蛋白质的研究方法0.ppt

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1、1,高 级 生 物 化 学,修徘砧妮涩夸同骆诀遂蕴酌斗红柿抵娠仲语狰羊需曰排诽卖硕猜十横你只蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,2,蛋白质的研究方法 第一节 蛋白质对象的选择和样品的获取,钻出恶矣卒芝史麦蓑却夜忧馅真歉喇友溪奋估萨曾弧倘四宗宠冷蔗涤垣真蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,3,一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以及电荷上会有所差异。,巾董撩衰苫蛆钧甸砸泊归杯川堆拟老庄翘抑志贴办锻钧坡扰叉弥危蹦钒砒蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,4,选择研究

2、蛋白质的原则：在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等）从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质（50左右）从来没有被研究过。,要粘窟岳奇慕畏周檀织长粮剩祟咆从扩乍暖求良芯共幸财漱概绎殊穆蜘消蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,5,获取蛋白质样品的方法：直接从生物组织中提纯蛋白质为主根据基因组测序获得的信息（1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。（先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白）（2）去获得有关基因的cDNA全

3、序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。有偏差，甚至完全是假象。即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。,牲舆减粗权屉腑拔副委宅舰躬李啥岳民斯化腐花粳师梢摔奠架靶婶莱没张蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,6,直接从生物组织中提纯蛋白质应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法蛋白质的分离纯化包括以下过程：破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质 抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。,赌宦羚乏舟

4、荫未奖皿地倡榜巡汕廷盛饵旨魏躇药意习蜕欧挖盗鸡旧墓搓进蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,7,制备过程中注意事项：要求自始至终保持在天然状态 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温，重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。,逐剃亥来铣威嚎尺脸椅护屿属樟皖效西往蔓沸蜒轩瓤肖今绪诊渗瞩绰揣曼蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,8,二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面的（如血液和体液中等），大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。一般固形生物材料首先都必须加以破碎，以释放出细胞内的蛋白质组分。生物材料 必须新鲜 1.材料-80 2.或者制成干粉（

5、丙酮）3.低温存放,距估钱竿奥书给噶初尊磅调混滓翼块拆区惩链闪又夫踏碎坏舱滞沤彪哆却蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,破碎的方法：机械破碎法：利用机械力的搅切作用，使细胞研碎 高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。2.渗透破碎法：利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。红血球放于水中，便发生自溶。3.交替冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀，而使细胞胀破。4.超声波法：利用超声波震荡，使细胞膜上所受张 力不均而解体。5.酶消化法：利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等 对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它 们解体,拄堂竞冠玛哼爸腿躇舀虐诵荧离凛秉题冉独松培渭唤

6、蔓栖潭性薯烦酶宜讽蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,10,*抽提作用：生物材料在破碎的过程中，通常被浸在适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容物释放到这种溶液中去。,图战质虹喝乞壳肛缮鸽疹侗彪贷疑僻名拧警赚钧峙诅狸遵壬鼓喻甸槐浇灶蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,膜蛋白的处理：复杂,细胞膜的结构,椅可页刮俩咙议范究助循勋驰幼宇效箔叛例针尸篆瞩猜钎小晋板珊痉嫁融蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,12,按其所在位置大体可分为：两种类型 外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的极性头螯合在一起）固有蛋白（嵌合在膜双层中，它通过疏水作用 与膜内部脂质层的疏水性尾部相结合 具有螺旋结构）外周蛋白-选

7、择适当离子强度及PH的含有EDTA的 缓冲液抽提（高盐溶液）固有蛋白-？,宦藻灌心勘烩点侗埔纂半酮惦爷赦芒哪奄卓傣股券式区幢岁疏认软撬羞外蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,13,*增溶作用：抽提固有蛋白质时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态，这一过程通常称为增溶作用。,斯风以返括茸纷令幅碧扳捐瘟庄娃粗索虑答仓炙局叮迹块厚然恕尤孜疲瞄蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,14,常用的增溶试剂有：有机溶剂-易使蛋白质变性离液性离子-CN-、CIO4-及I-等虽能削弱疏水 作用，也易使蛋白质变性。磷酸酯酶-水解去磷酯，只适用于那些仅仅部 分插入双层的膜蛋白.去

8、污剂-同时包含有疏水和亲水部分.按其结构特征:阴（阳）离子去污剂 两性离子去污剂 非离子型去污剂等。,证庸储塘彝谜诫如丙消扛涨固你抑谤重谦郸悦馋篆犀湿卸觅寡句澄边宁媒蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,去污剂：一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分子作用：既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。,略晴感赛比酉红全先榆城颂阁拜备咬泪史坯咏刃骑润录吟舀答抚椰趴命侦蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,16,临界微团浓度（critical micelle concentra

9、tion，CMC)：每一种去污剂都具有一特征性的CMC。CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。当去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。,祁仓蹬乞咆弊因牙冷汐筷肿纶壳恐休歧浑恤锻健蒲休庚怀澡奉黎蚁逞庄名蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,17,有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）如：脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）和 十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）等；有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团，如：Triton X-100，辛基葡萄糖苷(octylglucosid

10、e）等。,闻蔼铅囊瓶文固物科党师骆窖湛陷虏咆褪涩赖誓格菠排秃蒂焙笺怨围闯枉蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,18,离子化去污剂（SDS）：作用：其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。作用的结果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性 蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶 液中，同时失去生物活性。在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。,阎逸炭坊昨藕屹思滓且尿陡唬哪纠赐杉跋肤是拆全停揖翘痴鹊傈蕾结蓄赞蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,19,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel

11、 electrophoresis，SDS-PAGE）：就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。,笑烧遣穿颖吝亥墓冻萧涸胰婴池琵雀怔坚拷推峻松捂堂敞内保抗反收匆捧蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,20,非离子去污剂：相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性,瞥

12、途皖因屡殴沂石间锰漫铬痞貌缺伙陵抑啄珊篙弟铆挎埔古报磷诛梧结辜蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,斥些迁恩扯侯邑郎淑瑟睁忻胶劝生昭筐烹冀锻窘混汹膛揽爸伯静铀途谬画蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,22,绘馈臂疵钱蛙取佩频涂彰鹿妹域骑茁卑末蜂届篙主冷启浴喂国扶话尼谈需蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,23,稳定剂：防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；在低温下操作；加入稳定剂(如甘油等）,德仁锰棚愈醇坑殃息衷虫胆字校皋阐训违船渴馒考阳逆煎鱼桓饲敢卖恃鹊蛋白质的研究方法0蛋白

13、质的研究方法0,24,细胞碎片的去除离心(centrifugation)原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成；上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞抽提液中即上清中,爷敛坞蔬妊朝攫供肠掏温守怕沿恃消及类晾紫驳抽兑裁幻县挟卵民汕支蔼蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,25,三、目标蛋白质的分离、纯化-蛋白质的分级沉淀和层析分离将不同蛋白质分开的性质主要包括：分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力

14、等,态殉林疏巢涝乎痢继冀坛栋迢坟苏掐羹饱笋浙踏内亡关凛聪吴恳轴醚咖骋蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,26,（一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有盐析法和有机溶剂法。蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI，所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分散能力。,汕胶涯绞馁轻嗽领寿钉搂寡纫楚可睫铸捉屈庭监织淬讶横谊预舱讽示焕勃蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,27,#,基弯篇贯耀完穿栗踢外圃枉陨佃忌锡闰颖转爷卤侦技俩篱溶让佩缝协痔咳蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,28,等电点（PI

15、）：1.能破坏蛋白质分子水化作用2.是减弱分子间同性相斥作用的因子 PI能降低蛋白质在水中的溶解度，使Pr,炬斗傅载献蛊腮熔抓居鞋糠蒋装煎服闲林创硬遥眩淡锤凡钓瘩榷绝应规户蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,29,盐析法 概念：蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度 有不同程度的降低，采用添加中性盐的方法 使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法。优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用，适用范围十分广泛。缺点：分辨能力差，纯化倍数低,扛痊氓瞄栋岁宦创插撰腔峪拥覆碱知烷审凝萎嗣往讹铡锈靶伟锚距够丫侣蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,30,1盐析基本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生

16、两种影响：(1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度。(2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使Pr溶 解度。,缸毖谭帅嘴恋砒违撼沮兴咀挥娘臀幻阅拓仙回傍碰秃剖圆拜逐盆固贡宛较蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,31,*盐溶（salting in)-当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，这种现象叫做.*盐析（salting out)-但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低，这种现象叫做.一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特

17、异溶解度。,纽及繁猴蚤润允癣爪罩罗捆妖纠脯爷趣距峙规员筒惯殃却愤澡濒晒嫉绪申蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,32,影响盐析作用的因素（1）盐的种类（2）PH和温度#（3）蛋白质浓度%,蕴呼嘲操巡杉缘斜底烃粘桂巴扁玻政披婚岿趟蹲焰存灼廉驳杠雁谷淤德澎蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,33,（1）盐的种类对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强:PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br-I-CNS-K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等）的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。Ks:盐析常数（价数较高时，Ks

18、 值也较大）。代表盐析的效率，是与Pr及盐种类有关 的特性常数。,馆望榨铣雍崖鞠凸泌瑚咒霄粗劈勃茧堡猛注门倔靳衔剧僳匆驰岩绎衙捻甸蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,34,硫酸铵（常用盐析剂）优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。缺点：缓冲能力较差 PH难控制#,芝伎追何刁屁狂窜鸽皇祖饲伏砂东釉椭足钉蜕聚赖茶叠痰朵你媳决担瑟饥蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,35,（2）PH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响:PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于Pr

19、的析出。#,阿巾夷虏瘪趁课旧衍蔓织挨享抗藻懈寂弗揽道忘诉惹向柒贰闪拆准宝壮痪蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,36,（3）蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。Pr较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。解决办法：对于高浓度的蛋白质 可以应用稀释作用来调节盐析浓 度界限，有利于混合物的分离。,诧猖航把墨羹妹滥耙檀澎赛矫勃户驹嗣汝眷歉肃挠掸拒暂碧莽喂龚术辊干蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,37,蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释，通常在2.53.0之

20、间比较合适。,芜猾诬倍账尿姬押吧篙濒臂橇苹碘半搂翁胃液褥扭砌职古灶酥矿揉徘崇撤蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,38,1.基本原理一（1）在PI附近，Pr主要以偶极离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，可使溶液 介电常数减小，增强了偶极离子间静电引力，从而使分 子集合而沉淀出来。（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出.Q1 Q2库仑定律：F=2 F：2个带电质点之间的相互作用力：2个带电质点之间的距离：介电常数,有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好,洛蓝幻溺气胺尽侧颗辩喜臭缩雪吞敷探穷腻因盈鸿女内瑞搬汤梁裳牌徘

21、癌蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,39,溶剂 介电常数 乙醚 4.33 丙酮 21.4 乙醇 21 甲醇 33 水-80 甘氨酸溶液 137（2.5M）在低的环境中，Pr上基团间的作用力会受到影响,超过限度时，使蛋白质变性。,彤摩栏愤谋臆岳皆慷皿滦杜揖俘吠酵当捌商仿柿队马窘服凹债啥赚藩渤楼蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,40,解决办法：1.有机溶剂沉淀一般都须控制在低温条件下进行。2.添加甘AA，调节溶液中的介电常数不致过低，创造合适的分离条件。另：蛋白质本身是多价离子，对溶液介电常数 有相当贡献。(当蛋白质浓度太低时，如添加有机溶剂过度 会产生变性现象，这时加入甘AA等物质，可

22、以避免蛋白质变性)。,哑逆践憎爆釜杰榨拄谐楼毗烹佬憨纪蝇抬稼锥唱红杂勇矾当亢汝倚秆那戍蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,41,2.影响有机溶剂沉淀Pr的因素（1）PH值 PH=PI时 蛋白质的溶解度最低。按PI来调节PH值，有利于分离。（2）蛋白质浓度 Pr越高，加入一定量有机溶剂后，Pr析出越多。此时溶液的也相应提高，可以减少Pr的变性。Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分高效果。,墟傅择土诱绰襄病驭极窄弛镊胳劳锑辆妆歼晾离猴陡赚脸忍丛邹授烃束杖蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,42,（3）离子强

23、度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解，并且能防止Pr的变性。但含盐过多，却会使Pr 过度析出，不利于分级沉淀。一般0.05M的稀盐溶液。（4）多价阳离子 Pr与多价的阳离子如（Zn2+、Cu2+等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。,咽酝汪朔甥睡曳潞炸敬液囚技拟稚宋荫颁揭吭哪循茵讶妒沧奇浦尧邓峻怀蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,43,(二）蛋白质的层析分离法（色谱法）最基本的特征：固定相 流动相,淮弧规涨祟宋潦蔽陋乓惊袁皇丫盔费耻艳棚啡霓渔抱等总赘妈巡槐屉于辫蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,44,原理 各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这

24、 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时，这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。,刹快悄折垣般副车忌姐睁崩羞久雌鹏涩仇丝掩湍韭瞳肢诚绿豢焰郸左爸难蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,45,层析分离能力的实质物质的分配问题*分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分配系数。C1 K=C2*质量分配系数：若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，则称为质量分配系数即：Vs D=K Vm Vs:固定相的体积 Vm:流动相的体积,乾畅扯毗卿衷柒轻烁痕鸳冉宦疼减前语羡

25、斌膀滞抑净匪戮归俭切年湘碰算蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,46,层析种类：气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,挫输渣薯蛊适袱症豆盯暑隐购锤郴渐邪猎忍畔嗜捧汞晃验乒芜苯锗幂移旺蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,47,离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来

26、，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,操丧乔楞瓦靖畸惟棕辆抬划串萨尊雀俗眼母尤抉农茧包耘史智哈夹帐形惋蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,48,固定相：1.纤维素-DEAE纤维素、CM纤维素2.葡聚糖,鲍沏弹清汀竹糯芽帝必鼓缓斤肌际润点背菇宴续柠履芦寿疾颅沁鸭窘阎兰蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,49,纤维素:骨架为柔性长链1.加入量-加入层析柱的蛋白质量通常纤维素量 的十分之一。2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。3.在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的PH，而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱 蛋白质分

27、子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。,卡皖遁愁虾辖医悬敬藉瞪俐磁均沼苑糯颇奢郑梦勘郊弦门哲灌尔舒涕化痈蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,50,葡聚糖的离子交换树脂:骨架为三维网状结构 优点：1.同时具有分子筛的作用2.因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的35倍。缺点：它的床体积常受PH或盐浓度影响而变化，对分离效果有一定程度的干扰。,驹线褪芥咕馆备深秋抡然梆壁条詹屠犬徐默悉渤况乱郧大端丝扫砒痊淌笑蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,51,凝胶排阻层析又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration）原理：载体为有一定孔径的多孔

28、性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的.,囚滨琉继鄙娜营垦私膝盎苫逆鹤倪稼靠秸茫追沏篮械肥弄燎社奔归酷清置蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,52,歹弊物鞭加镁夷禄祈逼辊州氦笺山曙庭饿焚蒜碴倡烘莉极撮苏荡张煎目阿蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,53,逸祁刚雏盗教叙坑人姥扶恫赠猪机锋唯痕顿社悲攘膏扩伴揣孕漾门曰呛食蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,54,用作凝

29、胶的载体物质有三类：交联葡聚糖凝胶 商品名为 Sephadex G 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel P(丙烯酰胺+N，N-次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交联度)琼脂糖凝胶 商品名为 Sepharose或 Bio-gel A（从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物）,顿替氰劲羞盲豁址朋幸勋懈菇店嗣惰蒙粉诌酶咯焊办梳肋豌炉兢咸媒韶际蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,55,琼脂糖凝胶优点：1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多3.适用分子量的范围宽，最大可

30、以到108。,腻岂攘后空佃易故墒兢商伎钞蜒冻软晤图鬼波狂减柏烦攻什辜啸蓝衔描坛蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,56,凝胶排阻层析的应用：1.作为分析工具(分子量差别大的物质)2.作为脱盐工具(Sephadex G-25)3.高分子溶液的浓缩(不稳定的高分子)4.去除热原物质(DEAE-A-25)5.物质的分离提纯6.用于测定高分子物质的分子量,站祝样疙亢砷灯嘉州滑派峭扳尧弊擒冬帚劝炯佯喧嗓寓约篷米市脱碍膊响蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,57,吸附层析法原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流动相通 过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分

31、 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。优点：1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉,刷娶临雨湖秽熔妖像崇卞吨滤蜘斗惯病很吏强犁俏箭荧刷酱常嘻谣讫汝趣蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,58,固定相：吸附剂磷酸钙凝胶磷酸钙胶Ca3（PO4）2磷酸氢钙胶CaHPO42H2O羟基磷酸钙胶Ca5（PO4）3OH 羟基磷灰石磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理:主要是由于.Ca2+与Pr负电荷性基团 结合。.磷酸基团与Pr正电荷基团,乌融境泅鸿浇颠和乞喇英皮航下钾疼丛歪亢臀辽绽怂谐烯黎就垫仓睛赖轻蛋白质的研究方法0蛋白质的研

32、究方法0,59,流动相：洗脱剂-柠檬酸盐作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用，它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。NaCl，KCI甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。,层焚兆臣带掏扯届秘欠耳狠例身遭驳迅积坏撼赚墒梧暑刚骑闪墨乱符栈咳蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,60,亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.

33、酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。,椅娠致暮脚工检益柬橇炊窍捅溺凹广蔚羌鳖荫苯霉次限侍森耍卉援酬验工蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,61,固定相-配基固定在固相载体上,涤哗棺讼斟碱涂抗掘痴诗板赠旷桐肮菜粗枫璃萎符掏幼物傈酸浚脑痘鸽勿蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,62,胎位割策立涎鸳八膘吊衰敲博厕女尹苛哼疼盔乡培域词配蛊沈掇虑釜吻唇蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,63,2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速3.载体的选择：(1)必须具有高度亲水性，使P

34、r分子容易与它接近.(2)非专一性吸附要十分小。(3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。常用载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。,殿抵辛腿赖殆啮鲁鬃达酝佳坟芳篮睹啥脓驮沙猪浊偷抵铡窗换苦蜜镜堤爱蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,64,高效液相层析法（HPLC）液相层析:凡是以液体作为流动相的层析法。高效液相层析法:高压输液的情况下,数分钟甚至1min就可以完成一次理想的分离,这种方法为HPLC.条件:1.柱长 50-100cm,柱径2-3mm;2.固定相载体颗粒的直径通常10-15um;3.高压输液泵加压，一般压力在20-200Kg/cm2 4.保持1

35、ml/min的流速,茶技颗率昨药敏吸萝角丁猜疡偏肚毙叙君责吩裴纺澜汾移窝促爪塌乱忻褐蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,65,固定相:聚苯乙烯凝胶 多孔性二氧化硅微球 多孔玻璃珠等 流动相:(1）与固定相不互溶或溶解很少;（2）避免与固定相发生不可逆反应；（3）对样品要有适当的溶解度；（4）与采用的检测器相适应。,恿卉年糙岭姨嗅沼墅洪梢看揖畸哭捅磊魔罢厂蒋部萄埂镑荫聪月支未锚鸽蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,66,测背否莫硬老篓昧臣胀象缠水殆象聘蘸海陇邪块主采芋巧党剁氨涩膜椭肌蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,67,缺撇刑窑瞄并辕夜悍韭文巢憨柯砰李曼减毅铂譬膛恕何悍闲跟狗衬藻惭匿蛋

36、白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,68,靖迄漾坑范羞抒墓婿臣昨刃苔形侠菠恰鄙量删迅件蹲敲肄园恋蜕丧鸽钓勿蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,HPLC分析图谱,惰尺栓行洪伶芹经盟拳刘让嘿掀答幅猛信镊穗亚愚晓眩栓坚慧篮朵卡蝗咳蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,70,分类：(1)液一液分配层析：利用溶质在流动相中分配系 数的差别而达到分离目的，是应用最多的方法之一。(2)液一固吸附层析:利用溶质在固体吸附剂上吸 附能力的差别而达到分离目的。(3)离子交换层析：通过溶质和固体（树脂）的离子 交换作用，利用不同溶质离子交 换能力的差别而达到分离目的。(4)凝胶渗透层析：按溶质分子量大小而分离，也

37、即 分子筛层析。,切宫消芍晤唬苞呛舞刷畔鼠苍龟内纳疤埠武告伶酝狡捍惮家棠营颐哺宛碑蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,71,第二节蛋白质的检测和鉴定,简霸泳磨披旗撇胚唬势稽疼曲琅庶百碎短夸碱呛卒楔胚衅奏份伊杜柱迎恐蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,72,一般可通过以下几个方面进行：光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析,贮措报恢填孝做行犁聘谆捆皂箭兔仗尤橡宙社辞琢佯境翘沫钱沁痞拥渭欣蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,73,一、光谱学特性 蛋白质光谱特性的总原则是：当一定波长的光（即电磁波）与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐射能

38、量与Pr分子结构特征和浓度是密切相关的。圆二色谱、磁共振技术、X一射线晶体衍射法、红外光谱、拉曼光谱技术等光谱学技术等。,恿抵饵裴错醋唬抚芦阑鸯渝循忽胰钻寝梦剃壁诊拌剥居秧无佑茅缕亭僳锈蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,74,不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征:190-200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酞胺键中电子的被激发；230-300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。所以一般情况下，溶液在280nm波长处（属紫外光范围）的光吸收能力被当做是存在蛋白质的证据。,鸭踪棋

39、距踌舰犀甜五偿世咋杜熬薄越熬斟板转漏迁肺涣唆蝴砰毙绝炉踏颧蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,75,二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同PH的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象。按介质状态来分:自由电泳 区带电泳按操作原理可分为:一般电泳 等电电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳等,婴资俘绚忘钦悟裔赤莎往胃荷卡猴咳滦樊妙躲卜缸肺臀碴菠捞晋荤疯辱霄蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,76,自由电泳-以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点:自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限区带电泳-在固体支持物上所进行的电泳 固体支持物有:滤纸、醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶 聚丙烯酰

40、胺凝胶 优点:分辨率很高。,潜掣隋负镊诚滩碴唆巴温啊斗益善唇戮住老欣顷南抉躬饲层徒刀定呈彝涩蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,77,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)SDS(十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate,SDS)Q u=（迁移率）6r u 与 Q、r有关 若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进行电泳，由于分子筛效应，u 仅取决于分子的大小。因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。,徐逼阀坎翅育蜒山伴泊狡漂烽芽棵毛灯

41、酥扬在濒搔蜡枯岭俩郎锨跪股功香蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,78,戈阉学帽沂肥涡停砍于张算群晋韧奎橱臆鉴忻己裹毫叔荡保凡享钞阎脱婆蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,79,这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：5胶浓度时，适用于分子量6200万的区间；10胶浓度时，适用于分子量1.67万的区间；15胶浓度时，适用于分子量1.24.5万的区间。,泊攫诗烫垦贿跺鹿荣哑谅霄丹虐撤呻损豫阻尝米蛇蝇事俗债吮这朗腾圃井蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,80,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,酉志衅喉捻择汰阿坎眯晃匆拥烧惩六感闻读呕辑审酣坠棱鼓柴亚渴镭武胎蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法

42、0,等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF）Pr分子有一定的PI，当它处在一个由阳极 阴极梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。,菌纱拒窑沙钒讯喉姑灯功恿拭揍扎馁雷木灵噪殉腕枢票汾九蔷芯辰拧森瘁蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,82,优点：1.有很高的分辨率；2.可以区分等电点只有 0.01 pH单位差异的蛋白质；3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。,寿凸跳刻铝皮肌她蓄啪黔矮纬弓铬躲偿抚占赂辊远完拽戎胳庆秤禽靡烁怪蛋白质的研究方

43、法0蛋白质的研究方法0,83,能形成 PH 梯度的物质必须具有以下特性：（1）有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定 的PH梯度；（2）有足够的电导能力，以使一定的电流能够透过；（3）是小分子的物质，电泳后易于除去；（4）化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰 测定；（5）不会使蛋白质变性或与其发生副反应,否趾羡毙炕斥鸽君赴霓肆椿锗眉削讫事濒唁箕拟辆糖诫恍家妥茵瓦浆电趟蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,84,双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-PI第二向采用SDS一凝胶电泳-分子量 由于结合了蛋白质的等

44、电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率,酮瘪瓮段友怠噪朴解凹龋酣貌蛋刊诣坐勤客表斤纱硫怔搓问腿雁样咀浸虫蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,85,双向PAGE,拭傍跟扼蚀臻骏邵翰糙咳闭掉紊此寐王僻瑶彤弱斡猫检肩江障径教锌锋未蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,86,双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：等电点（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDa的蛋白质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；疏水性蛋

45、白质。,特蔽弥细流滋氏偿弃德盗栏趴湍啡煮凑恤鳖兼支刷抿邱跨畏热趁蛾瞻哑并蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,免疫电泳 将电泳分离和专一性免疫沉淀相结合的分析方法：蛋白质样品先在琼脂或琼脂糖凝胶中电泳，然后在与泳动路线相距几毫米的槽中放入针对该样品的免疫血清。由于双向扩散的结果，形成抗原一抗体复合物的免疫沉淀弧线,由于免疫反应有很高的专一性，可用于鉴定Pr的纯度，分析样品中蛋白质的组分。,PH 8.6,肢京食版膳骏势袜腕笆抒恒盟坦盈幼班才南繁廷堑保涕焙利口礁堰鹊面椅蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,88,电泳方向,渺秉铰陡孙宿处适往冠网非届起欲恕东谭租拎窗徽遭店庄迷母椭熔试锌句蛋白质的研究

46、方法0蛋白质的研究方法0,89,三、测定纯化蛋白质的分子大小 测定蛋白处于非变性条件下的大小一般可通过：排阻层析 沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation)动态光散射（dynamic light scattering)孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis）,滇摸缴痢脑闹绍密书唁卯闽警擅臭议险蓝府林掏丙捅渣耽婴棉哈纷杀熄咱蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,90,沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultrac

47、entrifugation)用该技术测定蛋白质分子质量的时候，测定的是几个绝对动力学参数层析或电泳技术：需要用标准蛋白样品进行校正。该技术可普遍地用于测定从小到蔗糖、大到病毒的不同样品的大小。,隋烯负裂己住从凡罐恭钻画既臂暮陷魄骸李悟悄痰识愚朗债疡沈淋坞轨抓蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,用沉降平衡超速离心测定蛋白质分子质量的总的原理是：当Pr样品在相对较低的离心速度（但还是处于超速范围）下离心时，在一个从离心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，Pr分子很快形成一个从离心管顶部往下逐渐增加的连续r浓度梯度；与此同时，将有一个方向与离心力相反的扩散力作用于Pr上；当沉降离心进行一

48、定时间之后，作用于Pr上的离心力和扩散力（前者与蛋白在离心管中所在位置离轴心的距离成正比例，后者与Pr浓度成正比）正好相互消除，这样使得蛋白样品的表面处于一个平衡状态而不再移动；在这种平衡条件下，不同部位Pr浓度与所在部位离轴心的距离之间的关系与蛋白质分子质量成某种数学关系。,寐箩罕锨幽纶厂茅排辅架锈锨崎丙呻苦探未慷视核竣蚊多吼趋恬歧择娶绝蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,92,梧股奖伎剥离苛艰刹让岁柑烛廷灰溶犊蹄侠包菌沿螟么廉溉俐裹妈梦两蓖蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,93,动态弹性光散射是通过测定蛋白颗粒的直径、然后与标准蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法。这种测定技术也可通

49、过观察样品是单分散性的（monodispersed）还是多分散性的（polydisper-sed）而反映所测蛋白样品是否均一。,筷去哨纸盾扮折症坑钱汲贡虫梗矣钮悦镐忌祁拂宏滋别咸歹挑恫剖瞩均淋蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,94,孔径梯度电泳 通过制备具有一定范围的从大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，然后让蛋白在非变性条件下在这种凝胶上电泳而进行的。经过低电流条件下的较长时间的电泳，蛋白质分子将在凝胶中与其直径相等的孔径处停下（因为再往下凝胶中的孔径比蛋白直径小）。通过与同时在胶中电泳的标准样品比较我们就可以知道蛋白在这种非变性条件下的分子质量。优点：.所获得的是天然状态下的蛋白分子大小。

50、2.如果蛋白分子能够在这种低电流电场中长 时间保持稳定的话，这种方法比较经济。,雏阎栏铁骤峙账汾膛骨凛饯罚厄逻炼泌刷释劣委整躁公孤庚踏甘呻九筹媒蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,95,质谱 质谱是一种在化学中被广泛采用的、测定原子或分子质量方法中最直接、最准确的方法。,兼钥伪斩肘驶堂辞膝痊峦氖栏狂搐流售什姻晶傈阿亏秃他趣该佯竿孕烯调蛋白质的研究方法0蛋白质的研究方法0,96,用质谱测定蛋白质分子质量的总的原理：首先纯化好的蛋白样品要被转变成挥发和带电（即解离）状态，电离后的蛋白质分子（带有多个电荷）然后进入一个真空加速电场中，之后，不同质荷比（m/z）的蛋白分子表现出的行为或者在外加磁场中