市食品药品检验检测中心、2-贺州市检验检测中心、3-安捷伦科技（中国）有限公司。对六堡茶中茶红素、茶褐素的测定紫外分光光度法进行方法验证的结果进行汇总及统计分析，其结果如下：1.1 实验室基本情况表11参加验证单位仪器情况登记表仪器名称规格里号仪器编号性能状况蛤证单位紫外可见分光光度计岛津UV-2550/良好玉林优品药品检验检测中心紫外可见分
29、光光度计安捷伦Carj60/良好贺州市检5金检测中心紫外可见分光光度计安捷伦Cary60/良好安徒伦科技(中国)有限公M1.2 方法检出限.定量限测试数据重复测定空白提取试剂7次，计算7次平行测定的标准偏差，按公式(2)计算方法检出限，定量限为检出限乘以系数f(f=103),取3家实验室的最大值作为方法检出限。MD1.=Ino的XS式中：MD1.方法检出限；一样品的平行测定次数；/自由度为n/,置信度为99%时的I分布(单侧)；Sn次平行测定的标准偏差。表1-4方法桧出限、定量限测试数据表验证单位：平行样品编号茶红素茶褐索吸光度测定值(%)吸光度测定位(%)I0.00460.0110.0051
30、0.03920.00610.(M20.00390.03030.00370.0080.00820.06840.00540.0310.00950.07850.00390.0100.00830.07060.00420.0100.0I(60.09270.00500.0280.00440.033平均值7(%)/0.020/0.059标准偏差S(%)/0.014/0.025ffi/3.143/3.143检出限(%/0.05/0.08定境限()/0.2/0.3验证单位：2平行样品编号茶红素茶褐素吸光度测定成(%)吸光度测定值(%)10.00630.(M30.00830.07120.00420.0100.00
31、47().03530.00310.0050.00680.04540.00700.0460.01090.09350.00320.0050.00920.07660.00280.(X)40.01010.()9()70.00550.0290.00590.041平均值i(%)/0.020/0.064标准偏差S(%)/0.019/0.024，值/3.143/3.143检出限(%/0.06/0.08定限/0.2/0.3验证单位：3平行样品编号茶红素茶褐素吸光度测定值(%)吸光度测定位(%)10.00750.(M70.00790.09820.00420.0110.00510.03730.00330.0060.
32、00900.06540.00580.0280.01070.09150.00660.(H40.(X)690.04660.00510.0270.0097().07870.290.0050.00330.025平均值7(%)/0.024/0.062标准偏差S(%)/0.018/0.029，值/3.143/3.143检出限(%/0.06/0.1定量限(%)/0.2/0.41.3 方法精密度和准确度测试数据选择低、中、高三个浓度为(2.00、5.00.IO.OOmgm1.)的加标样品，按样品分析步骤全程序，每个浓度样品平行测定6次。分别计算茶红素和茶褐素每个浓度的平均值、标准偏差、相对标准偏差。表1-5鞘
33、密度和准确度测试数据验证单位：样品茶红素茶褐素低浓度中浓度高浓度低浓度中浓度高浓度测定结果I1.9454.97510.0352.0254.9CM10.02122.0075.0219.9622.0034.8319.92231.9734.95510.0191.9754.9979.87641.9995.0069.9212.0204.83510.00751.9614.98210.2182.0115.0139.89361.9855.0139.9072.0994.94310.027平均值I(ms1.)1.9784.99210.0102.0224.9209.958标准偏差Smg1.)0.0210.0250.110.(M20.0780.068相对标准偏左RSD(%)1.10.511.22.11.60.69立值浓度(mg.1.)2.OOO.255.000.3510.000.502.000.255.000.35o.oo0.50相对误差RE(%)-1.1-0.160.11.11.60.42验证单位：2样品茶红素茶褐素低浓度中浓度高浓度低浓度中浓度高浓度测定结果11.9954.852
