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1、果蔬成分生化分析温州大学生命与环境科学学院作者：XXXX指导老师：XXXX摘要：果蔬中营养成分多种多样，本实验以盘菜，萝卜，豆芽梨子等为研究对象，对其主要营养成分（维生素C含量、总糖及还原糖含量、蛋白质含量）测定与其过氧化物酶分析都运用了比色法，并对测得数据列图表，进行对比研究。结果表明：新疆苹果中的主要营养成分相对于宁夏苹果含量高，但其过氧化物酶活性低于宁夏苹果，这说明其酚类物质代谢能力低于宁夏苹果。总的来说，新疆苹果与宁夏苹果营养价值都高，但新疆苹果相对于宁夏苹果营养。关键词：主要营养成分；过氧化物酶1.前言：蔬菜，是指可以做菜、烹饪成为食品的，除了粮食以外的其他植物（多属于草本植物）。蔬
2、菜是人们口常饮食中必不可少的食物之二蔬菜可提供人体所必需的多种维生素和矿物质,据国际粮农组织1990年统计，人体必需的维生素C的90%、维生素A的60%来自蔬菜。此外，蔬菜中还有多种多样的植物化学物质，是人们公认的对健康有效的成分工如:H胡萝卜素、二丙烯化合物、甲基硫化合物等。目前果蔬中的营养素可以有效预防慢性、退行性疾病的多种物质正在被人们研究发现。蔬菜中含有多种营养成分，其主要要营养特点如下：1）水分一新鲜蔬菜的含水量在90%以上,它是蔬菜鲜嫩程度的标志。2）维生素一绿色、橙色蔬菜中含有较多的胡萝卜素、维生素C、核黄素及叶酸。3）无机盐一蔬菜是无机盐的重要来源。绿色蔬菜含量最为丰富。4）食
3、物纤维一各种蔬菜都含有，它有促进肠道蠕动、降低胆固醇和改善糖代谢等作用。水果是指多汁且有甜味的植物果实，不但含有丰富的营养且能够帮助消化。是对部分可一以食用的植物果实和种子的统称。水果类的营养价值近似蔬菜，但所含无机盐和维生素不及蔬菜，其特点为：1）各种鲜水果都含有维生素c,因其多生吃，故损失较少。2）水果中的纤维素、果胶是天然的缓泻剂。3）水果具有芬芳的果味，鲜艳的色彩能促进食欲。4）水果含有较多的钠、钾、镁等元素，合成碱性食物。2,材料、试剂与器材2.1 材料各种水果和蔬菜2.2 试剂（-）果蔬中维生素C的测量测定1%草酸溶液、2%草酸溶液、维生素C标准液、氧化型0.1%2,6二氯酚靛酚溶
4、液（二）果蔬中总糖及还原糖含量测定慈酮试剂、标准葡荷糖溶液（O.lmg/mL）、6molLHcl溶液、20%NaOH溶液（三）果蔬中蛋白质含量测定标准蛋白质溶液、考马斯亮兰G250染料试剂、0.05molLTrisHcl缓冲液（PH6.8）（四）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶实验A（分离胶缓冲液）、B（浓缩胶缓冲液）、C（分离胶贮液）、D（浓缩胶贮液）、E核黄素、F蔗糖、TEMED.0.14%过硫酸铁、电极缓冲液、封板胶、上样缓冲液、染色液过氧化物酶活性的测定IOOmmolZL磷酸缓冲液PH6.0反应混合液：1OOmmolZL磷酸缓冲液（PH6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚281
5、,于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢191,混合均匀，保存于冰箱中。2.3 器材台秤；可见光分光光度计；恒温水浴锅；高速离心机；漩涡混合器；垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）；稳压稳流直流电泳仪；微量注射器。各种玻璃器皿3.实验方法3.1 试验设计实验一果蔬中维生素C的定量测定I步骤I、制备新鲜果蔬液：洗净新鲜果蔬，擦干表面水分，剥去外皮，称取Ig实验材料放入研钵中，研磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约30ml蒸储水冲洗研钵2-3次，洗出液也转入锥形瓶中，于50C水浴中保温约30min,取出，冷却后定容至IOomL过滤，滤液即是（若样品中含大
6、量铁，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓Fe2还原染料），在冰箱中保藏。称取实验材料Ig放入研钵中，加水3ml,研磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约12ml蒸馈水冲洗研钵2-3次，洗出液也转入锥形瓶中，再向锥形瓶中加入6moll的盐酸IOml,搅拌后在沸水浴中水解30min,冷去后用20%NaoH溶液中和至PH为中性，然后用蒸储水定容至IOOmL冰箱保存。实验结果维生素C标准液0.41ml样品液0.43ml0.46ml盘菜样品液0.58ml0.56ml结果计算：V=(0.43+0.46)/2=0.445Ml=O.445X10/41=89/820M2=8982045=2.17所以白萝卜每IOO
7、克样品中含维生素2.17g同理得：每100克的盘菜样品中含维生素c2.80g实验结论：盘菜的维生素含量比白萝卜高。实验二果蔬中总糖及还原糖含量的测定I步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制：取洁净试管6支，按表1进行操作：表1意酮比色法定糖标准曲线的制作O12345标准葡萄糖溶液mLO0.10.20.30.40.5蒸储水1.00.9置冰水浴中0.835min0.70.60.5意酮试剂4.04.04.04.04.04.0A620nm煮沸10，冷却后室温放置IOS在62Onm处比色以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mgmL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取Ig实验材料，加水约3mL,在
8、研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30也蒸储水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。于0水浴中保温约0.5万（使还原糖浸出）取出，冷却后定容至100也。怛:滤后冰箱保存。I不同果蔬需进行不同程度稀释。水果如柚子等：取滤液ImL-IOOmL;蔬菜如盘菜、萝卜等取滤液IOmL-IOOmLo取ImL最终稀释液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL慈酮试剂，沸水浴中煮沸IOmin,取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。3、样品中总糖的提取、水解和测定称取这实验材料，加水约3L,在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，用约/2,L蒸储水冲洗研钵23次，
9、洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6应盐酸/仿泣，搅拌均匀后在沸水浴中水解05，冷却后用20%NO溶液中和至PH呈中性。然后用蒸储水定容至00mL,I过滤后冰箱保存。I不同果蔬需进行不同程度稀释。水果如柚子等：取滤液5mL-100mL；蔬菜如盘菜、萝卜等：取滤液10mLIOOmLo取ImL总糖的最终稀释液同上法进行还原糖测定。六、计算按照下列公式分别计算实验材料中还原糖和总糖的质量分数（卬）。CiViW（还原糖）=oo%mW（总糖）=*o.9XlO0%m式中：W（还原糖）：还原糖质量分数（）W（总糖）：总糖质量分数（）C1：还原糖的质量浓度（mgmL）C2：水解后还原糖的质量浓度（mg
10、mL）Vi：样品中还原糖提取液的体积（mL）V2：样品中总糖提取液的体积（mL）m：样品质量乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖中扣除水解时所消耗的水量。实验结果:葡萄糖浓度g/LAbs0.010.0540.020.1120.030.1580.040.2120.050.257萝卜还原总糖0.464萝卜总糖0.881盘菜总糖0.388盘菜还原总糖0.349经过计算得：每萝卜还原糖质量分数为：9.03%萝卜总糖质量分数：17.14%盘菜还原糖质量分数：6.79%盘菜总糖质量分数：7.549%实验三果蔬中蛋白质含量测定I步骤1、标准曲线绘制取7只试管编号，按下表加入各试剂:试剂0123456牛血
11、清白蛋白0.0mL0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL标准液蒸储水LOmL0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL甲试剂5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL混匀，于20-25（或室温下）放置Iomin乙试剂0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL迅速混匀，2025（或室温下）放置30min,用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。以各管吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取Ig待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入ImLH2。或0
12、.05molLTris一HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管（注：盘菜，萝卜稀释至IOmL,其余稀释至5mL）,3500rpm离心1520min,其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定取2只试管编号，按下表加入试剂：试剂空白管测定管蛋白质提取液-LOmL蒸锵水LOmL甲试剂5.0mL5.0mL混匀，于20-25（或室温下）放置IOmin乙试剂0.5mL0.5mL迅速混匀，2025C（或室温下）放置30min,用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。II实验数据盘菜0.921萝卜
13、0.436牛血清蛋白溶液ug/LAbsO0200.104400.215600.314800.4681000.507实验结果：M（盘菜）=1737.74gM（萝b）=822.64g实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶实验I步骤1 .贮液配制按上表配制贮液，但应注意（I）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放12个月。（2）过硫酸钱应当天配制。2 .电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm,形成一个“胶室”，胶就在这两
14、板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸储水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽后用1%琼脂溶液（Ig琼脂加电极缓冲液（注：已稀释10倍）至100mL,煮沸一冷却至6070C时用）封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。3 .制胶将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（1）配制分离胶A3mLC6mL0.14%过硫酸铉12mL水3mLTEMED15L将分离胶沿长玻
15、璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即小心地覆盖23mm的水层，静置待聚合（约40min）,当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。（2）配制浓缩胶B1.5mLD3mLE1.5mLF6mLTEMED18L注：TEMED在灌胶前加，或者加完之后放在黑暗的环境中。先倒掉分离胶上的水层，用吸水纸将水层吸干，但不要弄坏分离胶。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。4 .样品的制备（过氧化物酶的提取）按下列比例称取果蔬：梨：1:2柚子：1
16、:5萝卜与盘菜：1:10（W:V=g:mL）剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及样品提取液于冰浴上研磨成匀浆，置于离心管中，研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以14000rmin的转速离心15min,取上清液贮存于低温冰箱备用。5 .点样用微量注射器（50比）吸取适量样液，在浓缩胶上层点样。点样量：柚子、梨：20、40、50L萝卜、盘菜：10、20、30L点样时须小心，防止样品液扩散。向上槽液中滴加0.1%溪酚蓝23滴。6 .电泳接好电源线（上槽即加样槽为负极）。打开电源开关，调节电流到IOmA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA,维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端ICm处，即可停止电泳。
17、把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。7 .剥胶取出电泳胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃内面注入一定量的水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶（注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。8 .染色、记录结果将配制好的染色液倒入培养皿，室温下l10min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照、记录酶带距离。实验结果过氧化物酶活性的测定I步骤1 .取上述的样品提取液2.5mL,定容至50mL刻度，备用（此处仅稀释萝卜与盘菜，水果均不稀释）。2 .取光径Icm比色皿3只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液ImL,作为对照，另2只中分别加入反应混合液3mL和上述酶液各ImL（如酶活性过高可稀释
18、之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔Imin读数一次（连读5min,取其平均值）。II数据处理以时间为横坐标，该十分钟内每分钟对应的在470nm波长下的吸光值为纵坐标画图，得出该线斜率k,此斜率为每分钟吸光度变化价值。1、每分钟内A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位(U)表示。2、每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即过氧化物酶活性=k(0.01Wt)式中：k为上图图线的斜率W为苹果鲜重，gt为反应时间，min实验数据:时间minO12345盘菜0.1460.6810.9581.1391.2441.292萝卜0.0390、1870.2730.351
19、0.4240.475Abs变化值min0-1122-33-445盘菜0.5350.2270.1810.1050.048萝卜0.1480.0860.0780.0730.0513.2 实验方法概述(一)、实验一：2,6-二氯酚靛酚滴定法氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C,当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。（二）、实验二：为意酮比色法原理单糖类遇到浓硫酸时,脱水生成糠醛衍生物,后者可与慈酮缩合成蓝绿色的化合物，当糖的量在20-200mg范围内时,其呈色强度
20、与溶液中糖的含量成正比,故可比色定量。（三）、实验三：考马斯亮兰法考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nio在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。（四）、实验四：聚丙烯酰胺凝胶电泳法凝胶电泳具有一般电泳的电场效应，即在一定PH的溶液中，样品分子由于解离或吸附，使自身带一定的电量，在相同的电场强度作用下，不同的样品分子因带不同的电性和电量，电泳时具有
21、不同的泳动速度，使最终的迁移距离不同而分离。凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有电场效应外，还具有分子筛效应，因凝胶是一种立体网状结构的物质，样品分子在通过凝胶网孔时受摩擦力等的作用，使体积小、形状为圆球形的样品分子受到的阻力小，移动较快，而体积大,形状不规则的样品分子受阻力大，移动较慢。因此，凝胶电泳不但从分子带电情况的差别，而且还从分子大小、形状方面的差别来分离样品分子，具有很高的分辨力。比色法在有过氧化氢存在下，过氧化氢酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470n处有最大吸收，可用分光光度计测量47Onm的吸光度变化测定过氧化氢酶活性。3.3 实验分析与讨论实验一：本次的实验整
22、个过程较长，在整个过程中，若水浴加热时间不长，还原糖并未完全溶解，以及总糖的最终PH不为7都会给本实验的结果带来误差，而且样品Ig很难控制的精确，也存在误差，在碾磨的过程中要充分的细，特别注意的是在测试总糖还原糖时也需要对照组，并且不能为蒸储水，仪器也需要归位。实验二：如果测试要求很严格，可以在试剂中加入后520min内测定吸光度，因为在这段时间内颜色是最稳定的，比色反应需在Ih内完成。不可用手摸比色皿，可用塑料或玻璃比色皿，测定完后用95%乙醇将蓝色的比色皿杯洗干净。试管干燥后不能直接加牛血清蛋白，因为此时的试管还是很热的，能导致蛋白质变性，使试管呈现出同一个颜色。实验三：在用琼脂封底的时候，温度不能太低了，会使封底不密，从而会漏，导致实验重做。在制胶的过程中不能把TEMD加的太早，因为会很容易的凝结。在制备样品的过程中，提取液要及时的放入冰箱中，因为能在温度较高的条件下容易失活。在点样的时候必须要小心，防止样品的扩散。在接通电源的时候，正负两极不能弄反了在剥离胶时要小心，并且要加入一定量的水，这样可以防止胶片破碎。在取下玻璃板时，要记住先量蓝带到凹槽的距离。实验四：从实验的结果看出盘菜的过氧化物活力要明显的强于萝卜不同的组的盘菜，萝卜数据也有很大的差别，说明植物生长条件的差异也会带来自生生理性的不同。随着时间的延长，酶活力越来越弱比色皿光滑面不能弄脏，否则会影响实验结果。
