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1、蔗糖磷酸化酶(SucrosePhosphorylase,SP)试剂盒说明书微量法100T/96S注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。澜定意义:SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖甘健,催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外,SP还能催化氢醍合成熊果件,具有极强的美白效果,在化妆品工业中具有重要应用。渊定原理:SP能够以磷酸为受体,催化蔗糖产生I-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖,在6.磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NAD产生成NADPH,导致34Onm光吸收值增加。测定34Onm吸光度增加
2、速率,即可计算SP活性。自备实验用品及仪器:天平、低温离心机、恒温水浴锅、酶标仪、96孔板和蒸谣水。试剂组成和配制:提取液:液体IOomLXl瓶,4*C保存。试剂一:液体15mLl瓶,4保存。试剂二:粉剂Xl支,20C避光保存,临用前加2.5mL蒸储水溶解;用不完的试剂分装后20七保存,禁止反复冻融。试剂三:粉剂Xl支,2(C避光保存,临用前加5mL蒸馈水溶解;用不完的试剂分装后2(C保存,禁止反复冻融。粗液提取:1 .组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL提取液)进行冰浴匀浆,然后IOoOOg,4C,离心IOmin,取上清待测。2
3、.细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):提取液体枳(mL)为5007000:1的比例(建议500万细胞加入ImL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4C,离心IOmin,取上清置于冰上待测。渊定操作衰:1.晦标仪预热30min,调节波长至340nm02.操作表试剂名称对照管测定管试剂一(L)120120试剂二(L)2020试剂三(L)4040样本(L)20蒸饱水(L)20迅速混匀,于96孔板,37下测定34Onm的初始吸光值与反应2min后的吸光值,测定管记作Ai与A?对照管记作A3与Ai,A=(A2-A)-(A4-A3)。SP活
4、性计算公式,1.按照蛋白浓度计算Bl活定义:37C,pH68时,每毫克蛋白质每分钟催化产生InmoINADPH为一个酶活单位。ASP活性(nmol/min/mgprot)=V反总V样CprT=l608x4ACprd2 .按照样本质量计算鼻活定义:37C,pH68时,每克样本每分钟催化产生InmOlNADPH为个酶活单位。ASP活性(nmol/min/g鲜重)=XV反总(V样V样总xW)T=1608xaAWd3 .按照细胞数量计算算活定义:37C,pH68时,每IO,个细胞每分钟催化产生InmOlNADPH为个酶活单位。MSP活性(nmolmin104cell)=XV反总(V样V样总X细胞数量(万个)T=1608x4A细胞数量d(万个)S:NADPH摩尔消光系数,6220Lmolcm;d:比色皿光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL;V样:反应体系中样本体积,0.02mL:W:样本质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL:V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,2min注意事项:I.可选用BCA法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。2.样本较多时,可以按照每个样本试剂一:试剂二:试剂三=120:20:40(L)的比例配制工作液,用多少配多少,临用前立刻配制,10分钟内使用。优利科(上海)生命科学有RrJL