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1、一南大廖CENTRA1.SOUTHUNIVERSITY本科生毕业论文(设计)题目肾移植患者普乐可豆血药浓度与名药耐药基因MDR1.C3435T多态性的关系学生姓名罗佳(UdO1.O1.225)指导老师妓新民学院湘雅医学院医学检验系专业班级援学检验系2001级01班完成时间2006年6月中南高校本科生毕业论文题目：肾移植患者他克英司血药浓度与多药耐药基因MDR1C3435T多态性的关系学生姓名：罗佳指导老师：聂新民(副教授)学院：湘雅医学院医学检验系专业：医学捡脸专业2001级实习单位：中南高校湘雅附三医院检验科完成时间：2006年6月*jt*TMMfJs创东方小枝万科拉攵金大(03823072
2、)fWA*J1.(2OO4O352O6)俄科学*会(303003S3)中南高校本科生毕业论文(设计)任务书及成果评定表题目肾移植患者他克莫司血药浓度与彩药耐药基因MDR1.C3435T多态性的关系学生姓名罗佳(UdoIO1.225)指导老师聂新民学院湘雅医学院医学检验系专业班级庆学检验系2001级01班教务处制:南大老毕业论文（设计）任务书毕业论文（设计）避目：片树的人他克莫国女药机和多药时药四国MDR1.043W多的关,系题目类型川次验研究题目来源教和科研题毕业论文（设计）时间从2005年5月8号至2006年5月毕业论文（设计）内容要求：本探讨是湖南省科技厅科技支配支大项白；中国博士后科学法
3、金：国家自然科学甚金。其详细任务和目标是探讨和探讨肾移植病人他克莫司（Tacro1.imus）血药浓度马彩药耐药基因MDR1.C345T多态性的关系。以便于依据MDR1.基因不同与因型药物代谢的特点，行针对性的调整临床应用的剂员.将仃利丁器仃移植病人的个体用药,目前，在多药耐药基因MDR1.上已发觉些单核用酸岁态性（SNPs）其中一部分可以影响PT蛋白的表达和功能，从而影响其药物在人体内血药浓度。到H前为止，探讨表明在MDR1.第26外显子的3435位点上发生的隐性突变是引起P-糖蛋门在人类组织中表达的多态性的主哽缘由.本探讨旨在探讨他克莫司（TaCrr）Iimus）血药浓度/剂址比个体差异与
4、多药耐药基因MDR1.C3435T多态性的关系本探讨视察66例口服他克莫司（TaerOIi1.nus）的胃移植病人体承、他克莫司（Tacro1.imus）剂量及血药浓度，并利用PCR-限制性片段长度多态性的方法检测患者名药耐药甚因MDR1.3435位C/T多态性，分析药物浓度/剂量比与与因型的关系。分析病人连续的药理学参数变更时，K因型被认为无条件独立参数，采纳非参数统计法分析病人服用他克莫司（TaCrO1.imUS）的日剂量和血药浓度，两组之间比较运用MannThitneyU检验，Porpma%cciMed-iUhg888ionOfCytoChrgeP4503A5QndPF1.yCOPrOt
5、ginCorr88t8Withdoserequirement.Trc8一Pgnt系ion,2002,74(11)；1486893 3Hey1.nJF.RaCiR1.DifferenCeMinren1.tranpIantatisfterimno5uppre噂/ion-ithC-cr。IimUSYersubcycQ3pornej.TransPIantMion,199&65：516-23.FrarfeM,DentonM,AIexsnderS.8a1.BrIXO8。：SPeCifiCVORIP*aIycoproteinbIockedginhib，t8hunnAoinuMT8Iactivationinv
6、itroJJI1.nUnoI,2001,166(4)：2451-59.5 Hoff-everS.BUrkO.VCnRiChterO.FUnCtiOna1.Po1.yroOrPhiGgOfthehunanu1.tidrMreistancKn:mjICp1.6seqgnceVSriS1.ionsandcorreIaCionOfOnoaIIe1.ethP-1.ycoproteinexpressiocandactivityinViVoJProCNat1.ACftdSc，USA,2000,97：3473-78.6 SChagffgrE,EichgIMunM,BrinfciwnnUFrgUCnCyOfC3
7、435TPQ1.yaprphiMofNDR1.inAfriCanPeOPIeJ.1.ancet,2001.358(9279):383-84.7 PUtrWmS,gMHgnyY.EffeCtOftheMDRIC34然IYarIan1.aridP-G1.ycoproteinIndUCtionOnDic1.oxgci1.1.inPgrm8conetic8j.JC1.inPh8r8co1.,2005.45(4):411-21.8 (88biI,Gtr1.offT.JoneA,FrguenpygfSingJ。nuc1.goti*PO1.ynOrPhi制inthgP-R1.ycoproteindrutra
8、nporterIWR1.eneinWhitdsubject*J.C1.ir1.Pharco1.Ther2001.69(3)：1的-74.3.毕业论文（设计）进度支比阶段阶段内容起止时间1定题、查阅文献、试脸设计05.806.32收集标本、科研试脸3.13.213数据整理、结果分析3.274.94论文撰写4.10-5.285答辩及成果评定5.296.10时间：时间:时间：指导老师（签名）教研室（所）主任（谷名）主管院长（签名）毕业论文（设计）成果评定表（一）指导老师评语罗佳同学在湘雅三医院检验科进行毕业实习及毕业论文工作的过程中，能主动参与科室的日常工作及科研活动，工作仔细负贲，组织纪律性强，试
9、验思路清楚，学习仔细刻苦，具有较强的独立工作实力,擅长分析和解决问题，能娴熟地应用计算机，具有肯定的写作实力与综述实力。罗佳同学毕业论文题目来源于中国博士后科学基金项目，采纳分子生物学方法PCR-RF1.P检测患者多药耐药息因MDR1.C3435T多态性，分析药物浓度/剂量比与基因型的关系。探讨表明MDR1.第26位外显子3435位点上的隐性突变是造成血药浓度差异的分子差异缘由。该课题选题新奇，具有肯定的理论及临床应用价值。科研设计合理.，方法先进，所得结果牢靠，结论及分析客观nJ信。罗佳同学毕业论文写作书写规范，格式正确，图表清楚，语句流畅，是一篇优秀的学士学位论文，建议进行本科生毕业论文答
10、辩。建议成果：优秀指导老师年月日毕业论文（设计）成果评定表（二）论文（设计）评阅人评语该论文选题源于指导老师博士后科学基金，是湖南省科技厅支配重大项目，具有科学性和好用意义。他克莫司是种治疗窗狭窄，个体之间效果差异特别大的常见免疫抑制剂。该同学用指导老师提取DNA的标本，抓住不同个体间药物反应和浓度/剂量关系存在的差异，采纳PCK-RE1.P方法检测C3435T（第26外显子）单核甘酸多态性及其与他克莫司血药浓度/剂量比的关系。结果显示：是有助于选择制定平安有效的用药剂量和药物的最优化治疗的。该生论文选题新奇、好用，试验设计合理，方法成熟正确，试验数据可信。该生论文写作符合论文书写基本要求，是
11、一篇优秀的本科生毕业论文。论文（设计）评阅人年一月一日毕业论文（设计）成果评定表（三）答辩记录及看法问题：除了论文中提到的MDRI基因，是否还看到过别的有关这方面报道的基因？回答：参考文献中提到另一个基因CYP3A5,它也是编码P-糖蛋白的一个基因，国外的这个探讨显示了它的多态性是影响TaerO1.imUS代谢个体差异性的主要缘由。但他们的探讨人群仅为高加索人种，且在他们的探讨中未发觉MDR1.在高加索人种中对Tacro1.imus代谢产生影响.答辩看法：该同学论文选题新奇，探讨方法先进，试验数据可信，统计方法正确,分析探讨全面,该同学答辩流利，回答问题正确，.思路清楚。经答辩委员会表决，一样
12、通过答辩，建议授予学士学位。答辩成果：优秀答辩委员会（小组）负责人年一月一日学院领导小组审查看法：成果评定：负责人：年一月一日.中文摘要1ABSTRACT2缩略词3-前言4二材料和方法62.1材料62.2方法62.2.1血标本基因DNA提取62.2.2多态性鉴定62.2.3.IfII药浓度测定72.2.4统计学分析7三结果83.1基因型鉴定83.2甚因型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系8四探讨10五结束语12六参考文献13论文英文版15综述22肾移植患者他克莫司血药浓度与多药耐药基因MDR1.C3435T多态性的关系中文摘要目的I他克莫司是一种治疗窗狭窄，个体之间治疗效果差异特别大的常见免疫抑
13、制剂。本试验试图探讨肾移植患者他克莫司血药浓度与MDR1.博因C3435T多态性的关系。方法，本探讨视察/66例口服他克莫司的肾移植患者的体重、他克莫司剂髭及血药浓度，并利用PCR一限制性片断长度多态性的方法检测患者MDR1.基因3435fC/T多态性，分析浓度/剂量比与基因型的关系。结果：发觉MDR1.基因C3435T多态性与他克莫司血药浓度之间具有相关性，CC型的忠者血药浓度低于携带T等位基因的个体(CC或TT型)，差异具有统计学意义(P0.05).结论：依据MDR1.基因不同基因型药物代谢的特点，有针对性的调整剂量，将有利干器官移植患者个体化用药治疗。关健词：他克莫司，多药耐药基因，基因
14、多态性Tacro1.imusDosinginChineseRena1.TranspIantpatientsIsRe1.atedtoMDR1GeneC3435Tpo1.ymorphismsABSTRACTObjectiveTacro1.imusisanimmunosuppressivedrugwithnarrowtherapeuticrangeandwideinterindividua1.variationinitspharmacokinetics.Theaimofthisstudywastoeva1.uatewhethertheC3435Tpo1.ymorphismwasassociatedw
15、ithtacro1.imusconcentration/doseratioornot.MethodsSix1.y-sixChineserena1.transp1.antpatientswereenro1.1.edinthisstudy.Theirbodyweight,dosageandconcentrationoftacro1.imuswereobserved.MDR1.genotypewasdeterminedbypo1.ymerasechainreactionfo1.1.owedbyrestrictionfranent1.engthpo1.ymorphismana1.ysis.Resu1.
16、tsTheresu1.tshowedthatastatistica1.significancewasfoundbetweentacro1.imus1.eve1.sperdose/kg/dayandMDR1.geneC3435Tpo1.ymorphism(p0.05).TheCCpatientshada1.owtacro1.imus1eve1perdosethantheCT/TTpatients.Conc1.usionsPharmaCOgene1.iCmethodscouIdbeemp1.oyedprospective1.ytohe1.pthedosese1.ectionandtoindivid
17、ua1.izeimmunosppressivetherapyaccordingtotheresu1.t.KEYWORDSTacro1.imus,Mu1.ti-drugresistancegene,Genepo1.ymorphismMDR1:mu1.ti-drugresistancegene多药耐药基因CsA:cyc1.osporine环抱素AP-RP:P-g1.ycoproteinP-糖蛋白SNP:Sing1.enuc1.eotidepo1.ymorphism单核甘酸多态性HGP:HumanGenomeProgram人类基因组支配PCR:Po1.ymerasechainreaction聚合他链
18、反应RF1.P:Restrictionfragment1.engthpo1.ymorphism限制性片断长度多态性-J1.X.一刖三免疫抑制剂在器窗移植中起着极其重要的作用“由众多高效、低毒免疫抑制剂的开发应用，使近年来器官移植的胜利率大大提高。1984年,Fujisawa公司从筑波链霉菌的发酵液中分别得到种新免疫抑制剂。当时试验命名为FK506,后正式命名他克莫司，商品名为普乐可笑(Prograf)虽然其结构与环抱素A(CSA)迥然不同,但其免投抑制特性与CSA类似而且效率更强。它的出现,是器官移植的一重要进展川。他克莫司进入细胞后先与受体蛋白1：KBPI2结合为FK506FKBPI2,此复
19、合物再与钙调璘酸陶高亲和性结合并抑制其活性,最终抑制I1.-2的转录,阻断Ca?.依靠性T细胞的活化途径,T细胞因而受到抑制,从而发挥强大的免疫抑制作用闺。美国多中心肝脏和肾脏探讨显示:他克莫司较CSA在肝移植方面有明显优势，可显著降低急性、耐激素难治性排斥和慢排的发生。在肾移植方面,他克英司也较CsA更明显降低急性排斥和耐激素急性择斥,移植肾失功状况较少,而不良反应及感染发生率并未增加。他克莫司般是口服给药，很少福静脉用药，必要时可鼻胃管绐药，主要在小肠汲取,一般全血或血浆浓度在05-6h达峰，口服生物利用度约25%.他克莫司的血药浓度可用ME1.A法监测,其相宜范用为:术后14-:(13.
20、02.1.)g1.,23个月：(9.41.6)间1?,3个月后:(6.51.3)1.他克莫司的代谢主要通过P450院,凡能抑制该薜活性的药物都可能削减他克莫司的代谢,导致血药浓度增高;反之增加该肺活性的药物均引起他克莫司代谢增加，血药浓度减低)他克莫司与CSA相比,最大的优势是肝脏毒性小,特殊适用于肝功能异样的移植患者以及CsA中毒时的转换治疗和难治性排斥反应。他克莫司的主要不良反应是神经毒性、糖耐fit降低和肾功能减退,一般削减剂量后,症状可以缓解.在临床治疗中，病人对相同的药物反应不完全相同，甚至大相径庭，以前认为是个体差异所致。“人类基因组支配(HGP)的探讨孟明，这些差异都是由于药物相
21、关基因变异，即单核音酸多态性(SNP)引起的。事实上，不同个体的表型差异主要在于SNP,由于SNP变更了个体对药物的代谢及药物结合的受体蛋白的特性，因而确定某种药物是否对个体有效，是否会引起不良反应，这对丁临床医生按个体化用药有重要的意义。他克莫司是广泛应用于器官移植术后抗免疫排斥反应的种重要免疫抑制剂1但是其血药浓度显著的个体差异和狭窄的治疗范围是他克莫司在临床应用中的两个重要影响因素P糖蛋白是多药耐药基因VDR1.编码的蛋白，在他克莫司的汲取和代谢中起着重要的作用。加RI基因多态性影响若P糖蛋白的表达和活性从而影响到他克莫司的汲取和代谢目前，临床实践中仍采纳传统的阅历用药方式，采纳这种给药
22、方式，临床医生须要多次调整，才能找到每例患者的合适剂量，而以药物基因组学为基础的靶向治疗则不同，医生可.以通过对患者的遗传学状况进行分析后，一起先就可以制订出最佳药物剂量。器官移植患并免疫力低下，为防止他克莫司用量不足而发生排斥反应或免疫抑制过度引发感染，找寻影响他克莫司用药相关基因的多态性标记特别具有临床意义。近来，在多药耐药基因MDK1.上己经发觉有几个单核件酸多态性（SNPs）,其中一部分可以影响P糖蛋白的表达和功能I到目前为止，探讨表明多药耐药基因MDRI第26外显子的3435位点发生的隘性突变是引起P-糖蛋白在人类组织中表达的多态性的主要缘由。本探讨旨在探讨他克莫司血药浓度/剂量比个
23、体差异与多药耐药基因VDR1.C3435T多态性的关系。二材料与方法2.1 标本患者血标本收集：本探讨经过中南高校湘雅三医院人权委员会的同意，经患各或其家属的同意,从湘雅三医院器官移植探讨院标本库收集到2002年11月至2004年7月之间的66个肾移植患者的血标本，每个患者收集抗凝静脉血3-7m1.2.2方法2.2 .1血标本基因组DNA抽提采纳上海飞捷公司DNAfaSt500一小量基因组DNA极速抽提试剂盒抽提DNAe操作步骤如下：（1） .取1.-5001.抗凝全血或骨筒放入1.5m1.eppendo取管中,加入DE1.液Inb颠倒混匀3-5次,离心Imin,充分吸弃上清,留下底部细胞团块
24、。（2） .加入DE1.液100u1.,以手腕充分用力振荡10次,确保形成均一的细胞悬液。（3） .加入DE2液600U1.以手腕充分用力振荡20次，室温岸置8-1Omin,中间振荡1次.（4） .将样本裂解物吸入或干脆倒入内套管，离心2min.（5） .弃去外套管中液体，内套管中加入500口I洗液，离心Imin再全复此过程洗一次。（6） .取出内套管,弃去外套管中液体，仍旧套回内套管,不加洗液，离心Imin。（7） .将内套管取出，放入新的eppendOrf管中，在膜中心加入洗脱液5（MTOOH1。（8） .室温放置2min后，离心In1.in,获得基因组DVU2.2.2C3435T多态性的
25、笠定：采纳聚合的链反应限制性片断长度多态性（PeRRF1.p）来检测C3435T（第26外显了）单核甘酸多态性（SNPs）。PCR引物中设计依据已知序列（GenbankaccessionNo：AC005068）设计：正引物5-TTGATGGCAAAGAAATAARGG-3：负引物5-CTTCATTAGGCAGTGACTCG-3、PCR反应条件为：941C预变性4分钟,然后94C30秒、56C30秒、72C30秒进行35个循环，随后72T延长5分钟：PCR反应体系为50口1。扩增的PCR产物经琼脂糖电泳分别，紫外灯下目测结果。2.2.3血药浓度的测定：患者于晚8时服用他克莫司，12h后再次服药前
26、抽血1m1.,150g1.乙二胺四乙酸抗凝。手术6个月后的患者血药浓度用半臼动微粒子配标法IMX分析仪（购自美国雅培公司）测定。统计时将血药浓度结果变换为浓度/剂量比进行分析，即以血药浓度除以每日每公斤体重的他克英司的剂址2.2.4统计学分析：分析患者连续的药理学参数变更时,基因型被认为无条件独立参数。分析患者服用他克莫司的日常剂员和血药浓度时采纳非参数统计方法，两组间的比较运用MannThitneyU检验，PsuppressicithSCrOIim3versuseyeIosporincJTransp1.antation,1998,65(4)：515-238 FrankMDentonM.A1.
27、exanderS,ta1.SpecificWDRIP-gIycoproteinb1.ockadeinhibitshuwanaIIoirwiuneTce1.IactivationinvitroJ.JIrviuno1.,2001.166(4):2451-2459.9陈眩，戋拿却.时官修也至像个体化也或抑制区哈的戊状与展型J】中华外科余3286.44.(3):211-213.10 .HoffneyerS.Burk0,vonRichter0.eta1.Functiona1.POIynOrPhi55ofthehmanmu1.tidr-rsistancegenemu1.tip1.esequencevari
28、ationsandcorre1.ationofone1.withP-Iycoprotinexpressionandactivityinvivoj.ProcNa1.1.AcadSciUSA.2000,97(7):3473-3478.11J.段丽芳，弼宏演.基因林泱另怒药接及其在在床后改学的株讨遗然J,中世行理竽总掖,2005,21(6):645-649.12 .和耳梅，刻学大，李逊龙,住床个体化用用的帐讨比妆和评价M.中国信乐用理学与治疗号.2003,8(2)：237-240.13 .李军，毋向病.张笠.药物基因纨学与也原合理用药.中国苗.2006.20(5):288-289.14 .Schac
29、ffc1.crE.Eichc1.baiwM,BrinkrronnUtcta1.FrequencyofC3435Tpo1.ymorphicofNDR1.RnenAfricanpop1.e(J).1.ancet.2001.358(9279):383-384.15 .PutfwiWS.WooJM.HuangY,Cta1.EffectoftheWD1C3435TVariantandP-IycoprotcinInductiononDic1.oxaci1.IinPherwecokineticsJ).JC1.inPbarmaoo1.2005.45(4):411-421.16 .CascorbiI.Ger1.
30、offT,JoneA.et1.Frequencyofsing1.enueIeotidepo1.y11orphis11sintheP-g1.ycoprotindrugtransporterWDRIgeneinwhite$ubjcctsJ.C1.inPbarciAcoITber,2001,69(3)：169-174.Tacro1.imusDosinginChineseRena1.Transp1.antpatientsisReIatedtoMDR1GeneC3435Tpo1.ymorphisms*1.uoJia1,NicXin-Min,Pcnghui*yanjTheXianfiYaNedca1.Sc
31、hoo1.ofCentra1.SouthUniversity,jTheThirdXiang-YaHospita1.ofCentra1.SouthUniversity)AbstractTacro1.imusisaninununosuppressivedrugwithnarrowtherapeuticrangeandwidein1.erindividua1.variationinitsPharmaCOkine1.ics.P-g1ycoprotein(P-gp)p1.aysanimportantro1.eintheabsorptionormetabo1.ismoftacro1.imus.Thepo1
32、.ymorphismC3435TOfMDK1,thegenecodingP-gp,cou1.dinf1.uencetheexpressionandactivityofP-gp.Theaimofthisstudywastoeva1.uatewhethertheC3435Tpo1.ymorphismwasassociatedwithtacro1.imusconcentration/doseratioornot.SiX1.y-SiXChineserena1.transp1.antpatientswereenro1.1.edinthisstudy.Theirbodyweight,dosageandco
33、ncentrationoftacro1.imuswereobserved.MDK1.genotypewasdeterminedbypo1.ymerasechainreactionfo1.1.owedbyrestrictionfragment1.engthpo1.ymorphismana1.ysis.Theresu1.tshowedthatasignificantassociationwasfoundbetweentacro1.imus1.eve1.sperdose/kg/dayandMDR1.geneC3435Tpo1.ymorphism(p0.05).TheCCpatientshada1.o
34、wtacro1.imus1.eve1.perdosethantheCT/TTpatients.Pharmacogencticmethodscou1.dbeemp1.oyedprospective1.ytohe1.pthedosese1.ectionandIoindividua1.izeimmunosuppressivetherapyaccordingtotheresu1.t.Keywordstacro1.imus,MDR1.1genepo1.ymorphism摘要普乐可笈是种治疗窗狭窄，个体之间效果差异特别大的常见免疫抑制剂.P-糖蛋白是有多药耐药基因皿RI编码的蛋白，在普乐可笑的汲取和代谢中
35、起着重要的作用。MDR1.基因C3435T多态性影响着P糖蛋白的表达和活性。目的探讨肾移植病人普乐可复血药浓度与多药耐药基因MDR1.C3435T多态性的关系。方法本探讨视察了66例口股普乐可更的肾移植忠者的体虫、普乐可复剂量及血药浓度，并利用PCR-限制性片断长度多态性的方法检测患拧MDRI基因3435位C/T多态性，分析浓度/剂量比与基因型的关系结果发觉MDRI基因C3435T多态性与普乐可复血药浓度显著相关(PV005),CC型的病人血药浓度明显低于携带T等位基因的个体(CC或TT型)。结论多药耐药基因MI)RIC3435T多态性影响普乐可熨血药浓度，依据MDR1.基因不同基因型药物代谢的特点，有针对性的调整剂量，将有利于器官移植病人个体化用药治疗。关键词普乐可
