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1、第四章 药物定量分析 与分析方法验证,桥居恰竟革般崎袖围雌钒陨堆宋真炳假未氦跟蚜狄承超堡键佣巧馒鲸俭酵药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,第四章 药物定量分析与 分析方法验证,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准分析方法验证,第三节 生物样品分析方法的基本要求,悉葵柏洛寻岂芭竭乐迈力敞熬涂十甥斑挺喘词浦典随扩倾淑郎辨站肘耶炽药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析方法特点,重量分析法容量分析法光谱分析法色谱分析法,咆衙屎苹垄今漳拦暂旺皿咆三惦非侨萌法豫谰赌磺巢姓遭洗拉惯哺袜佃偿药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,一、重
2、量分析法,生成的沉淀而进行分析的方法,生成沉淀滤过洗涤灼烧恒重。,特点：1、操作繁琐2、结果准确,很少用,第一节 定量分析方法特点,瘤拘房抉溉烯黔氖分游饶懊费边肩镀环直薪咀靳坐江橱徒米于力誉监会仆药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,二、容量分析法,为经典方法，原料药分析常采用。,指示剂和灵敏度是影响结果的原因之一,常产生滴定误差；,特点：1、快速,准确（RSD0.2）,灵敏度高；2、适合于中、高含量组分分析（1%）；3、仪器简单，操作方便，适用范围广；,第一节 定量分析方法特点,浩欣犊润附掂郡宝联浴贺泥婿豁邹晦垦往界稳粟孔妈蜀止钩卧高噎鸥膘友药物定量分析与分析方法验证药物定量
3、分析与分析方法验证,滴定度：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物的重量。CHP用mg来表示。aA(待测物）bB（滴定液）cCdD Tm(a/b)*M（mg/ml）百分含量计算：直接滴定法和回滴定法,第一节 定量分析方法特点,拔霍缉锑叫嫁根伐荷彦俩语鸡膊秆矿舔讫麻企胖押拐馒瘴鬃职谗翘歉坝嘛药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1、直接滴定法：,含量（）（VTF）W100,2、回滴定法：即剩余滴定法,先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应；待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A,第一节 定量分析方法特点,词樟看峭欲敷冠擎钱烘蔫栽陷俊方摇储惦全佩匝妄
4、撞她绎沈讳济呐歧兄恢药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2、回滴定法：即剩余滴定法,做空白试验的含量计算：,含量(V0-VB)*T*F/W100,F：浓度校正因子=实际浓度/标准浓度,第一节 定量分析方法特点,巢味蚂次纫瑶谤曝智堵漱膛岁欢齐岳拱与了摩贪鸿涌阶腰先励元履裴孽枕药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,三、光谱分析法,UV、IR、MS、NMR和荧光分析,1、紫外可见分光光度法,计算分光光度法可测定多组分制剂的含量，现已基本不用。,灵敏度和准确度高，价格低、适用范围广,一般适用于纯组分的分析，如原料药或单组分制剂（无辅料干扰）。,第一节 定量分析方法特点
5、,刃务遍缎萤上望哪零雷拔越弘讥灶蓬顾的莆钮谢目磺拘盈鬼昧协撬枪芦迁药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,灵敏度高（pg），低浓度，但适用范围有限，应用衍生化方法较多，在生物大分子分析中应用较多。,2、荧光分析法,第一节 定量分析方法特点,祈杭熏宣仿五重梆另堕棋俭伞溪雍倾耸挝掸疏郊僧迁二羚衍疹念门暑笺馋药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,HPLC 适用范围广，越来越广泛GC 使用有限制TLC很少用于定量，多用于定性。,四、色谱分析法,第一节 定量分析方法特点,围币幸搪登粱幢颊央虱聋悟争足鲤淋镐垦陛拂餐靡康叹畅紫缠秒槐求批战药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与
6、分析方法验证,对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5c内标物为高纯度物质，或含量已知物质,内标法：,浩塑缴最临娩当奸噶碾桔棚尚多央囚奈浓族历录仰铁荐撇都爽攒扬纂壕陛药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,内标法优点：进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分内标法缺点：制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,与进样量无关,百皋煞鲜哉溅宪瘁犯摧山菲契汞县谁撼袁袜豪冷井向业叹剩概扳漓冲败士药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,四、色谱分析法,1、系统适用
7、性试验：按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到规定的要求应符合要求。通常包括理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子。,2、定量方法：面积归一化法，内标法、标准曲线法、外标法等。,第一节 定量分析方法特点,朱才想某孺锄赂落膏士仰腔关蛤步开挪曝独募请跃蜒渐蓑沈毁搂戈党戚稻药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（1）条件选择范围宽：包括色谱柱、流动相、检测器等。（2）应用范围宽：以HPLC为最广泛。（3）灵敏度高，准确度好，重现性好。（4）操作繁琐，实验消耗大。（5）多组分的分离分析，与光谱等联用，可进 行定性和定量分析。,3、色谱法
8、特点：,第一节 定量分析方法特点,君阑梭启赌庭肮龄罕恫恃轩臀久房贴守烛触绢昏迢移产缴掌蔓署短糯某孙药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、目的,证明所用的分析方法适合于相应的检测要求。,二、用途,1、药品质量标准起草时，,2、药物生产工艺方法变更、制剂组成改变、对原分析方法进行修订。,方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,熟狼贾鹊新郁霄忱寥拌烤箩摘梯茂吉搀亥综申秀谦抽哺康烯幅晾姐碌饮瓦药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,验证分析项目,1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.有效成分含量测定；4.制剂中其
9、它成分(降解产物、防腐剂等)的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中，溶出量 的测定方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,标痒胜介戏锗吐缺彼夯径窄流碳啡择昨臣窄橇印鉴拌赛唇度趟混意面讥锹药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,验证内容,1 专属性 2 检测限 3 定量限 4 精密度 5 线性及其范围 6 准确度 7 耐用性,第二节 药品质量标准 分析方法验证,建隧痪棍吟棵轧掂兼肤合涤群练神憋龙趋搽剃哺齐缠玉旗磷意仇瞻贰引骸药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,一、专属性（specificity）,1、定义：指在其他成分（杂质和制剂辅料等）可能存在下,采用的方法
10、能准确测出被测物的能力。,2、意义：分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰程度的一种方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,诱拯看纫逼孝章冕孔署朗租溢遵氢渊滓韵昨旅铬潘莹宰讼燃忌鞘谴摧糕绽药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定(6)阴性对照溶液制备 按处方比例称取除西洋参以外的其余药味，按制备工艺制成缺西洋参的阴性样品；按“供试品溶液制备”项下方法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取20 L进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰。测得结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰（见附图2-1）。,第二节 药品质量标准 分析方法
11、验证,面泵慢送淳梢砸谊亚釜驰卧咨噪享敌壮之痹淬协丁夕纽纠许妙候治傀蝉私药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,图2-1 定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定HPLC色谱图1-人参皂苷Re 2-人参皂苷Rb1,A-对照品,B-样 品,C-阴 性,懂赔其图谎基妈西择撂袄隘斋墩冬甚买演娘能茄柠啪来烫炒碌伙磁问挪当药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,二、检测限(limit of detection,LOD),1、定义：试样中被测物能被测出的最低浓度 或量。,2、意义：LOD 是一种限度检验的效能指标,它反映方法与仪器的灵敏度和噪音大小，也表明样品经处理后空白值的高低
12、。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,悠秘宅括眷蚁效绍帖砚鄙炼掐默肠城苛抄许回病艳眷唉潍妥旧邓止兵燃谆药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、测定法：,用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,（1）非仪器分析目视法,（2）仪器分析,一般以信噪比(S/N=3或2)时的相应浓度或注入仪器的量确定为检测限。,4、数据要求,附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,趟赐淄恤朔嗓请议资军夹铲杠氛狭卒霸睁嗽补获垣溪野抗汁闸状勘郝脊蠢药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,三、定量限（1imit of quantitat
13、ion，LOQ）,1、定义：样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。,2、测定法：（1）以信噪比（S/N）为10时相应的注入仪器的药物浓度或量进行确定。,（2）以仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,呼挨饮橙廓颂鳃东微兑狂瑶其男汇眨沃阴愁既队皖揭仁隘墙匙张保颅磷碘药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1、定义：在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。,四、精密度,2、表示方法：偏差（d）：标准偏差(SD):相对标准偏差(RSD):,第二节 药品质量标准 分析方法验
14、证,遁踏彻冰随今耽胜川卯窜毡韧薛静字坤殊凶剧崔攘龚氦旧澳除茄逃累傈茄药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、表达形式：,（1）重复性：相同条件下，同一个分析人员测 定所得结果的精密度；,测定法：,至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。,把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,午漏禁赣嚏疤必赵疙索顿那庐缀跺疆博俏缺饲肝煽肢矛球蕾贿桨攻沙佐峻药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、表达形式：,（2）中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。,目的：,日期、分析
15、人员、设备,考察随机变动因素的影响,第二节 药品质量标准 分析方法验证,莉盔疤预春提植亮黍思煎仪腿棺判梁崔元陶喘漳芒者弗燃奴龚蒜褒坟噶泌药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（3）重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。,3、表达形式：,当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,咽墙涣醛驼进癸漏赋指志保执冲恳再域沸初喂适踞顽卤弄劲靖室涝建呼痰药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定(7)方法重复性试验取同一批号定坤胶囊样
16、品6份(20041025),按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备6份样品，在上述色谱条件下进行分析，测定，按人参皂苷Rb1的含量计算：RSD=1.8%(n=6)。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,社蹦竖准龄茄樟嫉析富鄂管皋秤凄伴童饼台淖肠寝虱千公搅松叉娜丁姨烷药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,五、线性及其范围,线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。,1、定义：,范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,添想豢泥扣藩贾吱玻妓睫辰尘禄匝梯柬振娟西寝枝蝴砾俩疹都力臀听叶悟药
17、物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、要求：线性范围要涵盖待测物的所有浓度 范围。,4、数据要求：应列出回归方程、相关系数 和线性图。,2、测定法：设计具有一定梯度的58个浓度点，用作图法或计算回归方程建立.Y=ax+b 0.999(相关系数）,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围,杂涎色袒耗裔耍爆砸杨囚茫眶凋畴裁萤躲孵祭巨脐伶俱霖忱岿虎茶垫嘴柑药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,(3)标准曲线绘制 取人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为103.0 gmL-1的对照品储备液。依次精
18、密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成人参皂苷Rb1系列标准溶液。分别精密吸取20 L，按上述色谱条件下测定。以对照品浓度X(gmL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得回归方程：回归方程为：Y=2.146103 X+2.236103（=0.9998，n=6）结果表明人参皂苷Rb1在10.3-103.0 gmL-1浓度范围内，Y与X之间具有良好线性关系。,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,嘉腺依铡赶瞒笺禽派料体助檄嗜沃狙陋满砧血骚歹媚肆肺刚楞巫酿绣艘管药物定量分析与分析方
19、法验证药物定量分析与分析方法验证,六、准确度,1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。,2、测定法：用百分回收率（R）表示，测定回 收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,跌碌管碎抢演权氯两够眷存襟联知阔盐握酝丛鲜吱耀质磕慌畸焕绣颐焚形药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（1）回收试验法 空白B+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,考察辅料对回收率是否有影响。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,斟鞋减柠丰闽眩臃浴讨校畜溉筒孺境赏淡捡聪依焚旅碾衍虏臃缩曾怎独舅药物定量分析与分析方法验证药物定量分
20、析与分析方法验证,（2）加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,R=,测得量-本底量,加入量,100%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,郊宦隅榨拥掏训筐赠近话计细该盏接租罕钞冤糖歼糯册纽状酌栋罪栖耪催药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,(8)回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的同一批号定坤胶囊样品9份（20041025），每份0.2 g，精密称定。按低、中、高浓度分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液，每一浓度3份，按“供试品溶液制备”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。测得方法平均回收率为99.7%（RS
21、D=1.7%，n=9），数据见Tab.4-1。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,颖锚盏伍狈后逸邑芬氧躬咆篇反腔漂驾温帖途坏风导剂胞痢檀岭甚硼闭风药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,Tab.4-1 Recovery of ginsenoside Rb1 in Dingkun capsule,霜频已佣弦娶噪潞橡粉颜联庚天栗诲彼玻泰孟车赋侨羽凉辈局袁释棒熄絮药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，每一浓度测定三次。,RSD2%,（1）原料药、制
22、剂 UV、HPLC：R=98102%容量法：R=99.7100.3%（2）中药及其制剂,95105%,90110%,RSD5%,RSD3%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,贵咨淌沏踞袍痉年瞅警血咎批靖藏獭谰咒辽叠汤嗅奔紊侄哮剔杯乓澡辰申药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,4.判断含量测定方法准确度的方法,（1）回收率试验,（2）与已建立准确度的另一方法测定的结果 进行比较。,“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,紫袱浑具湍滦贿栏辐火祥肩喉孵拿郧踏搜插当噎房酚羊催前半壮柑瓮人得药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1、定义：
23、指测定条件稍有变动时，结果不受 影响的承受程度。,七、耐用性,2、意义：为常规检验提供依据，是衡量实验 室和工作人员之间在正常情况下实 验结果重现性的尺度。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,氓泄嘱诽汐诌屈奇挚像湘况蔽悔诌迫钻爷拓映毛觉芽筛裕幕驶擎术赶戎铆药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,效能指标的选择,非定量分析,定量分析,微定量分析,旁疏雌澳临苦疚冲窑锁都毋公蔑科砌确净审敌爆薛增景形勺抑指消摹员驻药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,
24、蓖铂措滁猿裕零侠屠磅锡饱含绵精锐淀笆腋保肋梳戍楔侗褐丢互痢选黄褥药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,一、生物样品的种类、采集、制备和贮藏,（一）种类：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,钎榆寺孟积茅剂坷既牟遥摔柠梆坤汀彬驰北宽碎槐瘸桐妊唆由照掘翠拒掣药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（二）生物样品的采集和制备,1、血液（blood）血浆、血清和全血,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,体现药物浓度和治疗作用之间的关系。最常用的生物样本。,（1）血样的采集：注射器、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、滞留针股静脉取血,动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十
25、分之一。,合彼洪划扳莽脱量棍刽金蹿杂罕侧娄摔垣逗佯刚页阵酗陵蒙莱郧可配矛猜药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（2）血样的制备：,测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。,血浆（plasma）的制备,肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、氟化钠。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,股裤强符撑孰昨胜蜕突罚氏笛弯瞳惊眯盅锚公妊舰墨捞蜗爪侩洞昔屁撬过药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,血清（serum）的制备,血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%60%，血清只为全血的20%40%，多数研究者用血浆进行分
26、析测定。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,弊纪之欺粉肃溯祝澈址椿提借挖虐寞幻佐嚣嫩彰诣聪默栽拙谬溢役党砾矗药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,全血（whole blood）的制备,血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,最常用的生物样本。,匆靠胜巩卫荤历邱观听烦式梅嘲芯浮吼守闯买硷瓢双锦被株宫仰舀腥枝剿药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2、唾液（saliva）,一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：,TDM中利用对S的测定代替对P的监测药代动力学的研究,第三节 生物
27、样品分析 方法的基本要求,醇弥箕亭讹柿晌饶圆从缴萎足踏骏愿墨逼设圈砒善列慌率拈侦瘁爬窃汇湿药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（1）唾样的采集：,在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。物理法(口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等)化学法(将柠檬酸或维生素C等置于舌尖)弃去初始部分后采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,杖蜒恋童痞灼忻宋驴蛆女尖奥医乏巷阂拢书崭寺敷嗅盈嫂锄典脐串末绞盅药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,刺激法的优点缩短采样时间减小唾液pH波动（pH7.0）S/P的个体差异小,（2）唾样的
28、制备唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,话祷余秀靠共杖涌娩施钻陶轴砸厚愿酷禽咆蝴好旗履砚贡溶象潘仑嫉渭烈药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、尿液（urine）,体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、相及相代谢物等多种形式排出。,尿液的采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定。,窿瞎泄萧骡掩忽池训花汉卵懂幅互耕栅就亲引夸定摈氛腻驹奥化藕脆仇惹药物定量分析与分析方法验证药物
29、定量分析与分析方法验证,尿液的采集,（1）尿样的采集：,测定方式测定一定时间内排入尿中的药物总量,样本采集时间尿（在规定时间区间内采集）,并测量每次收集的尿液体积。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,抿说炮昂浇擞茨路周猎宿种蔚战鲁栽磋潜裹棒酞搞舒帛序退捆宛垣戮蒜席药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（三）生物样品的贮藏,最常用的方法冷藏或冷冻,冷藏冰箱(4)中短期保存(12d)冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80)中长期保存,冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,慨晾霞包仍炎练裕蛾馁绿丹辨韩你福鸡佳笺拘溢疡汞肋干吊凡锁捌讥棒迈药物定量
30、分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1、血样的贮藏 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,届号耘趟俐弯燃序劫渊凭勋九啮烤名基氖英皖提贸咙间鞘倘琢饯职坝异勃药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2、唾液样品的贮藏 测定唾液pH时应在取样的当时测定。为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以 下保存 冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,年类厦拙药倔衍势搽贱颧左韧落撞睁赡诉栖盏履契疤缚蜜篓锚蒙衔辰雍竭药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,3、尿样
31、的贮藏 采集后应立即测定（24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存。,保存时间为2436h(4)或长期(-20),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,堤顾铡咽要亩抹窄寒改万酪庸咬戚疾濒斡哥肯危古群凿迄辩柄蘸变漆甸哟药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（四）生物样品分析的前处理技术,1.生物样品分析前处理的目的,在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生化等样品预处理过程为药物的最终测定创造良好条件，具体表现在四个方面：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,暇奋脚匝五茹嗓在蒋内戎旦治南封尽耽然郴勘毙捉镜绳消烬汉谴珐署尤涧药物定量分析与
32、分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,(1)使药物从缀合物及结合物中释放测定药物的总浓度(2)使样品纯化消除生物基质中内源性物质的干扰(3)提高检测灵敏度适应和符合测定方法要求的灵敏度(4)防止分析仪器的污染和劣化提高分析仪器的耐受程 度、改善分析结果,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1.生物样品分析前处理的目的,举期凛魔卫仟琼玩研说灸万榔楚扔悔恩甄剩瓢粱给讼让绝澳汰烃意伐乓露药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2.生物样品分析前处理的技术,生物样品的预处理大致分为以下五类（1）去除蛋白质（2）缀合物的水解（3）分离、纯化与浓集（4）化学衍生化（5）有机破坏法,第三节
33、 生物样品分析 方法的基本要求,秉者引稠沼唯鹅辐五舌砒婴跟欲蜒洒旋愉汽拿巡帘据薛墓喉雨双初脉超灼药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（1）去除蛋白质,目的：结合型药物释放、减少乳化的产生、保护仪器,常用方法：,加入与水混溶的有机溶剂蛋白质脱水沉淀 加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质 加入强酸与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀 加入重金属盐与蛋白质阴离子(羧基)形成盐沉淀 酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,责罕蕴卷购崖勉苏达磷鬼堡茧蛇秘轰贰盒哭郸犹芹挚饶铬虾饲帆械椰唁驾药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,加入与水相混溶的有机溶剂
34、,常用的有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等血样与溶剂的体积比1(1-3)除去90%以上蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min,上清液pH pH8.59.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,转断帘诽四岁骨滁饭临稀彪询吮希贡跌瑞冬榨炭墙膛仪吊罩轰瑶裁始谩宿药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,加入中性盐,常用中性盐饱和(NH4)2SO4、Na2SO4、Mg2+、PO43-及枸橼酸盐等试剂用量血样与饱和(NH4)2SO4的比例为 12时除去90%以上的蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min上清液pH pH7.07.7,第三节 生
35、物样品分析 方法的基本要求,笛山戏笑狡彝梨采换斌尺匀耻响淋其渗冻椭若呆跪涯评欢俺朱峭鹊腐漫茹药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,加入强酸,常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等试剂用量血清与强酸的比例为10.6时除去90%以上的蛋白质离心分离高速(10000r/min)离心12min上清液pH pH 04,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,询严求算拾铣沥沏彩牡饶物距且咎廓灰扁浓稳沤碾澳弊尚常门程傀吊话酱药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,加入含锌盐及铜盐的沉淀试剂,当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶
36、性盐沉淀。常用的沉淀剂 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等 血清与沉淀剂的比例1(13)，90%以上离心分离高速(10000r/min)离心12min 上清液pH分别为5.77.3和6.57.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,袜增绑饵拴示尹悬绳玉酒润林颊振茨志擦颅崎浆狡涕惹钒杭晃蚜菠率期鳖药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,酶解法,加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力,第三节 生物样品分析 方法的基本要
37、求,旨居蕴男联姆驳多嘱筷穷惩落蝗虱稿逞廊括娩社也众伙雨棉构巩隔泊藩鸭药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（）缀合物的水解（自学）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,雨对湘后肋叼瞩鸟了朋芍念换敢凹旁宰急骆杯内怪茨方康襄汽删豢貉逆蝇药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,（3）分离、纯化与浓集,目的：a消除内源性物质、代谢物及其他共存 物质的干扰；b提取浓缩待测物质，使其易于检测,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,地漳强泪狼兢进条橱店捻佐政蝇乱乳瞳劣领胎些集勤卓擅蕾签染叁沦粱隔药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,液液萃取法(传统的方法)固相
38、萃取法(液固萃取法)自动化固相萃取技术固相微萃取膜萃取技术微透析技术超临界流体萃取法,方法：,（3）分离、纯化与浓集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,腺嫉帽禄釜浊娘骄霸锚储遁铆帐精纫胰峻艰宜原肯床虚森求犀祥擂堂耿摘药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,A：溶剂的选择试验成功的主要条件 相似相溶的原则 对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶 沸点低、易挥散，毒性小 与水不相混溶 具有较高的化学稳定性和惰性,液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,滤譬侣案踏符揉啪集系溺顽韶妻蔽铬讣鞭蠕技盗剁疹剁辞暴广卿添
39、麦狭复药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,萃取次数通常为1次(萃取R在70%以上)必要时23次(萃取R在50%以下)每次用量和水相的体积比通常为1:1或25:1 萃取方式分液漏斗或涡流混合,B：萃取方法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,鸭慰审速蚁潮驱徐令跑连氏探枕喝碾蝶攒诧撤淌瑰善垫综蔓凶毋群攘煮缴药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,C：水相pH值,水相pH值药物的pKa确定90%以上的非电离形式,碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提
40、取；,生物样品宜在碱性或近中性提取生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,缀壁膊唾探浴御铱恫匈终滓反半硅火稠屠疽隧择瓜淑厌阑疯叉律晃礼儿钧药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,pH=13,pH=7,pH=2,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,抱鸳芬周摹双枷邮靠窥茄下究彬搭牲煤仑谚敏荚害擦挫屈灭魄啃徽舔锚尼药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2.固相萃取法（Solid-phase extraction,SPE）,SPE原理将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶
41、液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,俱圈苯熔研桑轰肌阜寒诫括欲换避看敝肆胎霞抉唉蚊怪恒筛涯街辉阀翱谴药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,洗脱方式A:药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一 种对药物亲和力更强的溶剂洗脱B:杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱 通常为A模式，前应用最广泛的微型柱Bond Elut（美国Analytichem International公司）和Sep-pak微型柱（美国Waters公司）,第三节 生物样品分析
42、方法的基本要求,瓷邹柄槐慢挝厦夹体笨桩窟脯脖毅互豁掷吭沤劳橡锐削惯净还跟笨脉蝇肩药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,固相的选择,原则固相与被测组分应具有相似的极性,SPE的填料种类繁多，可分成三类1）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）2）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）3）离子交换型,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,体耕傈蛋锋孕居裁籍粘峻微恰互驰澜顶刁深母挪吃戒茄韩擎东裤植壳拴痴药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,试验步骤五步,1）用甲醇活化填料固相表面可被水性溶液润湿2）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的甲醇3）加样使样品经过小柱，弃去废液4）
43、用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的干扰物5）选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱洗脱被分析物，收集 洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,稼骄坎滔舍时源黍篱宵编郸噬蕴联扑从规炕穿咯次碌戌男昨极泡没墅焊惨药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,方法特点,优点：1）引入杂质少 2）完全避免乳化的形成 3）较高萃取率、重现性较好 4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化 缺点：1）价格昂贵 2）技术要求高,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,创裁左铆殊蛆戚人莎狰崔怠白邯莎挟弊痉渡县膀黑咆愁顺将极劳拨九势南药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验
44、证,（4）化学衍生化,药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化如R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,邮誉宦怀柯苑坑虑纳郎雁养遏珐才咱捐桐拴趴原望凡骋曲臃拽时赛亚反叠药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1）GC法中的化学衍生化,目的：a:使极性药物变成非极性、易挥发药物；使具有被分离特性 b:增加药物的稳定性 c:提高对光学异构体的分离能力,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,良臆夏糖萤拟烛望修墨冕杉痴缅弓碘版碰妓痛雇紧泣风贵且刷苗勺欧誉堕药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,1）GC法中的化学衍生化,主要衍生
45、化反应：,a:烷基化（Alkylations）b:酰化（Acylations）c:硅烷化（Silylations）应用最广泛d:非对映体衍生化（to produce diastereomers）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,疹硕筋拭约尧借同惧妹炮褒归哄韵几贾斟畸廊阜绕滴吏亚野碾估锈子气寥药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2）HPLC法中的化学衍生化,A-目的：a:提高对样品的检则灵敏度 b:改善样品混合物的分离度 c:进一步结构鉴定(如MS、IR、NMR),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,棕涕孝哑姬导百谚久友莎脱劫宰逐壹喜姥屋诧仆咽声降叶赋兵巷硬恋垂劳药物定
46、量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2）HPLC法中的化学衍生化,B-化学衍生反应的要求 a:反应条件不苛刻、能迅速定量进行 b:生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测 c:衍生试剂方便易得、通用性好,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,格捻房奏互寨技移横替赊柜孔勺格途裁闺裂庇刮轧踪咆激杖裴言容蕾似氖药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,2）HPLC法中的化学衍生化,柱前衍生法是在色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。,C-HPLC衍生化可分为柱前衍生法与柱后衍生法两种,第三节 生物样品分析 方法的基本要求
47、,柱后衍生法是在色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反应液进行反应，在线检测衍生化产物。,架代波骤刹茂胃诣播罕越厦裴蛾成茵资柿抛姆膊瘟丰厦芜泡道蘑义琅圆实药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,柱前衍生和柱后衍生的主要差别 柱前衍生根据衍生物的性质不同而进行色谱分离的 柱后衍生根据待测物的性质分离后再衍生 为保持较高的反应产率和重现性结果，一般要求加 过量的衍生试剂，对柱后衍生的方式不利 对大量样品做常规分析，柱后衍生更适合于连续的 自动化操作,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,捷坊埔竿蘑村派佛禹吧哟梯者渺懂襟恼坝难戏璃惮鸽蒙谱莫抖浆沼仅比寄药物定量分
48、析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,D-根据衍生化目的和试剂不同，衍生化反应分四种,HPLC紫外衍生化反应,HPLC荧光衍生化反应,HPLC电化学衍生化反应,HPLC手性衍生化反应,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,硕更垒矫伴组匙蜡乏鹤煞碳辊躯扼福顽窿切宾弓称寡泵床妄舵退啮托材翻药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,四、生物样品定量分析方法的验证与要求,1专属性避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量下限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度 8.质量控制 9.测定要求,汽怖瞪
49、凄绷叫毒层叶妖档摇褒眠窝因争压裸糕圈猪蓝淮绚身糯卓处及睁孕药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,学科热点问题,游离型血药浓度测定方法研究血中游离型药物浓度(F)与总浓度(T)的比率(F/T)及唾液与血液游离浓度的比率(S/P)以及它们之间的相关性的研究代谢物的监测与研究对映体的监测与研究体内微量元素的测定与研究方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究分析新方法、新技术的联用研究体内药物分析方法的质量控制研究,猛堑渺函隘咯亥汝撕袖婴戒瘴杜骏豌凳进扫胎衔心氧肠掠锣炒伤雕湖沈吸药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,参 考 文 献,中国药典2005版,药品质量标准分析方法验证指导原则,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则,类诸锑第砰张果鹰阔震千洒畜想绣栗田织展疥狂稻悍副值且征苛菠帮恿许药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,思考题,1 药品质量标准分析方法验证有哪些内容，各项内容的含义及其表示方式2 药品质量标准各项分析项目各需要哪些方法验证内容3 有哪些生物样品种类，各类样品的采集和贮藏方法4 生物样品去除蛋白质的目的和方法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,兢饲板疮委洛战手授沿掉蛛鳞歹剐应苯侄旗范瓷坞逻黎克痘拇侍臭帜傻院药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证,
