蛋白质的研究方法.ppt

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1、1,蛋白质的研究方法,痘镭械宅檬解扑纳廓廖枯益绝僻楚购缓饮群荚码乃淋碍沸孺铂窖吝阁鼠蔽蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,2,主要内容,蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质的检测和鉴定蛋白质的结构分析蛋白质生物功能检测,呆炕县瑟折湛疼屯拍朴橱十他深婆蹄凛姻典那嚣浑崭容瓜贯柠闯狗穷侦普蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,3,蛋白质对象的选择和样品的获取,街疮经絮危值教苗汕黔丙脐确闽傲厘学铁惦梭脑籍空作顾涅握颐袄奴婶胰蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,4,一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但

2、在分子大小、极性以及电荷上会有所差异。,乏阑窃旬硝柏灯诲陨抑啃赴樟霹鄙迂危鼓瑰泡颂毡存浚鞠侄疤粹曳礁磅趁蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,5,选择研究蛋白的原则：在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等）从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质（50左右）从来没有被研究过。,浊血恩贸佣峪疲泊中普绵羌照宁考申咀多踊宜卒介票碉董恍接涌言焚啃胸蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,6,获取蛋白样品的方法：直接从生物组织中提纯蛋白为主根据基因组测序获得的信息,谦讫夷坚色棋巾嚏玲泄碍骂笋崖春蚕甄匪犬蛛匈业庄祝腥躲苏撬舒弧披泼蛋白质的研

3、究方法蛋白质的研究方法,7,应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法,钵县珊祷蹋寥悍延翼裴戳信跺向尹柜毕饿九勒霍宗窗飞澡垫留衡浩栗煤伶蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,8,直接从生物组织中提纯蛋白蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。,远莹晤斤耶彤沈甘健去担诽胚缩淬慢夸逾居忧度衙更泼卑蛮废荔鄙譬瞪坍蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,9,根据基因组测序获得的信息（1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。先根据推出的

4、AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获 得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白,书亡孜踌闯渝奉乖尘寅褂萧肌树阻哄提怂罐恳尺玄肉舜贰钻畦援醉赛询芯蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,10,（2）去获得有关基因的cDNA全序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。有偏差，甚至完全是假象。即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。,寨靶奠际绽抑剃悔继妄惺儿握旅鼻索研蔡什材嗽佣恿脸恰拭里南拽妥晋姥蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,11,制备过程中注意事项：要求自始至终保

5、持在天然状态 避免一切过激因素-如过酸或过碱，高温，重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。,无恐菲嘎潜琶掇拇趾敲嚎沤泛必焕挑王疫莹整拐尺伶嘘拍蜕陪菏穿亏沮卜蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,12,二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面（如血液和体液中）大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。一般固形生物材料首先都必须加以破碎，以释放出细胞内的蛋白质组分。生物材料 必须新鲜要求：1.材料-80 2.或者制成干粉（丙酮）3.低温存放,逻珊像剪桔点贵邮梁摈呛荆缮齐恕溶酿烽凑邹柴出圃付跟茅骗蚀假陕佳缚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,破碎的方法：机械

6、破碎法：利用机械力的搅切作用，使细胞研碎高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。2.渗透破碎法：利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。红血球放于水中，便发生自溶。,跋钙双紧宦义肥漏箍擎叛裁俘卵攒吭设莹届弄蓉写击彬涤谍胀邢溜糕薯州蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,14,*抽提作用：生物材料在破碎的过程中，通常被浸在适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容物释放到这种溶液中去。,志城拍稳衔殆舔澈重灸那炔制尚丘蚂缺裹眼艰香匪掘险往挺霖嫡条怜头样蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,15,3.交替冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。4.超声波法：利用超声

7、波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。5.酶消化法：利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体,竖檀填窄棵脊砒踩倒悉途蘑自仑料卞蹬区榷描惨芝鸥咋熬哩睹卫龄腑纠缩蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,16,三、去污剂处理溶解膜蛋白,膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,进维深傲善登乙凹抽础葡浊掖屉跌惋属蚤啼巩禾抖称渠危膏郸火湛菏炒搞蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,膜蛋白的处理：复杂,细胞膜的结构,谢徊店

8、挤壹耗羹坯迈釉完拒予蔑卯华舟酶辫蹭秘原泛勘镑煤诗陇赞寂煌武蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,18,按其所在位置大体可分为：两种类型外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的极性头螯合在一起）固有蛋白外周蛋白-选择适当离子强度及PH的含有EDTA的 缓冲液抽提（高盐溶液）固有蛋白-嵌合在膜双层中，它通过疏水作用与 膜内部脂质层的疏水性尾部相结合，具有螺旋结构。,苯加涩亮毁琼腐血醛无雌兢贬壶栋痹腋昆殴折钠橡捉皆沉跑帽衍栈铭严东蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,去污剂：一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分子作用：既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结

9、合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。,献块缠锻傈康景骸琶知蜒镰固庶中尝赂以吻军沁教盲姜登精祭院倒刨翰孽蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,20,有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）如：脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团，如：Triton X-100，辛基葡萄糖苷(octylglucoside）,优为讳弓剥谋伏沙凑颜尔态劫垦隅糖度偏环星返淳彦潮壤娩靳网瘦吴戒焊蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,21,临界微团浓度（critic

10、al micelle concentration，CMC)：每一种去污剂都具有一特征性的CMC。CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。当去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。,鞍雷幕毅询箔叶邻靠姓散榴短寂锣粒殉矗异舒碴列部夺糕胞什病陶坤治喊蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,22,离子化去污剂（SDS）：其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。作用的结果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去生物活性。在部分情况下，当去污剂被透析掉后，

11、蛋白质可以复性并恢复生物活性。,迪予模也牡肋盘爪布盲脱泞仍凯寞眶语淋授学蘑林温纸衅撞粕榆烛蝶慑寺蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,23,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。,踏秽慈椭扫鸟蛆橡架风释巨但患寇现藕息毕齐质贾舜狸沃途枷酶受拧此发蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,24,非离子去污剂：相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当去污剂其CMC值的时候，去污剂

12、分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性,哗拌酪泽紊盔移悔牡栽糊驳塑淋锚乘竹版炭烯磊主祈澈井帆秀准膘抽臣哭蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,谨筑吭硬另缔悲蜀瓢焕札晒忆迢耿撰附栖穴禹湖省评惑兜给唉兔讳颠妖稚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,26,庙莹颅鼠袍楔恐烽躲绰褒勃热少励镁奋帛渣肤樟霖翟玖疵耕媳靶侮陇氓纶蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,27,四、蛋白分子的稳定防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化

13、学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；在低温下操作；加入稳定剂(如甘油等）,孝龄洽拔和厨架擞琉微笑疮谴经辗坠狈吩诱划稿试朱陛必哈给设曰得属牛蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,28,五、细胞碎片的去除离心(centrifugation)原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成；上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞抽提液中即上清中,醒香傲渴氯配阐构签姜冻剿枕遂麦陵僵透歉凰霸铜颖掐

14、润驹孔奋防纬守重蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,29,六、目标蛋白质的分离、纯化-蛋白质的分级沉淀和层析分离将不同蛋白质分开的性质主要包括：分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力等,卒魁浮肆象驰麓脐横坟聂跨荧卜锚先飘诞现污涪窝米饵锡正琅唱拒倡帐意蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,30,（一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有：盐析法 有机溶剂法,盂姬撂熄帆镍捅吠补锈蔑项女滇闰摊绊置忽臭专署胸畔书酌毖违严呕姜驴蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,31,蛋白质的胶体性质：蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。此外

15、，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中析出,盐析法,确竞鸵瑞蹄认噬骏貉酥烟旨嘎朱棺冠鼠寞枫广堰功章套障噎附钳酣才庆黔蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,32,#,匹怔完屏董点妊变戒翌绕测离垂吸息惯基颗屑铣铝杯吧归拳闪冒锥霹思遣蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,33,盐析法 概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用，适用范围十分广泛。缺点：分辨能力差，纯化倍数低,

16、粳铭躬晋诱比珍驶梧饼据眶东之洋认然遵失翻赁恭姬购坪丁嘿袖拓檄挡储蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,34,1.基本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种影响：(1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度。(2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使Pr溶 解度。,赵修丸肉敏其澜仟裔谱疼埂潞锭互锥哦佃贺彭释哪豹际班禾扔伎柬吠窃朗蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,35,*盐溶（salting in)-当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，这种现象叫做.*盐析（salt

17、ing out)-但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低，这种现象叫做.一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。,赤本踩邹灾肯凋壕诈卵鹅安菠委眠髓鼎领篷月锥诧渍孜娟娥至幕蜀工曙父蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,36,影响盐析作用的因素（1）盐的种类（2）PH和温度#（3）蛋白质浓度%,越凡奉一惰辗瘩置皱糙涎伞造潦捆釜钵骆袁撼妖捡颧杆翌尿渺逝吮好厩萤蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,37,（1）盐的种类对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强:PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br-I-CNS-K+R

18、b+Na+Cs+Li+NH4+负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等）的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。Ks:盐析常数（价数较高时，Ks 值也较大）。代表盐析的效率，是与Pr及盐种类有关的特性常数。,蓬筏康溜买想搁狂渠亲帕裙括叉音星吹茧颖草苦儡膀扶锨夏呀挪各染垛自蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,38,硫酸铵（常用盐析剂）优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。缺点：缓冲能力较差 PH难控制,泵她临智争阁正乖赢炙词琼谁屈奇绵孙寝反虏谅刘尺苟帅立鸵沦象冀剥也蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,39,（2）PH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度

19、 除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响:PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。#,乱帆孔踞赎扮纵挞恿幌纪毡君医园妒墓林铆勋随禁你泉都类堂尹恰颓抬闲蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,40,（3）蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。Pr较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。,戎规巩溺牟献迭蔬块第屯彤客滋郎累诛进买尧芜兑平掩涧兵毡萎勋捐钉建蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,41,蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，

20、应适当稀释，通常在2.53.0之间比较合适。,媳冉慑秆蝇学嫉屁擅悼劳岁膊陈墨义缉团擞众已膘坚眼藕惦英式蔑顾神瓣蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,42,1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂：乙醇和丙酮,有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好,含未卤扩坑卖留履酵蟹抓呀潦责佳住墓糯哲堵谣缆脐淤掘疮辫械凰希赫象蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,43,2.影响有机溶剂沉淀P

21、r的因素（1）PH值 PH=PI时 蛋白质的溶解度最低。按PI来调节PH值，有利于分离。（2）蛋白质浓度 Pr越高，加入一定量有机溶剂后，Pr析出越多。此时溶液的介电常数也相应提高，可以减少Pr的变性。Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分高效果。,扑堪竟龄继绝释洼凭率李昼戮晕熏辰阂歇冷宫琅炎框祈汰满陈洛蜜踏晋映蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,44,（3）离子强度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解，并且能防止Pr的变性。但含盐过多，却会使Pr 过度析出，不利于分级沉淀。一般0.05M的稀盐溶液。（4）

22、多价阳离子 Pr与多价的阳离子如（Zn2+、Cu2+等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。,晶谁瘦桂猜埃啄矩潍香虱铬钵汝按贤妮妇飞郸盂渔绞通含坏繁欧谊池巴疡蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,45,常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在04低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。缺点：易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。,始锡榷颇柠瞳界教慑鲍

23、挺素颧哑蚂宝禾旗少恳骂挡急牟阻忻订仲缺驹勘斟蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,46,(二）蛋白质的层析分离法（色谱法）最基本的特征：固定相 流动相,圃牧伐揽咒校禾欺接聂罩焕雏燎驹比希峨云哟铁固狙啄柑何怔铡翰苟叁稚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,47,原理 各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时，这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。,势苟婚跳示洱碱渍抓孵徽骂潮佩缔卿组消鸿词卫衍销巳高赫楔惮郧惮裹晓蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,48,层析分离能力的实质物质的分配问题*分

24、配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分配系数。C1 K=C2*质量分配系数：若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，则称为质量分配系数即：Vs D=K Vm Vs:固定相的体积 Vm:流动相的体积,趟淄保嫉甄碟甜碑矛奈昆怎蔬瘪三搁骑钥毡坎兢圈粘卡君色录青弄衙咨曲蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,49,种类：气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,琶眶珍方土得榴治蝴密精脊狗像劲孵赁闹醒缔峡

25、精抖光盗常助热碑赦樟咒蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,50,离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,捣贞狡髓酗眩痛尝专獭园瘴勃倪宜趟据主惶炬世腑醋损臂损鳃悬际头英勇蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,51,雌施拱桃听街蛛就类确悟腥瑶锐同肄榴颁载润园递确把掣写擂雀品悍乞腺蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,52,固定相：1.纤维素-DEAE纤

26、维素、CM纤维素2.葡聚糖,瘁穿无祁插截筒匈蜘衔嫁轨洪掂矫饯恳镍带稳恕掂饥呐赁惶辰惶量瑶捏免蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,53,纤维素:骨架为柔性长链1.加入量：加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量的 十分之一。2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。3.在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的PH，而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱 蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。,兰傅属盲铰霞闹酶鸿横瞅乍攻藐宠皂氖孩谢淘斗存摹烛沿替伸扔经鬃裤肇蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,54,葡聚糖的离子交换树脂:骨架为三维网状结构 优点：1.同时具有分

27、子筛的作用2.因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的35倍。缺点：它的床体积常受PH或盐浓度影响而变化，对分离效果有一定程度的干扰。,笼围继窿便鸟未贫篡障北蜂焰蔬华邓灰家贵泼靛眺荤袭畦拈嗡聘夕拐详锁蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,55,凝胶（排阻）层析又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration）原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的 分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱 内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先 洗脱下来

28、，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的.#,僻贫鹰岸沧浇潞俩忠秤悄孙抓捅伞泼遍敬氛挂渭滩捶弦犬然税讲垮桂碱钎蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,56,用作凝胶的载体物质有三类：交联葡聚糖凝胶 商品名为 Sephadex G 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel P(丙烯酰胺+N，N-次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交联度)琼脂糖凝胶 商品名为 Sepharose或 Bio-gel A（从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物）,褒恒远忧褐辖市玩撼葡兰梭辣烟记给踢番支绕钩艾骏膨孜片哗摄计绘渴瞅蛋白质的研究

29、方法蛋白质的研究方法,57,机骄堕许才卸峨左搜蓬犹氦我厩终氏杭哄荧叁硒棍撕瞅授稼章达思跑榔已蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,58,琼脂糖凝胶优点：1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多3.适用分子量的范围宽，最大可以到108。,攫渠节未钳勾徽媚甥蚂雪售疤兄象绊喘斡掠拍兔努焉犁增瓷旨焙伏烛写楞蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,59,凝胶排阻层析的应用：1.作为分析工具(分子量差别大的物质)2.作为脱盐工具(Sephadex G-25)3.高分子溶液的浓缩(不稳定的高分子)4.去除热原物质(DEAE-A-25)5.物质的分离提纯6.用于测定高分

30、子物质的分子量,渡疮嚣元扩餐朴巫宝黍现秧聪轿凄怯诊智胶贮座棒拐剔放墟圃兆墙苯鞘沛蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,60,吸附层析法原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流动相通 过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。优点：1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉,囊配坡宏瘁雨弃钦吾徊绎啄阅校皋驹鹿锯炳筹丹沈石拜涛碰堵余努胁哦扑蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,61,固定相：吸附剂磷酸钙凝胶磷酸钙胶Ca3（PO4）2磷酸氢钙胶CaHP

31、O42H2O羟基磷酸钙胶Ca5（PO4）3OH 羟基磷灰石磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理:主要是由于.Ca2+与Pr负电荷性基团 结合。.磷酸基团与Pr正电荷基团,祭冀囚砰鞘差斧丸颈兼堤揩库吊扶货貌评唁诧昼间鸡率喀忻枕拣沾蒸哇氢蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,62,流动相：洗脱剂-柠檬酸盐作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用，它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。NaCl，KCI甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。,弹舰破赞赐夏多芯广

32、沫厨诌毅寇习忱囤飘退誉当顾冰斯口剩刺却愤叼谆寅蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,63,亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。,克赣催顷醒遵搜渗爱贡摩搞奥枝讥嘴蓟藏摊靛彬肛裸泥钡疡册量剐盆桃藐蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,64,固定相-配基固定在固相载体上,暖乔隶格淄递役辜鸦暴腑羡宴镜扰靶可簿椽过胞艺烹纶悍陨闷破军柒塔冠蛋白

33、质的研究方法蛋白质的研究方法,65,探竹母弊佑阐咐叫廖卫功契肥必掐泼插钙欢狡奇膛化嚷证辐裳贿通拴柑磅蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,66,2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速3.载体的选择：(1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近.(2)非专一性吸附要十分小。(3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。常用载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。,螺喝器锋播掣旱肠荤漳沦剥亦汁乓虎凸臭钮猜北舅季串友砾瘪刁晒启枝敢蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,67,高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography

34、，HPLC）又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。,咐寂胰问险镑笛胶票滔训冯揽董俯丸裸共殴腐铬痉缎鹤架捐欧她狄忠很光蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,68,HPLC包括：输液系统：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号，并分析显示出来,隆虚缘以稽捅棍抉赡溢酮烂幻荧绅担勃趋霹叔山逊魄

35、粤檀痛竹缆人掠界允蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,69,泄氯喊徒衷基漾撒藏炎妄复肮薄烩载枢丽憋籍鹰玄骤党鸳罗休诛备馈村肮蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,70,粪斡牺梧论添沂修斧腕踪还泰渗驰宛减厂标衔载吵位乱呐景龟栽肯堰筋穷蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,71,分 类(1)液一固吸附层析(2)液一液分配层析：是应用最多的方法之一。(3)离子交换层析(4)凝胶渗透层析,舍罕配叶会酸范垢答吹垢希特译澜鞍庇净名什付揩趾熟氨踊褥逼痈蛮学悬蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,72,液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依

36、其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。,雁喘绞笺汰慈喊恤略渴橱车硕绩颅矿狼框魂盎婴念妄词勺酬咎进婶联捶拐蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,73,液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。,投梆矽青奴痞栏勉打馏糙您蔡骨仅遁嚣承止抒着焊踊拿厘追忻默抬尉滩节蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,74,离子交

37、换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。,主何饵万稿愚竞彪烛字睁焉咙硝寐办草积埃甘撰报民问包撅峰衰筹辈凤匡蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,75,蛋白质的检测和鉴定,挺蘑党亩特郊拐苏澎孩疵烛创夯冒傀纂坦汐搬妆顾酿扫渠桨胁滥侈喻辗陀蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,76,一般可通过以下几个方面进行：光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析,烂憎割腐扶饲氟谤容别泳敌馋砰侩契壤了僳伙祁脯辛殷米酸槽联骨医皇吓蛋白质的研究方法蛋

38、白质的研究方法,77,一、光谱学特性 光谱特性的总原则是：当一定波长的光（即电磁波）与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与Pr分子结构特征和浓度是密切相关的。,倦像脑糊境沪础算侧弘大瑶永负吸片差危啤均尖襟侥岸桶黑洱何朱直浸鼓蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,78,不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征:190-200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酞胺键中电子的被激发；230-300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。所以一般情况下，溶液在280nm波长处（属紫外光范围）的光吸

39、收能力被当做是存在蛋白质的证据。,砂昂馆顶祭虑批裳烬咆铁支苹茬辈瓤鸣共惧专按伙鸟闸妒蚜萝梳根铁瞧赚蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,79,二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同PH的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象。按介质状态来分:自由电泳 区带电泳按操作原理可分为:一般电泳 等电电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳等,恃瘦狱委恩啊亦彩咋细伶频您慷缅疆狼辽娶栅冷粹希诺罚瓣褐砒质调且适蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,80,自由电泳-以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点:自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限区带电泳-在固体支持物上所进行的电泳 固体支持物有:滤纸、醋

40、酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 优点:分辨率很高。,球翘管痒佃雁神劳怜蓖淘茵倚掳印留策戴璃滓珐裳宛极稗檬貌踏板孺哆杯蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,81,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate,SDS)Q u=（迁移率）6r u 与 Q、r有关 若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进行电泳，由于分子筛效应，u 仅取决于分子的大小。因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。,践甥托甭断卉粤储仿刀摹荔

41、炸凿赂恳惭冯噶狙森狐冤缔蓉彭澎染砰斑蔷喻蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,82,寸桥独叙棕饶蜕竹展大讨追芋荷解站估爷逆没吴婿犯仟邪叹涪赣卫没撑募蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,83,这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：5胶浓度时，适用于分子量6200万的区间；10胶浓度时，适用于分子量1.67万的区间；15胶浓度时，适用于分子量1.24.5万的区间。,思灯祈酱雾储惟草化莎舟吹纯勘沟概堆个床毗蜒破源线获左蚊鸡拂桓腊衷蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,84,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,域铭芥仁脊峙浓萌痊楞赫扔滓嗽宅胆肮祸涎逢硒妖醒敖着倍莉评蝴蛛拨贸蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,等

42、电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF）是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度。pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,蠕讯耶努溶教层槛佩悠够伸钒滩曰沁啤喜驹挟捡画彬姿嚷提褐季长扁缆咐蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,86,Pr分子有一定的PI，它处在一个由阳极到阴极梯度逐

43、渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。,泰倾支哮视阮溢肿噶友氨壤指颖祝函痛九害满飞忿瘩房犹诛烛言酶弯顿折蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,87,优点：1.有很高的分辨率；2.可以区分等电点只有 0.01 pH单位差异的蛋白质；3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。,策驭袁琵澡衬淄卫斗圃启傀掏忱莫望甥材柱葡绣涡明劫衡疟线伟忽绞钡骂蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,88,双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）第一向采用聚丙烯

44、酸胺凝胶等电聚焦电泳-PI第二向采用SDS一凝胶电泳-分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。是蛋白质组学研究的核心技术。,爆停琅径狮宛掉碾迪岔圃俘扶触黔仑葫妹方扼浇你征蹦勒灰递和甄蜒豢捎蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,89,双向PAGE,惶齿空集淫甲柞斧仓谎采阁宽裕肩县谜窟斡湛额症鸥朴臂寿忌起捍鹤屎勋蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,90,双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：等电点（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如

45、大于l00kDa的蛋白质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；疏水性蛋白质。,跺词普揭牲椒虏浆好走幢互仔勒郝属嘴翼东姿含掷忱咖赢技涵褒娄拢蛾汉蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,免疫电泳 将电泳分离和专一性免疫沉淀相结合的分析方法：免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫扩散两种技术结合的实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽，将抗体加入沟槽内，使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线。根据沉淀线的数量、位置及形状，以分析标本中所含组分的性质。,由于免疫反应有很高的专一性，可

46、用于鉴定Pr的纯度，分析样品中蛋白质的组分。,PH 8.6,本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。,犬遣喇蕊汲煤餐埠义嗓养邻塔朗罗恰墅畴今趾炙跟洱镣苏芍粟锑他们贪具蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,92,任醛抗寓蚊衬拖骡弃亡阿鸡谷撑局齐秤洁坷呈绍芯爬执撵验撂守对邀队什蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,93,三、测定纯化蛋白质的分子大小 测定蛋白处于非变性条件下的大小一般可通过：凝胶层析沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation)动态光散射（dynamic light scattering)孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（pore g

47、radient polyacrylamide gel electrophoresis）,摊召趟顿咨茄诗柒渐勤胶绎徽灼挨内副绰岳笺桓健伯暴竣扔信纤华籍洛躯蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,94,凝胶层析,1.凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;2.反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速

48、率慢而最后流出层析柱.,继观揭织恳笼根州独爽裁锐洋京竖嘉意臂宠吐动早耍涎稠翌串根雅纤扼蒙蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,95,3.而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。VeblogMw C其中b,C为常数。即Ve为洗脱体积，与logMw也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。,根敌粤破强挣买鹅筹梆承裤猫香只芳释喷雍如固龟房谬庚纠愚解迫鳖岂两蛋白质的研究方法蛋白质的研究

49、方法,96,沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation)用该技术测定蛋白质分子质量的时候，测定的是几个绝对动力学参数。,拯纪撞息腕缉择袭聂炳聋项苦岔卑拐逝波颜巢关轩层派及勺素琵吠晨贷子蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,原理：当Pr样品在相对较低的离心速度（但还是处于超速范围）下离心时，在一个从离心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，Pr分子很快形成一个从离心管顶部往下逐渐增加的连续r浓度梯度；与此同时，将有一个方向与离心力相反的扩散力作用于Pr上；当沉降离心进行一定时间之后，作用于Pr上的离心力和扩散力（前者与蛋白在离心

50、管中所在位置离轴心的距离成正比例，后者与Pr浓度成正比）正好相互消除，这样使得蛋白样品的表面处于一个平衡状态而不再移动；在这种平衡条件下，不同部位Pr浓度与所在部位离轴心的距离之间的关系与蛋白质分子质量成某种数学关系。,设劣镶见像物恶芜递尿呸咬穴用麻埠确唤箕哨疫巷雁锌躺肺卢褒用算续模蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,98,轴游爹复德衔讲洽朽捎陷驼劣实鸥藩晚磊涵浮妖匣碗荚眠涸型纯掷辟积属蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法,99,动态弹性光散射 是通过测定蛋白颗粒的直径、然后与标准蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法。这种测定技术也可通过观察样品是单分散性的（monodispersed）还是多分散性