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1、免疫球蛋白M在上皮源性恶性肿瘤及细胞系中表达1免疫球蛋白M在上皮源性恶性肿瘤及细胞系中表达免疫球蛋白M在上皮源性恶性肿瘤及细胞系中表达作者：覃纲，余玲，杨金亮，李祖茂，杨洪斌，文艳君，魏于全，梁传余，田聆【摘要】目的探讨IgM在多种上皮来源恶性肿瘤及肿瘤传代细胞系中的表达状况。方法应用组织芯片技术结合免疫组化SABC法检测IgM在10种上皮源性肿瘤及对应阴性组织中的表达状况，并通过流式细胞仪、间接免疫荧光法检测IgV在8种上皮源性肿瘤及Burkitts淋巴痛(Raji)传代细胞系中的表达。结果IgM在10种上皮来源恶性肿瘤组织及部分对应阴性组织中均有表达,其阳性表达率分别为70.0%和20.0
2、%少壮;0.05)；1硼在8种上皮来源恶性肿瘤传代细胞系及Raji细胞中存在表达，与阴性比照比较差异有统计学意义(P1.t：0.05)0结论IgM在上皮来源恶性肿痛及传代细胞系中存在广泛表达，其意义和机制有待进一步探讨。【关健词】免疫球蛋白V;组织芯片；免疫荧光;上皮性恶性肿瘤；癌细胞系ExpressionofInMnunog1.obu1.inM(IgM)inMu1.tip1.eEpithe1.iogenicMa1.ignantTumorTissueandCarcinomaCe1.1.1.ines2DepartmantofOtorhino1aryngo1ogyandHeadamp;NeckSu
3、rgery,WestChinaHospita1.,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;DepartmentofOtorhino1.aryngo1.ogyandHeadamp;NeckSurgery,Affi1.iatedHospita1.of1.uzhouMedica1.Co1.1.ege.DepartmentofOphtha1.mo1.ogy;DivisionofCancerBiotherapy,StateKey1.aboratoryofBiothcragy,WestChinaHospitai,SichuanUniversityAbstract：Obj
4、ectiveToexaminetheexpression1.eve1.ofimmunogIobu1.inM(IgM)inmu1.tip1.eepithe1.iogenicma1.ignanttumortissueandcarcinomace1.11ines.MethodsTissuemicroarrayandimmunohistochemistrywereuti1.izedtodetecttheexpression1.eve1.ofIgMintenepithc1.iogenicma1.ignanttumortissueandcontro1.negativetissue.Furthermore,
5、f1.owcytometryandindirectedimmunof1.uorescencewereuti1.izedtodetecttheIgMexpression1.eve1.ineightepithe1.ia1.carcinomace1.1.1.inesandtheBurkitts1ymphomace1.11ine(Raji).Resu1.tsIgMwasexpressedina1.1.tenepithe1.iogenicma1.ignanttumortissue.Theovera1.1.positiveexpressionrateofIgMintumortissue(70.0%)was
6、significant1.yhigherthanthatofcontro1.(20.0%)(P1.t;0.05).IgMwasa1.soexpressedinRajiand3eightepithe1.ia1.carcinomace1.1.1.ines.ThepositiveIgMexpressionrateineachtumorce1.1.1inewassignificant1.yhigherthanthatofcontro1.(P1.t;O.05).Conc1.usionIgMishigh1.yexpressedinmu1.tip1.eepiIhe1.iogenicma1.ignanttum
7、ortissueandcarcinomace1.1.1.ineswhencomparedtonegativecontro1.Furtherstudyisnecessarytofu1.Iyunderstandthesignificanceandmechanismsunder1.yingthee1.evatedIgM1.eve1.sinepithe1.iogenicma1.ignanttumors.Keywords：Immunog1.obu1.inM：Tissuemicroarray：Immunof1.uorescence;Epithe1.iogenicma1.ignanttumor;Carcin
8、omace11inesO弓I言正常细胞癌变后出现基因表达及调控异样，可引起很多因子和激素的异位表达。近年来，国内外多个探讨小组发觉非淋巴细胞性恶性肿瘤细胞也能产生免疫球蛋白(ImmUnog1.obUIin,Ig)或免疫球蛋白样物质(Ig(1.ikesubstance)最近，我们应用血清蛋白组学技术从鼻咽癌细胞株CNE1.中筛选出候选肿瘤抗原膜结合型IgM1.为了明确Igv在鼻咽癌病理过程中的作用，我们对TgM在鼻咽癌组织及相应细胞中的表达进行了探讨，并进一步视察了IgM在上皮来源恶性肿痛组织及传代细胞系中的表达状况。4本文对后面部分探讨内容进行报道。1材料与方法1.1.组织芯片及细胞系多种器官
9、肿痛与癌旁正常组织组合芯片购自西安超英生物科技有限公司，编号CCOO(U,点样直径1.5mm,点阵总数60。分为两组，即恶性肿瘤组和正常组织组，恶性肿痛组30例，包括食管鳞癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肝细胞性肝癌、肺鳞癌、肾透亮细胞癌、乳腺非浸涧性导管癌、宫颈鳞癌、卵巢乳头状腺癌10种上皮来源恶性肿瘤，每种肿瘤均为3例病例，患者年龄2982岁，平均54.9岁，男16例，女14例：正常组织组30例，为肿瘤来源器官的正常组织，年龄3173岁，平均52.4岁，男13例，女17例。人结肠癌细胞系SW480,人卵巢癌细胞系SK(OS(3,人肝癌细胞系HepH(2,人乳腺癌细胞系MCF(7,人鼻咽癌细
10、胞系CNE(1,人宫颈癌细胞系HeIa,人舌癌细胞系Tca8113,人肺癌细胞系A549,人BUrkittS淋巴瘤细胞系Raji均为本试验室保存。1.2 主要试剂及仪器兔抗人IgM多克隆抗体购自美国1.bsision公司，fitc标记猪抗兔IgH购自美国DAKo公司。即用型兔抗人SABC试剂盒购自武汉博士镌生物工程有限公司，DAB显色试剂盒购H北京中杉金桥生物技术有限公司。RPMI(1640及DMEM培育基购自美国HibicoBR1.公司；流式细胞仪为美国Beckman(CouIter公司产品,型号EPICS5E1.ITEESPo1.3 试验方法1.3.1免疫组化采用链霉亲和素生物素法(Str
11、ePtAVidin(BiotinCOmP1.eX,SABC),切片常规脱蜡至水，3%H202室温封闭20min,微波抗原热修复，加热至沸腾断电，间隔IOmin后重复一次，滴加5%BSA室温封闭30min,加入兔抗人IgM(I：400)4C过夜，PBS洗3次后滴加生物素化山羊抗兔IgH,室温20min,PBS洗3次，加入SABC室温20min,PBS洗4次，DAB室温显色，镜下限制反应时间，自来水冲洗终止显色，充分水洗后，苏木素轻度复染，常规脱水、透亮，中性树胶封片视察。以扁桃体切片作为阳性比照，见图1,PBS代替一抗作为阴性比照。1.1.1 3.2免疫组化结果推断由两位病理医生通过O1.YMP
12、USBX60显微镜放大400倍，并应用NikonEC1.IPSEE600图像采集系统及SPOT软件，在显示器上视察每个组织点阵，细胞浆和(或)细胞膜见到棕黄色染色的细胞计为阳性细胞，计算肿瘤或阴性组织中阳性细胞数占全部肿痛或阴性组织细胞数的百分率，参考邱晓彦2的标准，以百分率10%计为染色结果阳性，无染色或染色细胞比例V10%计为阴性。1.3.3 细胞培育SW480、A549、MCF(7、He1.a、CNE(1、TCa8113、Raji细胞用含10%胎牛血清，100Um1.青霉素和100Um1.链霉素的RPMI(1640培育基，于37C,5%C02饱6和湿度的细胞培育箱中常规培育；HePH(2
13、、SK(OS(3细胞用含10%胎牛血清，100UAn1.青霉素和100Um1.链霉素的DMEM培育基,于37C,素C02饱和湿度的细胞培育箱中常规培育。选用对数生长期细胞进行试验。1.3.4 流式细胞仪间接法免疫荧光检测IgM表达收集细胞，调整细胞浓度为1106,祸多聚甲醛固定，4C过夜，PBS洗2次后，加入0.%皂素2001细胞膜打孔，室温IOmin.PBS洗涤2次，时胎牛血清室温封闭20min后，加入兔抗人IgM抗体(1：400)室温60min,PBS洗涤2次，加入FITC标记猪抗兔二抗(1：40),室温避光20min,PBS洗涤2次后，重悬细胞于5001PBS中，上机检测。阴性比照组加等
14、量的PBS代替一抗，其余操作同前。Raji细胞为B细胞来源的淋巴瘤细胞，本试验将其作为阳性比照。以荧光阳性率比较表达水平的差别。1.4统计学处理IgM染色阳性率及免疫荧光阳性率比较采纳四格表资料2检验，并在SPSS1.1.0统计软件中进行统计学处理，检验水准=0.05O2结果2.1上皮来源恶性肿楠组织表达IgM本组30例上皮来源恶性肿瘤中，21例IgM染色阳性，阳性部位主要在胞浆，仅有1例肺高分化鳞癌及1例肾透亮细胞癌胞膜阳性。其中,食管癌3例均为阳性(3/3,100%),见图2。胃癌1例为未分7化腺癌阳性(1/3,33.3%),结肠癌2例为高分化腺癌阳性(2/3,66.7%),见图3o直肠癌
15、1例中为分化腺癌阳性(1/3,33.3%),肝癌1例高分化及1例中分化肝细胞性肝癌阳性(2/3,66.7%),见图4。肺癌高、中、低分化鳞癌各1例均为阳性(3/3,100%),见图5o肾透亮细胞癌1例阳性(3,33.3粉，乳腺3例非特别性浸润性导管癌均为阳性(3/3,100%),见图6。宫颈3例低分化鳞癌均为阳性(3/3,100%),卵巢癌2例低分化浆液性乳头状腺癌阳性(2/3,66.7吩，总阳性率70.0%IgM表达与肿瘤分级无关(Pgt;0.05)。对应30例正常组织中，6例IgM染色阳性，阳性部位除2例食管粘膜鳞状上皮为膜阳性外，其余4例均为浆阳性。其中，食管粘膜2例阳性(2/3,66.
16、7%),胃粘膜组织1例胃底腺上皮阳性(1/3,33.3%),结肠粘膜组织1例腺上皮阳性(1/3,33.3%),宜肠粘膜组织1例腺上皮阳性(1/3,33.3%),肝脏组织1例阳性(1/3,33.3%),肺组织3例阴性，肾脏组织3例阴性，乳腺组织6例阴性，卵巢组织3例阴性，总阳性率20.0%。与恶性肿瘤组比较阳性率差异有统计学意义(Pit;0.05)。2.2上皮来源恶性肿瘤细胞系表达IgM应用流式细胞仪间接法免疫荧光检测多种上皮来源恶性肿瘤传代细胞系中IgM的表达，结果如下：SW480细胞荧光阳性率为9.0%,8SK(0S(3为8.4%,HcpH(2为17.8%,MCF(7为13.1%,CNE(1
17、为17.2%,He1.a为25.2%,Tca8113为17.6%,为49为21.0%,Raji为49.4%,分别与阴性比照1.9%比较差异有统计学意义(P1.t:0.05),说明IgM在上述细胞系中均有表达。3探讨传统免疫学理论认为，免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排，转录翻译成有功能的免疫球蛋白，机体的其它细胞一般不表达免疫球蛋白，即Ig是B淋巴细胞的特有产物。但近年来的探讨表明上皮细胞及上皮来源恶性肿瘤有Ig或Ig样物质的表达。Kimoto等3报道在4种上皮来源肿瘤细胞系SW116(人结肠癌）、Hcp（2（人喉鳞癌）、MCF（7及MDA（MB（231（人乳腺癌）中检测到5
18、种免疫球蛋白IgM.IgD.1.gH3,IgHKIgE和IgA基因重链恒定区部格外显子转录的基因片断，并推想可能有相应蛋白质的表达；国内邱晓彦等2分别从蛋白质和rnRN水平证明多种上皮来源肿瘤组织、传代细胞系及部分上皮细胞存在IgH的表达；黎明等4采纳免疫组化、Westernb1.ot及E1.ISA等方法在7种上皮来源肿瘤细胞系蛋白提取液和培育上清中检测到IgA的表达；类似地，汪泱等5采纳免疫组化SP法,分别用鼠抗人IgH,IgD,IgA和IgM单抗对多种上皮来源恶性肿痛组织及其部分传代细胞进行检测，发觉在上述癌组织9及癌细胞中有不同程度的阳性反应。我们探讨发觉上述10种上皮来源恶性肿瘤组织中
19、均存在Igv表达，其阳性表达率70与与汪泱等5报道上皮来源癌组织IgM抗体反应阳性率45.2%的结果有所不同，本探讨还发觉大肠癌、肝癌、胃癌也存在有IgV表达，这种差异可能与肿瘤组织标本选取以及染色结果推断标准有关。通过流式细胞仪间接免疫荧光法检测，我们还发觉IgM在8种上皮来源恶性肿病传代细胞系及RUrkiItS淋巴瘤Raji细胞中存在表达，与汪泱等报道的5种癌细胞系IgV抗体阳性的结论相像，但与黎明等报道的7种上皮来源肿瘤细胞系IgV和IgH抗体表达阴性的结果相反，究其缘由可能与采纳的检测方法和抗体不同有关。此外，在作为比照的30例9种正常组织中，我们发觉2例食管粘膜鳞状上皮，1例胃底腺上
20、皮，2例大肠粘膜腺上皮和1例肝脏组织IgM染色结果阳性，与以往报道结果5有所不同。现有的探讨4,5表明，无论是在肿瘤组织还是传代细胞系，免疫球蛋白异位表达的部位主要位于胞浆，但也有少数位于细胞膜，我们免疫组化检测的结果与此相同，免疫球蛋白出现这种表达部位不同的缘由是否与其功能有关有待进一步探讨证明。有关免疫球蛋白在恶性肿瘤组织和细胞中表达意义及可能机制的探讨才刚刚起步。邱晓彦等6认为肿瘤来源的免疫球蛋白具有生长因子样活性，可促进肿病细胞的生存和生长；普亚等7,8通过同源性比较和基因10分析，证明Tx是一个缺乏S区的异样人类免疫球蛋白kappa轻链基因，认为这种异位表达的Ig可能与肿瘤的恶性转化
21、有关，Tx杂合型可能是鼻咽癌的危急因素；郑树等9,10发觉的新基因SNC73是一个IgA样消化道肿瘤相关基因，它的表达降低或缺乏可能在胃肠道上皮细胞增殖、代谢和突变中发挥作用，但SNC73在大肠癌及正常黏膜的表达与分化程度、侵袭深度和转移等临床病理因素无明显相关性；我们的探讨结果也未发觉IgM表达与肿瘤病理分级存在相关性（Pg1.；005）;BabbagC等11则认为恶性上皮细胞活化诱导胞昔脱氨酶（ACtiVatiOn（inducedcytidinedeaminase,ID）的激活对于Ig重链可变区基因的异位重排和修饰具有潜在作用。我们通过探讨发觉多种上皮来源的恶性肿瘤组织及传代细胞系中存在I
22、gM的广泛表达，但其意义和机制有待进一步探讨。探讨TgM在癌细胞中的表达将为肿痛癌变机制供应新的线索和理论依据，也将为肿痛生物治疗供应新的靶点和探讨方向。致谢:感谢四川高校华西医院生物治疗国家重点试验室(肿痛生物治疗探讨室)陈县城博士后、王炼博士在免疫组化技术及结果推断中的指导和帮助，以及毛咏秋、雷松试验员在流式细胞技术方面的指导。【参考文献】口宋鑫，杨金亮,唐小海,等.应用血清蛋白组学技术筛选鼻咽癌肿瘤抗原U1.中国肿痛生物治疗杂11志,2005,12(2):94(97.2XiaoyanQiu,XiaohuiZhu,1.iangZhang,eta1.HumanEpithe1.ia1.Canc
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24、98,22(1):83(86.4黎明，唐敏，邓锡云，等.上皮来源的肿瘤细胞表达免疫球蛋白J.中华肿瘤杂志,2001,23(6):451(453.5汪泱,张叔人,何祖根，等.免疫球蛋白样物质在上皮来源的恶性肿瘤中的表达J.中国肿瘤临床,2001,28(3):169(171.6邓郁青,郑杰，李国辉,等.免疫球蛋白在结肠癌HT229细胞中的表达及其生物学活性探讨1.n.中华肿瘤杂12志，2006,28：88(91.7任维,黎明，熨林庆,等.鼻咽癌恶性转化基因TX核甘酸序列分析U1.中国生物化学与分子生物学报，2002,18(5):541(547.8RenW,ZhengH,1.iM,eta1.Afun
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