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1、ICS11.220CCS841DB51地方标准DBXX/TXXXXXXXX羊乳房炎诊断与防控技术规范Technica1.specificationfordiagnosisandcontro1.ofsheepmastitis（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上.XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施四川省市场监督管理局发布前言III1范固42规？S11引用文件43术语和定义44临床诊断44.1流行病学44.2格床症状45实验室诊断55.1 样本采集与处理55.2 乳汁中体细胞数的检测方法及结果判定5.3 乳房炎试骏（CMT法桧测隐性乳房炎5.4 细
2、菌种属鉴定5.5 PCR鉴定6处置6.1幅床型乳房炎6.1.1隔度对俄牛实施隔周，接触过的用具及环境进行彻底消雨6.1.2治疗6.1.2.1抗感染治疗6.1.2.2对症治疗66.1.2.3辅助性治疗66.1.3病乳的处理66.2隐性乳房炎66.2.1病羊的处置66. 2.2病乳的处置6应严格执行休药期和弃奶规定。67预防66.1 良好的卫生环境67. 2加强饲养管理68；白?亍68. 1房则68. 2方法68. 2.1临床型乳房炎68. 2.2陪性乳房炎78. 3休药期79无害化处理7附录A8A.1金黄色奇萄球菌的检验8A1.1主要试剂和检验方法8A1.2幅的采集8A1.3病原菌的分离培养8A
3、1.4生化签定9A1.5而力试验9A1.6病原Sa的重分离试9A2.色球菌的检验9A2.1主要试剂和试蕤方法9A2.2曲的采集9A23病原崩的分离培养10A2.4生化鉴定10A2.5硼试验10附录B118.1 主要试剂盒材料118.2 操作方法11B3加州乳房炎检测法(CMT)11附录C13-1.jU-X-刖百木文件按照GB/T1.1-2020E标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则3规定起隼。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解择。本文件由四川省市场监督管理局批准发布.本文件起草单位：西南民族大学本文件主要起草人：杨发龙、封海波、张焕容.I1.1.羊乳房炎诊断与防控技术规范1葩
4、围本文件规定了羊乳房炎临床诊断、病原微生初分离鉴定等诊断依据，治疗、无害化处理等防控技术现范.本文件适用于羊乳房炎的诊断、疫情处理、预防与控制.2规楚性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该11期对应的版本适用于本文件：不注11期的引用文件，其嫉新版本（包括所有的撼改单适用于木文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范NY/T2962-2016奶牛乳房炎乳汁中佥黄色简球菌，凝固醍阴性御箱球曲、无乳造球曲分离心定方法NY/T50302016无公害农产品兽药使用准则病死及病害动
5、物无害化处理技术规范（农医发（2017）25号）3术语和定义下列术语和定义适用干本文件.3.1羊乳房炎又称乳腺炎（MaSmiS）.指巩腺祖织的各类型炎疥。主要由稻原微生物引起，临床上又可分为隐性乳房炎（Subciinica1.Mastitis）和临床型乳房炎（C1.inica1.Mastitis）两种.4临床诊断41流行病学羊乳房炎致病菌主要有链球菌、葡筋球菌、大肠埃希氏菌，占乳房炎致病菌总数的80%-90%,病原种类有地域性特点，病晚休可通过挤奶器具、污染的环境，或泌尿生殖道、消化道、乳房以及皮肤黏膜损伤传播，隐性巩房炎发病率在IS%70%Ia床型乳房炎发病率在I%15%,一年四季均可发病。
6、42临床症状临床型乳房炎：乳房肿胀、发硬、发热，乳房皮肤发红，触诊有疼痛；乳腺强部组织弹性降低，硬结：各乳区大小不一，乳房上淋巴结肿大，坚硬，触之有痛形；乳汁排出不畅或困难，泌乳减少或停止：乳汁变性变色,呈黄色,粘稠、有絮状物、乳凝块、血块或乳汁稀薄.隐性乳房炎：泌乳以减少,肉眼观察无明显临床疵状.5实验室诊断实脸室生物安全要求按照GB19489执行.5.1样本采集与处理乳的采券根据NY，T541201.6的规定进行，及细1.的分离评她附录A,5. 2乳汁中体细胞数的检测方法及结果判定可采用乳成分分析仪，也可采用体细胞计数法(详见附录B).5.3乳房炎试的(CMT法)检测隐性乳房炎洋见附录B。
7、5.4细菌种属鉴定按照伯杰细同图定手册3进行生化鉴定,或使用全自动微生物鉴定系统，或16SrRNA君因序列测序分析法，任选一种进行细衡种属鉴定，对疑似金黄色葡葡洋菌、凝固酷阴性葩荀环衡及无乳族球前也可按照NY2962-2016mif.5.5PCR鉴定通过CTAB/NaCI法提取乳汁中致病菌的DNA,具体方法为:取|川.羊乳.10(川()171而离心501而，弃上清，沉淀中加入5O)1.STE201.IO()g.1.SDS.201.IOmgm1.蛋白的K混匀后置于56C水浴消化3h.加入500II1.酚/氯仿/异戊碑25:24:1).混匀后IG(XX)Rmin离心4min“吸上消.加入5001.
8、纸仿：异戊醉(24:11.Io(XX)Wmin离心3min后收上济，加入301.Smok1.的Naa,1000H1.预冷无水乙醉，混匀，1000041而11离心301山，弃上海沉淀中加入5001.700mU1.乙瓶100OOmin离心2min,弃乙醉，时干后向沉淀中加入1001.TE溶解，评.20C保存，引物、PCR反应体系和反应条件见附录Q6处置6.1临床型乳房炎6,1.1隔离对病牛实施隔肉,接触过的用具及环境进行彻底消毒.6.1.2治疗按照对症治疗、局部治疗、抗好染和辅助性治疗相结合的原则对确诊的病羊进行有效的治疗,防止病故扩散.6.1.2.1抗感染治疗选用抗感染约物治疗。治疗前应进行乳汁
9、的采样，进行病惊曲的培养，根据药敢试缝结果选用合适的抗阳药物。1.1.2 .2对症治疗解热、M狒、抗过敏,1.1.3 1.2.3辅助性治疗采用乳房基部封闭、乳房按施、增加挤奶次数、乳房冷敷、外敷药物等缓解乳房的肿胀.1.1.4 病羊乳的处理病羊乳用专用容集中悄毁,产恪执行休药期和弃奶规定.6 .2隐怪乳房炎7 2.1病羊的处置对确诊为隐性乳房炎的病羊先采用隔离观察，刻连续检测CMT呈阳性、乳汁表现异常、产奶以低、反复发作的病羊进行淘汰，干乳前IO大进行隐性乳房炎CMT监iM,时阳性反应在“I”以上的羊及时治疗，干乳前3天再监测一次，阴性反应方可停乳，6. 2.2病羊乳的处置应严格执行休药期和弃
10、奶规定。7预防6.1 良好的卫生环境羊舍、运动场设计合理，空间宽敞，保持阳光充足；羊床保持清沽、干馒，垫草应干、软、消沽、新鲜，雷经常更换。定期对羊舍和运动场进行消毒,乳房炎而发季节应加强消毒，为保持乳房清洁，可以采用0.居新洁尔灭经常擦洗乳房和周边皮肤.7. 2加强饲养管理根据计养需要，在各生产阶段精、粗饲料搭配合理，增加青绿、青贮饲料的饲喂锹，以乱定料，堆持机体最佳生理机能.停乳后要随时检查乳房,发现异常应立即处理：在干妫后期应适当增加精料,适当控制盐和多汁饲料的苗喂麻，在树养管理过程中避免应激.适当增加运动，增强免疫力停8治疗7.1 原则早发现、早治疗，抗曲、消炎、消除病因，选取对衲原曲
11、垓感的药物，兽药的使用应符合NYfrSo302016规定,较严重者可以选取中药琅水内服，7.2 方法8. 2.1施床型乳房炎出现全身症状，体过高于40C的病羊，用非脩体抗炎药进行钝痛、消肿及退烧，I可时选用政常的抗生素治疗；有脱水柱状的病羊应静脉输液补充氯化钠及口服电解质“8. 2.2隐性乳房炎选用敢感抗生素或中兽药等进行治疗。8. 3休药期用抗生素治疗，应按照每种抗生素规定的休药期休药，体药期间产奶应全部废弃，休药结束后经奶样检测无抗后方可混群.9无害化处理按照病死及病出动物无出化处理技术规范(农医发(2017)25号)对病死羊及其乳产M进行无害化处理。附录A（规范性）乳房炎病原菌分盅鉴定方
12、法A. 1金黄色葡萄球函的检验At1主要试剂和检验方法A1.1.1革兰氏染色A1.1.1.1涂片、火焰固定。A1.1.1.2草酸核结晶紫染Imin.草酸就结晶紫染液的足制：溶液A：结晶紫2g,95%酒精20m1.,溶液B：草酸钺0.8g,蒸悔水80m1.将A、B溶液混合，J1.1.游纸过沌后方可使用.A1.1.1.3自来水冲洗.A1.1.14加碘液泡前涂面染约IminA1.1.1.5水洗,用吸水纸吸去水分.A1.1.1.6加95%酒精致洸，并轻轻振动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。At1.1.7沙黄液（稀染2min后，自来水冲洗。干燥，境检,革兰氏阳性苗染色为蓝紫色，革兰氏阴性菌染色为红色.
13、A1.1.2触醐试验取槽理于洁净的试管内或破片上,然后加3%过氧化敏数滴：或直接滴加3%过氧化级于不含血液的细菌培养物中，立即视察结果.有大做气泡产生者为阳性,无则为阴性.A1.13血浆凝固酶试验吸取05m1.兔血浆与0.5m1.金黄色前萄球菌浸液肉汤24h培养物充分混匀.置361C培养.每Ri半小时观察一次，连续视察6h,出现凝网，I1.IJ将小试管帧斜或倒跣时，内容物不流动，判为阳性.同时做阴阳性对照.At2乳样的采集选取出现临床症状（或者怀疑为陷性乳房炎）乳房炎奶牛，先用温水，再用02%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头，采杆在同时进行手指擦拭消毒，每个乳空先挤去头23把奶，以
14、排除污染的杂曲，母头奶牛取乳样3m1.于无曲轧样杯中，待检。A1.3病原菌的分篇培养初步诊断：将少玳乳汁涂片、革兰氏染色、镜检,如发现囤球形革兰氏阳性细储可怀疑为旬旬球的。分高培养：物乳样摇匀，分别取适m接种于昔养肉汤co%血清、窗向琼腑、受康凯琼腑培养基（平板后.置千37C温箱培养24-48h.观察每个平板中细菌生长的情况,记录菌常生长表现.普通琼脂平板上，37-C.2472h培养后,可见到湿润、光滑、限起的圆形金黄色曲落。挑取典型曲落涂片、染色、境检镜检早就应状排列,无芽的、荚腴，直径0,1.m,革兰氏染色阳性）,并挑取单个可疑倒落移掖于肉场和斜面培养及，经37C培养2448h,24h后没
15、有长曲的平板，再用相应的增荫肉汤涂划一次，继续培汴，24-48h后，再作检查,以防流检.招剁余的乳样存放于4匕冰箱内备用.营养肉汤中呈浑浊生长,管底有少埴灰白色沉淀：血液琼器平板中菌落较大.呈金黄色、例形.冏困出现明显的阳溶血。A1.4生化鉴定触醉试骁：粒胸阳性，曲浆被固曲试验：默同侑试验阳性.糖发酵试验：能分解甘曲醵、乳糖、丽荀糖、麦芽精、诙糖.色素产生情况：能产生金黄色色案.A1.5毒力试验将上述经过生化试验赛定的细1?|悬液用灭带生理盐水作适当稀样，对随机分祖的小尺进行腹腔注射接种，接种量为QSm1./只（家兔皮卜接种1.Om1.或者静脓接种0-0.5m1.）,能切致死动物或者内脏出现脓
16、肿可以确定有出力，A1.6病原函的重分离试脸对接种后发病、死亡小鼠（家奴）的肝脏进行病原菌IR分窗.进行菌落涂片、草兰氏染色、显微镜检查,观察所分离菌株是否为惊接种苗.如果是则进一步确定病原衡为金黄色葡葡球菌.A2链球菌的榜验引起临床型乳房炎或者除性乳房炎的就球值常见的有无风链球帝、停乳琏球菌以及乳房链现阳.A2.1主要试剂和试验方法CAMP试验：在血球脂平板上用金黄色他笥球的培养物划条直缥然后将链球前培养勒划条战，与金黄色郁修球菌培养物的划城相互垂直.，但不要接触，二者相距3Smm,各链球曲分离闱划线间跑10-20mm.置37X:淑箱内培养24h后观察结果.在两划线交界处出现箭头样的溶血区为
17、阳性.A22乳样的采集选取出现临床睡状（或者怀疑为防性乳房炎）乳房炎奶牛，先用海水，再用02%新洁尔灭擦洗丸房，最后用70%的酒精擦拭乳头.采样者同时进行手指擦拭消毒.每个乳室先挤去头2-3把奶,以排除污染的杂苗,每头奶牛取乳样3ni1.于无衡乳样杯中，待检.A2.3病原菌的分禹培养初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检，如发现网球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链俅衡.分离培养；将乳样擢匀，分别取透后接种于昔芥肉场（10%加消、鲜血琼厢、麦康凯琼脂培养班（平板）后，置于3TC油箱培养2448h,观察年个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现.普通琼脂平板上.37C,24-72h培养后，未见到菌落
18、.群血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑IH形降起的小阳落，出现溶血现象,如果是溶血则疑为无乳胶球菌,如果为溶血.疑为停乳琏球菌或者乳房鞋球菌.如为溶血,则疑为乳房链球菌.血清肉汤中生长初呈均匀浑浊,管底出现累状沉淀，上得变得透明.挑取典型曲落涂片、染色、统检，镜检如呈球状，短钺状或者长链状排列，无芽胞、英腹，革兰氏染色阳性则疑为跳球闱.A2.4生化签定镜检形态符合陡球菌粕性，口触的试胎阴性细衡，即鉴定为能球菌属细曲，心细曲CAMP试验阳性，不水解七叶甘和马尿酸朋，即鉴定为无乳腔球菌：若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶昔和马尿酸钠即鉴定为铮乳链球菌：若细菌CAMP试验阴性,水解匕叶昔和马尿酸
19、钠,即鉴定为乳房锥球茵。A2.5动物试验对实验动物，只有停乳鞋球菌具有致病性，将其18h制酒肉汤培养物0.5m1.注入小白IU腹腔，或给家免静脉接种I-2m1.可使动物在1周内死亡.对接种后发病、死亡小融（家免）的肝脏进行病朦曲重分离进行曲落涂片、革丝氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种曲,如果是则进一步确定稻原阳为停风能球萧.其他两种链球倒并不能使试脸动物致死。附录B（规范性）乳汁体细胞计数法1.1 主要试剂盒材料美蓝染色液：美蓝乙醉饱和溶液SOm1.（美就2g,95%乙爵100m1.）,10%氢氧化钠溶液0m1.蒸储水100m1.,将上列溶液混合推匀，过泌后备用.二甲米、95%乙
20、解.生物显微镜、段玻片、】01.微量加样器（或移液枪）等.B. 2操作方法B.2.1涂片制备涂布：充分徭匀新鲜乳样,用IOP1.融量加样器吸取中部乳汁K）II1.或用接种环取等量的乳汁，将乳样滴于破片一端中Whff细涂布成约Iem2面积的乳脱（为使于操作,可在破片下塞衬一张硬纸板纸板匕用毛笔划数个面积为ICm2的方格透视.干燥、脱脂、固定:涂好乳膜的玻片于37C温箱中I-燎，然后用：卬苯脱脂5min,再置95%乙醉中固定5IOmine染色：玻片干燥后,用美蓝染色液染色5min.水洗.再用95%乙静脱色数分怦,水洗干燥后慎检.镜检及计数:在生物显微镜油镜下观察（最好用IOX目镜,其视野直径要求为
21、0.016Cm）,计数100个视野内的细胞数,然后用下式计算:SCC=100Nr2.视野面积02=3.1416x（0.016/2）2=0.0（X）2cm2品做钺系数N=IJO.ooo2（）-So0,OooSCC=系数X每个视野的细胞平均数（即细胞总数+100=细胞数m1.乳.B.2.2判定标准Rfi看国际和国内轧品行业的接轨,国内标准也在提卷，一般以每亳升牛奶中含20万个细跑为亚格床乳房炎的临界（ft（+）:超过该位为阳性.低于该值则正常.B3加州乳房炎检测法（CMT）CMT是加州乳房炎试粉的简称，即首先在美国加利福尼亚州使用的一种乳房炎检测试胺,Q1.T法的判定方法和标准见表1.B3.1试剂
22、和方法CMT检测中用到的试剂和方法如下:卜二烷第礴酸钠30X溶解于100Om1.蒸慵水，用2InOI/1.的乳班化钠调节PH至6.4,加入浪平的紫0.1g.即成CMT检验液,取乳房炎诊断盘1只.滴加被检乳2m1.,冷断液2m1.谖缓作同心圆状摆。市华成品Orr诊断试剂或者其他方法的成品试剂，按照说明操作。B.3.2判定标准表1CMY法的判定方法和标;住反应判定被测乳反应状态体细胞数（千/摹升）-隐性混合物品液体状，倾斜检验盘时，流动流蛾，无凝块0-200可疑混合物呈液体状，盘底有微量沉淀物，摇动时消失200-500+弱阳性盘底出现少量黏性沉淀物，非全部形成凝胶状，摇动时，沉淀物散布于盘底，有一
23、定的黏性500-8+阳性全部呈凝胶状，有一定黏性，回转时向心集中，不易散开800-5000*强阳性混合物大部分或全部形成明显的胶状沉淀物，黏稠，几乎完全粘附与盘底，旋转摇动时，沉淀集于中心，难以散开5000附录C(规范性)致病例引物设计及合成表2引物序列信息引物引物序列(5*3)片段大小bp退火温度/CSau327Sau1645Ggacgacattagacgaatcacgggcawtattttctatct131864Sa40Sae445Cgctgaggtttggtgtttacacactcctaccaacgttcttc40560Eco2083Eco2745GCTTGACACTGAACATTGAGGCACTTACTCTTCCGCATT66353PCR反应201.体系：T叫的101.,上、下游引物各0.51.,DNA11.,去离子水81.,反应条件为；95C预变性5min：94C变性30$,退火30$,72C延伸，35个循环；729延伸8min。Ii
