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1、新药临床前药物代谢动力学研究,目的:阐明新药在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。ADME 新药研发的重要环节，要求研究内容与药物的分类有关。,药品注册管理办法（局令第28号）,中药、天然药物注册,28.动物药代动力学试验资料及文献资料,化学药品注册,22.复方制剂中多种成份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料,27.非临床药代动力学试验资料及文献资料,21.动物药代动力学试验资料及文献资料,27.复方制剂中多种组份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料,生物制品注册,申报资料要求,一、生物样品分析技术的特点与要求,生物样品：,全血、血浆、血清、粪便、尿液、胆汁或
2、其他,特点：,药物浓度低 g/ml,ng/ml,fg/ml,干扰物质多,取样量少,个体的差异大,灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法?,生物样品分析方法的建立和确证,1.生物样品分析方法的选择和建立,（3）放射性核素标记法：标记核素有3H、14C、125I。药物分布和排泄研究，物料平衡研究。125I。蛋白质类分析,1)色谱法：HPLC、GC、LC-MS、LC-MS/MS，GC-MS等，大多数药物的分析,2）免疫学方法：放射免疫、酶联免疫、荧光免疫等，主要用于蛋白质/多肽类物质检测；,（4）微生物学方法，主要用于抗生素类药物的测定,2生物样品分析方法的确证（Method Validati
3、on）及技术要求,（1）特异性(Specificity),测定的物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性和外源性物质及其相应代谢物不得干扰对样品的测定,如何证明？,考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性,如何保证？措施,生物样品处理,直接沉淀处理蛋白等,液-液提取,液固提取,除杂质,样品富集,分离条件优化,色谱柱的选择,流动相的选择,检测条件优化,紫外检测器,荧光检测器,质谱检测器：MS，MS/MS,其他,（2）标准曲线和定量范围（Calibration Curve）,原理：待测物质的浓度与
4、响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线，提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度,标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度,如何做？,少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质制备标准曲线，定量范围要能覆盖全部待测样品浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。至少5条,实例1,左旋泮托拉唑血浆中标准曲线取空白大鼠血浆90 l，加10l不同浓度的标准品,使血浆中左旋泮托拉唑浓度分别为0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20
5、.00和40.00 g/ml，按“血浆样品的处理过程”项下操作，记录样品和内标峰面积。,利用样品浓度C对样品与内标峰面积比R作直线回归，得左旋泮托拉唑回归方程R=0.777C+0.023，线性范围0.15640.00 g/ml，最低检测浓度0.156g/ml。,左旋泮托拉唑血样方法学标准曲线,（3）定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）定量下限是标准曲线上的最低浓度点,要求至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/101/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明,
6、（4）精密度与准确度(Precision and Accuracy),要求选择高中低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。,低浓度选择在定量下限（LLOQ）附近，其浓度在LLOQ的3倍以内；,高浓度接近于标准曲线的上限，通常大于工作曲线最高浓度80%,中间选一个浓度,每一浓度每批至少测定5个样品，批内变异连续测定3个分析批 批间变异,变异：RSD一般应小于15%，在LLOQ附近RSD应小于20%。,要求：,准确度：一般应在85%115%范围内，在LLOQ附近应在80%120%范围内,左旋泮托拉唑批内和批间变异取空白血浆100l，加入标准品，使单一对映体浓度分别为0.312，2.5
7、0和20.00 g/ml，按“血浆样品的处理”项下操作，记录样品与内标峰面积比值R，代入当日工作曲线中算得浓度，以此作为精密度指标。测得批内变异和连续3天内的批间变异(n=5)，结果见下表。,（5）样品稳定性(Stability)根据具体情况，对含药生物样品在室温、冷冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。,WHY,长期冻融稳定性试验,反复冻融稳定性试验,室温放置 6 h 稳定性试验,进样瓶放置 24 h 稳定性试验,样品稳定性试验,其他,（6）回收率(Recovery),高、中、低3个浓度的提取
8、回收率，高、中、低3个浓度的提取回收率应大于70%浓度设定要求同变异分析,左旋泮托拉唑方法回收率 EP管加入90 L空白血浆，加入10L标准品，使单一对映体浓度分别为0.312，2.50和20.00 g/ml，按“血浆样品的处理”项下的方法操作，记录样品峰面积和内标峰面积(A1)；另取EP管加入10L 6.25,50和400g/ml消旋泮托拉唑标准品，再加入内标10 L，挥干后100 L甲醇复溶，离心，取上清进样，记录样品峰面积和内标峰面积(A2)。以峰面积的比值(A1/A2*100%)求得血浆中左旋和右旋泮托拉唑和内标的回收率。每个浓度处理5份样品，结果见表,（7）介质效应(Medium E
9、ffect)：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。LC-MS LC-MS/MS,大鼠的空白血浆，按“血浆样品的处理”项下的方法操作，挥干后加入10 L不同浓度的标准工作液和内标液，挥干，加入100 L复溶液，使最终浓度相当于QC样品浓度，每个浓度进样5次，记峰面积为A1；另取10 L不同浓度的标准工作液和内标液，挥干，加入100 L复溶液，使终浓度相当于QC样品浓度，即排除空白血浆基质的干扰，每个浓度进样5次，记峰面积为A2。,如果A1/A2 115%，表明有基质效应存在 不符合要求,（8)方法学质控(Quality control,QC),由独立的人员配制不同浓度的质控样品
10、对分析方法进行考核。对操作者单盲,高、中、低三个浓度的质控样品 利用随行工作曲线求得测定结果 每份样品重复6次,质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度一般应小于20。2/3样品应符合要求,生物样品测定1）随行工作曲线2）伴随质控样本 高中低3种浓度 质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样本合理布控3）未知浓度样本的信号代入方程，计算相应样品的浓度，如超过高限应采用相应的空白介质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，应以零值计算 对于稀释应考虑稀释效应,新药临床前药物代谢动力学研究的内容和方法,1.实验药品,2.实验动物,尽可能与药效学和毒理学研究所用的动物一致,清醒状态下实验，
11、最好从同一动物多次采样,实验所用的药品应与药效学和毒理学研究使用的药品相一致,创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物，,特殊要求,雌雄动物兼用,3.剂量选择,三个剂量,药效学和毒理学研究中所用的剂量，其高剂量最好接近最小中毒剂量，中剂量相当于有效剂量，,体内的动力学过程是否属于线性？,4.给药方式和途径,应尽可能与拟定的临床用药一致参考药效/毒理？,AUC比：1：3.9：11；剂量比：1：7：50 ln-ln 图 斜率偏离1！,AUC比：1：3.9：11；剂量比：1：7：50 ln-ln 图 斜率偏离1！,二、临床前药动学研究方法和内容,1血药浓度-时间曲
12、线,动物数的确定,不少于5个，通常6只雄雌各半,如有性别差异，增加动物数如用于单性动物，可采用临床拟用的性别的动物,采样点的确定,整个采样时间至少应持续到35个半衰期，或持续到血药峰浓度Cmax的1/101/20。在预实验的基础上合理布点,给药剂量和途径,三个剂量组,口服给药，一般应在给药前应禁食12小时以上，以排除食物对药物吸收的影响,药动学参数的估算,模型法 矩量法,选择一合适剂量 中剂量 多次给药 达稳态 蓄积情况,药动学参数的估算,模型法,矩量法,模型选择，参数估算,AUC，Tmax，Cmax，T1/2，MRT,估算药动学参数时需要考虑的问题,1）模型选择,系列 Ti,Ci,AIC=n
13、ln(Re)+2m,模型选择的相对性,Re的量纲问题,n=10,one m=2 n=10,two m=4 Re=0.1(ug/ml)2=10000(ng/ml)2,浓度高占的比重大,2）权重问题,结合临床应用实际,合理地选择权重系数,权重:窃富济贫,考虑:安全性 峰浓度有效性:最低有效浓度参数的实际意义和临床价值 临床给药间隔,血药浓度的测定准确性,误差要求在规定范围内高浓度 15%中浓度 15%低浓度 20%,实例 最后点浓度正误差20%,结果,3）末端项半衰期的求算问题,lnCt线性回归 时间点选择 取点不同结果不同,上述结果(似乎均满足线性,非参数法,4）初值的选择,程序存在初值依赖性,
14、拟合参数的实际意义,速率常数和系数应为0,参数应有合理的解释!,半衰期值不会大于取样时间长度,包括线性动力学，非线性动力学判定？有无性别差异？多剂量：稳态情况，蓄积情况等？自身诱导？,结果分析与结论,2药物的吸收,吸收速度 Cmax和Tmax,吸收的程度 AUC 生物利用度,吸收机理 创新药物 in vivo In vitro Caco-2 模型,Transwell小室示意图,一般认为Papp10-6cm/s的药物吸收较好，Papp10-7cm/s的药物吸收很差,3药物的分布,一个剂量,选3个时间点考虑 吸收分布，消除,动物数同血药浓度,组织：生命器官，药物分布，毒性/药效靶器官,血浆蛋白结合
15、试验,血浆蛋白：人/动物 种属差异性,药物浓度：结合血浆中药物浓度 3-4个浓度。线性结合？,合适方法：平衡透析法，超滤法等需要注意：非特异性结合实验 稳定性,高蛋白结合率药物：药物相互作用？,5药物的排泄,动物：大鼠或小鼠,粪，尿，胆汁,给药后，动物放入代谢笼中，不同时间段收集尿与粪至排泄完全，测定尿和粪中总药物排泄量，计算排泄分数（尿或粪中累积排泄量/给药计量）,药物的尿和粪排泄,胆汁排泄,一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流，待动物清醒后，以预先确定的途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，记录胆汁体积，取一部分样品进行药物测定，计算药物经胆汁排泄的速率及总排泄量,结合尿、粪和胆汁中的
16、排泄量，计算药物原型排泄分数,药物代谢研究,在体研究：动物给药或采用合适的方法分析尿，胆汁或血浆中代谢产物生成情况,通常采用LC-MS/MS或LC-TOF/MS对可能的代谢产物进行初版鉴定，推断可能的代谢途径和半定量分析。可能的话，化学合成或收集尿，分析代谢物，进一步进行结构确定。,离体实验,肝微粒体：I相代谢和葡萄糖醛酸结合,肝微粒体与待测药物在辅因子存在情况下，共温孵后，测定反应体系中代谢物的生成情况，结合在体结果进一步分析其可能的代谢物和代谢途径,创新药物：几种种属动物肝微粒体代谢酶的比较,药物代谢及代谢途径,胞浆，微粒体，S9，肝细胞（原代或冷冻）,肝微粒体,代谢稳定性,代谢产物寻找,
17、介导代谢酶亚型鉴定,药物相互作用,其他？,动物种属间比较 定量/定性,参与药物代谢酶研究,肝微粒体与待测药物在辅因子存在和酶特异性抑制剂情况下，共温孵后，测定反应体系中代谢物的生成情况，与无抑制剂结果比较。,肝微粒体,结合进一步用克隆酶/重组酶确认,实例去氧鬼臼毒素代谢初步试验（人肝和大鼠肝微粒体）,去氧鬼臼毒素 在人肝微粒体代谢,肝微粒体三种代谢物形成,大鼠肝微粒体中温孵,几种酶抑制剂对代谢物M1，M2和M7形成的影响,大鼠肝微粒体参与去氧鬼臼毒素代谢酶分析 大鼠肝微粒体0.5mg/ml,终止温孵时间为2min,DPT底物浓度为50 M,药物相互作用,在体：鸡尾酒法,探针混合物与待测定药物合
18、用单用或多次用药后，测定探针药物的代谢动力学行为变化,离体实验,代谢抑制：可逆性抑制，机制性抑制,酶活性探针,可逆性抑制（竞争性抑制）实验：肝微粒体、抑制剂、探针以及辅因子（NADPH）共温孵，测定产物的生成,机制性抑制：肝微粒体、抑制剂以及辅因子（NADPH）共温孵一段时间后，在测定酶活性（与探针温孵），测定产物的生成 测定产物的生成 特点酶活性抑制强弱与抑制剂浓度，预温孵时间有关,酶活性诱导：人肝,CYP1A2，2B6和3A4,人肝与待测药物共培养72h,测定相应酶活性或基因表达，阳性对照,决策树,三、新的缓、控释制剂的临床前研究的内容与方法,实验动物的选择,参比制剂的选择,给药的剂量和途径,研究的内容和方法,多剂量研究,单剂量研究,
