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1、蛋白质的结构与功能,什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物,蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递,2.蛋白质具有重要的生物学功能,3.氧化供能,OUTLINE,第一节 蛋白质的分子组成第二节
2、蛋白质的分子结构第三节 蛋白质结构与功能的关系第四节 蛋白质的理化性质第五节蛋白质的分离纯化,第一节 蛋白质的分子组成,组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,蛋白质元素组成的特点,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属
3、L-氨基酸（甘氨酸除外）。,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸含芳香环的氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,非极性疏水性氨基酸,3.含芳香环的氨基酸,4.酸性氨基酸,5.碱性氨基酸,天冬氨酸（Asp,D）,谷氨酸（Glu,E）,赖氨酸（Lys,K）,精氨酸（Arg,R）,组氨酸（His,H）,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,Gly Ala Val Leu Ile Phe Pro,Trp Ser Try Cys Met Asn Gln Thr,Asp Glu,Lys Arg His,杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,
4、脯氨酸（Pro,P）,芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trg,W）,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸（Ser,S）,苏氨酸（Thr,T）,半胱氨酸（Cys,C）,甲硫氨酸（Met,M）,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,半胱氨酸,胱氨酸,注：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含-氨基的氨基酸：赖
5、氨酸,（二）氨基酸的理化性质,1.两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。,Titration Curve for Glutamic Acid,pK1 carboxylic acid=2.2 pK2 R group=4.3 pK3 amino group=9.7 pI=(pK1+pK2)/2=3.25,赖氨酸滴定曲线和等电点计算,B,2.紫外吸收,3.茚三酮反应,氨基酸与茚
6、三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。（Pro),+,茚三酮(无色),紫色化合物,（三）蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链,*肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,+,丙氨酸,苯丙氨酸,肽键,二肽,丙苯氨丙氨酸,氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽(peptide),氨基末端(端),羧基末端(C 端),*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polyp
7、eptide)。其形状为一条没有分支的长链,又称多肽链或肽链.,*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,氨基末端(端),羧基末端(C 端),50,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,解毒,抗氧化,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,第二节 蛋白质的分子结构,一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary str
8、ucture)四级结构(quaternary structure),蛋白质结构的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quariernary structure,一、蛋白质的一级结构,定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构,二、蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 主要
9、的化学键：氢键,在肽键中，与相连的氧原子和氢原子呈反式构型,（反式）,（顺式）,肽键的特点：,肽键的特点：,CN单键为0.149nm,C=N双键为0.127nm,具有部分双键性质,不能自由旋转,肽键中键长为0.132nm,肽键中的和均不能自由旋转,肽键(-CONH-)中的个原子,个碳原子(C),和,被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元(peptide unit)。,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),螺旋(helix),由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象,1.概念,2.螺旋的结
10、构特征,(1)以肽键平面为单位,以碳原子为转折盘旋形成右手螺旋,(2)每3.6个氨基酸残基 绕成一个螺圈(3600),螺距为0.54nm,每个氨基酸上升0.15nm,肽键平面与中心轴平行,(3)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部,(4)肽键的CO和NH 都形成氢键,是稳定螺旋的主要作用力,氢键的方向与中心轴大致平行,折叠,肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称折叠常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状故又称折叠片或片层,折叠结构特点相邻肽键平面的夹角为1100，呈锯齿状排列；侧链基团交错地分布在片层平面的两侧。,条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行(均从N-C)，也可反向平
11、行 由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近垂直。,转角(turn),肽链出现1800回折的转角处结构称为转角结构特征常见于球状蛋白质分子表面第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键.,无规卷曲(random coil),没有确定规律性的肽键构象常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠,无规则卷曲示意图,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,模体,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段
12、，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,1 2 3 4 5,5 2 3 4 1,-链,-迂回,回形拓扑结构,回形拓扑结构,-迂回,结构域,在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域,纤连蛋白分子的结构域,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键疏水键、离子键
13、、氢键和 Van der Waals力等。,目 录,氢键,负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。,疏水相互作用,由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力,离子键,由异性电荷间的静电吸引形成的键。,肌红蛋白(Mb),分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,四、
14、蛋白质的四级结构,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,血红蛋白的四级结构,五、蛋白质的分类,(1)依据蛋白质的外形分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。,（2）按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白(simple protein)和结合蛋
15、白(conjugated protein),简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,结合蛋白,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合
16、而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,前体与活性蛋白质一级结构的关系,由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin），在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin
17、），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。如图所示:,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息,（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；比较种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。,二、蛋白质的功能依赖特定空间结构,（一）血红蛋白与肌红蛋白结
18、构相似,肌红蛋白的结构,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与影响与氧结合,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是
19、抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),变构效应(allosteric effect）,蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(pr
20、ion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,第四节 蛋白质的理化性质与分离纯化,一、理化性质（一）蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子
21、之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢
22、复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,*蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质
23、定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,（一）透析及超滤法,*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,*超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,第五节蛋白质的分离和纯化,（二）使蛋白质沉淀的方法,(1)盐析法(salting out)向蛋白质溶液中
24、加入大量中性盐使蛋白质沉淀称 为盐析常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等作用原理:盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力。特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。,(2)有机溶剂沉淀法 使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。常用有机溶剂:甲醇、乙醇、丙酮缺点：常会使蛋白质变性注意事项:必须在低温下操作，尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去,(3)重金属盐沉淀法 重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。若溶液pH大
25、于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：此法常使蛋白质变性失活。,(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质 结合生成不溶性的盐而沉淀。缺点：常引起蛋白质变性注意事项:反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,醋酸纤维素薄膜电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,常用于蛋白质分子
26、量的测定,等电聚焦电流与双向电泳,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,蛋白质分离常用的层析方法离子交换层析：利用各蛋白
27、质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。亲和层析,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,亲和层析工作示意图,蛋白质,载体介质,配体,结合,洗脱,洗脱介质,（五）超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关,三、多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末
28、端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,四、蛋白质空间结构测定,*二级结构测定通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,*三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,
