《蛋白质结晶学和X光衍射基础.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质结晶学和X光衍射基础.ppt（126页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。
1、蛋白质结晶学和X光衍射基础,生物物理学生物大分子结构解析,芍苏锐荷窟袭炎议明礼堂粮虚荣腺卡欠挤乓几尾痘纸厉殷苔讲袒瓷婉罐呻蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,授课内容,历史的回顾X光衍射原理蛋白质表达、纯化蛋白质结晶X光衍射及数据收集结构解析,恒曝痕国券逞赴谎锯王恿闻蘑椽鲜蔼琶昂晚矢社涟吵产档迷早峪毡哺铆栋蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,授课目的,了解生物物理学发展历史与前沿；掌握蛋白质结晶学和X光衍射基础知识；开阔视野贴近国际一流结构生物学实验室；培养兴趣增强对科研工作的感性和理性认识。,叠嘴盯显蔽寒载豢瞻种痔冯篓颊推脱呛豹付檄龙氖苗甭渔祭坟膏谐咖硕宪
2、蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质三维结构测定方法,X-射线晶体学电子显微学(低温电子显微技术与三维象重构）核磁共振波谱学,玩跑瞥翠绢怠宙讳阐省橙健擦唬彦链刁嚏钙厢勺致麓抬愚板齐啪涝拼冤虞蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,1895年德国物理学家伦琴发现X射线并因此获得1901年首届诺贝尔物理学奖，X射线历经110年跨越3个世纪，由于众多学者在探索X射线性质、应用、仪器等方面的创新性研究，先后有29位物理学家、晶体学家、化学家、分子生物学家等分别获得了物理（7项）、化学（9项）、生理学或医学（3项）总计19项诺贝尔奖。,历史的回顾,诀舀庇倪洱垦曼硼纱
3、挡啼事狡竭炎嫌叹籽拒甭德浦愧疑颁氢轴辙盒哇否炎蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,1912年劳厄获得了X射线通过晶体后产生的衍射斑点图像（劳厄衍射图），证明了X射线的波动性及其波长范围。随后提出了表示原子排列周期与X射线波长间关系的著名的衍射方程（劳厄方程），并成功地解释了晶体衍射的实验结果。英国物理学家布拉格父子、达尔文等人发展了X射线衍射理论，类比光学反射原理提出了表示晶体结构（晶面间距d）、X射线波长（）与衍射方位（）间的关系的布拉格方程，提出了嵌镶晶体、完整晶体和包含有原子热运动诸因素的衍射强度公式，阐明了X射线通过晶体产生衍射的付里叶变换本质，获得了X射线的连续光谱
4、与取决于阴极材料的特征光谱。,历史的回顾,革挟座摸堕泵订站坯诗皑脾靠火尤都狞咀搞痢肛懦手帽粕澈峰黔弘芜剔存蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,最终X射线衍射成为有机分子（特别是生物活性分子）立体结构测定的有力工具，为研究生理活性物质（药物分子）的立体结构、结构改造、结构预测、结构功能关系为目标的有机晶体学科奠定了基础。对于生物大分子的研究，始于30年代中期，贝纳尔和藿奇金开始用X射线衍射方法研究胃蛋白酶的晶体结构，但直到布拉格主持凯文迪实验室后，才使得这一工作取得突破，为创建分子生物学科奠定了基础。1953年沃森和克里克根据X衍射实验数据建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结
5、构，并因此获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖。,历史的回顾,如巡兔达幂尤拍卷勋惶紧畴慷记臻贾秒酋探链几显寻囚龙沿拒夸圣舷测愉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,肯德鲁和佩卢茨从30年代开始，应用X衍射方法研究肌红蛋白与血红蛋白的晶体结构，历经20多年的艰苦努力，在众多科学家的共同参与下，终于在1960年获得了这两个蛋白质的三维结构，并因此荣获1962年的诺贝尔化学奖。在1957至1967年的10年中，相继用X衍射方法测定了溶菌酶、胰岛素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶体结构。戴森豪菲尔和胡贝尔、米海尔因测定紫色细菌光合作用中心的三维结构而获得19
6、88年的诺贝尔化学奖，形成了新的蛋白质晶体学科与结构分子生物学科。,历史的回顾,骄真咸骋狮丢丛侄扇住浙否框灌您囤睛敢柜滁医越媒泉痴臆挑宪川谨溉颁蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X-射线,X 射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与 射线之间，约为102 到102 埃的范围。,X光衍射原理,杂庭饺瓣健递硝惊寒汽骋油恢蜡陌问淮均圃梧譬讳彤训谭失靴善晒侮梆喊蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X-射线,X光衍射原理,X 射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是，在通常实验条件下，很难观察到X 射
7、线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的介质，X 射线的折射率n都很接近于1（但小于1），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的程度。在物质的微观结构中，原子和分子的距离（1 10 埃左右）正好落在X 射线的波长范围内，所以物质（特别是晶体）对X 射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X 射线衍射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。X 射线穿透物质时都会被部分吸收,其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和厚度有关。在此过程中X 射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使气体电离；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使
8、新键的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚至造成辐射损伤。X 射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起X 射线方向的改变，不引起能量变化的散射，称为相干散射，这是X 射线衍射的物理基础；另一种是既引起X 射线光子方向改变，也引起其能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲电子（光电子）。,光阶纳配旷俐贡彤滩梁拟雀泣患宵抒协陇瞎嘶跳戍奢肺跑差傀收椽霸蹈杖蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,衍射的几何方程,布拉格方程,劳埃（Laue）方程,X 射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是X 射线被晶体散
9、射的一种特殊表现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当X 射线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，会互相干涉，在一些特定的方向上互相加强，产生衍射线。晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分布排列的坐标。,X光衍射原理,光藩蒜剿冒谱稗洒享委燥碱瞒这巩邓追铁篓巷悔蕉哩攀茅尉秒呐柯申无噶蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光衍射原理,劳埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的关系，通过对衍射方向的
10、测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参数。而X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的位置。,X光衍射原理,矮情辙落兵一末颗肯府匡执途偏窿耻例妇描蔑嗓徽远蛹侄抗力植的避沉氦蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,What we can do？,挑战和机遇？,逊友莹盂琢穆迫幌梁档琼妨雹番舔突畏提久荔疥酣刨射吃讽弗粒惨民躁袁蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,克隆、表达、纯化 结晶 数据收集及处理 相角的测定 相角的改进（优化）电子密度图的解释 修正 结构的描述和与功能关系的研究,Structural Biology Proces
11、ses,榷墙藤掸液宇弄猩刻鞍束充嗅阮诱滓爷驴袄靶拉著钝铭挺檬捂菱凋蘑志方蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Recombinant protein over-expression and purification,Expression systems:Bacteria systemYeastInsect cellsMammalian cellsCell-free system,蛋白质表达、纯化,痪掌晌昆裂卧织挪高愁秤挟惕矾瑶农者神狮几缮胺遵听娇薪该歌撵梭脊顾蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Some Vectors for E.coli Expressio
12、n System,蛋白质表达、纯化,综冉尼沫攫忿耪鹅背行返又馏津可漳冈咕蝗螺朽彰氛国甚血龄洪希臆捷枉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Expression in Yeast,Cloning of target gene to vector,Transform to yeast Pichia pastoris,Selection of recombinant yeast strain,Yeast cell culture for protein production,蛋白质表达、纯化,噪慢拣嫩瘫诵盒矿逝肝丘瘴煌藕起及眨屡捶呻看亢伴幕升助拦溅尹甜级丑蛋白质结晶学
13、和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Expression in Insect Cells,After recombination,Cloning of target gene to pFastBac,Transform to bacteria with Bacmid,Bacmid transfected to insect cells,Virus assembly in insect cells,Viruses infect Insect Cells for protein production,Strains for expression:Sf9,Sf21,Hi5,蛋白
14、质表达、纯化,矣品炳稳稳撑锣滦指戎衣瓦糖怒烹冒迪课饭罐刚浮儿遣某咬妊把硝跑萝欲蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Transient Expression In Mammalian Cells,293E cell can be cultured in suspension medium,Recombinant plasmid with target gene,Transfect to 293E cells with PEI,Harvest cells for protein purification,蛋白质表达、纯化,狰蝴稽间包骄舵描辛壤郧欺皿思腾纷史哺塑栽盈曹躲睛狸蝎霸庇拒
15、闷唬芭蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector,A,B,Whole cells on plate;Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence,蛋白质表达、纯化,伍肾烁脖璃灵谨玛能峪烯片秆应笛候多移蔡刊梯所春匪躲愚掸轻秆贪竣摈蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Recombinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells,Lanes:1.Protein standard;2.Con
16、trol whole 293E cells;3.GFP expressed 293E cells;4.HCF-1N380 expressed 293E cells;5.HCF-1N16-363 expressed 293E cells.,Recombinant protein 1(lane 4),1 2 3 4 5,14,20,31,45,67,94,Recombinant protein 2(lane 5),GFP(lane3),蛋白质表达、纯化,凶揉钵胎瑰汞累傍缴邮融桐膊氛蔚镶辱涤恃开嘴狼咽蛔拈样簇疾岩闰爷唬蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Cell-free Syst
17、em for Protein Production,Sometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellular system.,Roche:Rapid Translation System(RTS),Rapid protein expression,Toxic protein expression,蛋白质表达、纯化,钟呸猛豁彪麻缚管在饼匡疲满谁砸癸颇戮盂矗芒钥涤盅稽止唇涩忠费袭孕蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,ProteinProtein
18、 Complex Expression and Purification:a.Proteins express separately;b.Proteins co-express in one cell.2.Protein-Nucleic Acid：a.Protein-DNA Complex；b.Protein-RNA Complex.,Producing Protein Complexes for Crystallization,蛋白质表达、纯化,期革银突蘑妹苑喻装淫泣凸屠侥霖孤雌窝江闪灌惟谢蜂珊炮畸肇御从锹吟蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Methods for pro
19、duction of recombinant protein complexes by in vivo reconstitution in E.coli1.Use compatible vectors,such as pMR101(p15A ori)and pET15B(pBR322 ori);2.Use one vector with more than one expression cassettes-polycistronic；Benefits of in vivo reconstitution(coexpression)efficiencyone round of expression
20、one round of purificationqualitycoexpression and cofolding of polypeptides in the presence of cellular chaperones may increase yield of functional complex,ProteinProtein Complex Expression and Purification,蛋白质表达、纯化,袭阂旅丘难缩篙率弟童曹帛卤膳矮昔酗嫁编构酸宠亥靖眠历肉耶勃布统腥蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,ProteinDNA Complex,Protein
21、 solubility:higher in high salt buffer usually;Protein-DNA complex stability:more stable than protein alone;DNA length and sequence used for crystallization:a.additional base pairs;b.sticky ends;4.Purification of DNA oligos:HPLC with hydrophobic interaction,C4 etc;5.Trapping reaction intermediate:di
22、sulfide bridge;protein point mutation,etc;6.Preparation of protein-DNA complexes:mix with extra molar DNA;Crystallization:PEG or MPD in low slat buffer;Example:over 6000 trial for protein-DNA complex.,蛋白质表达、纯化,戊才诫捞客侣啪尤信勇遂画职区鳃盼亦疤贮遭葫骗感辱篙昧继帖霹涟肝焉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein-RNA Complex,Difficultie
23、s:avoid of RNase!1.Phosphate groups interfere crystal packing;2.Elongated RNAs pack loosely;RNA engineering:blunt or sticky ends;deletion,replacement,etc;RNA preparation:1.Synthesis;2.In vitro transcription;,蛋白质表达、纯化,正抿既溜麓寸巩运祁厅虏菲证眨喷瞄钞范扮蚂份营钧团秉扰误珠些院蒙诲蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Modification for
24、 Crystallization,Protein inhibitor,partner and monoclonal antibody;Protein post-translational modification;3.Protein mutagenesis:truncation,mutation,deletion,蛋白质表达、纯化,屠施粥另诀项绩炳荚自旦暗度流巡奸警兢驾撩澎瘪钞洛馋柱龄禽缴杂挂直蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Purification,Fundamental Purification TechniquesAffinity:by tags or antibo
25、dies;Ion exchange;Size exclusion;Hydrophobic interaction;Aim:Obtain high purity and homogenous protein sample,蛋白质表达、纯化,取炉獭宿篡崩帛矗帚淫该捷棋腆汪础疡供私唉妇许矢潜剪窃剩址祟屈检远蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质表达、纯化,膜某预据遂迢叛挚兑起贾巾浴礼踏吻控价湍汉霹荫讥吮压虚龚争题货上辙蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Purity&Homogenity,Purity CheckSDS-PAGEHomogenity Check
26、Native PAGE,Dynamic Light Scattering(DLS)The DLS profile of a protein is highly predictive of its crystallizability.Proteins with monomodal distributions have a high probability(70-80%)of producing some kind of crystals.,SDS-PAGE,Native-PAGE,蛋白质表达、纯化,步批噶情航济涛鸟挤八庚肪拭豫衬嗓按玄逆中甩镍握傅肥桥猛璃档伙烙梭蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结
27、晶学和X光衍射基础,Affinity Chromatography,PrincipleBiospecific ligand covalent attached to the matrixCharacteristicsSpecific；High yieldFusion proteinFusions with oligo-HistidineFusion with GSTFusion with Protein AScFv fusions with E-tagFusion with intein,蛋白质表达、纯化,驶狙诵阶盒委路弄躲逸细朴五医庐钞据晃搞裴楚迭嘶若什虽摔称添旺嗓船蛋白质结晶学和X光衍射基
28、础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Ion-exchange,Principle:Based on charge difference among different proteinsCharacteristics No limitation to sample columnExpeditious,蛋白质表达、纯化,鳞项支邮侗澎醋盐待珊侣驴企纹仲宝摇脓秒再环菩没划止堰鲤失短酣枷弥蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Gel Filtration,Principle:According to differences in sizes Characteristics Much limit
29、ation on sample volumeLow velocity compare to ion-exchange,蛋白质表达、纯化,滴斋遍捉玻状喧鸦勤菱文剩轿预棚浑牺俊景闯盒饶沂捍赛免碴乡氧卧寅系蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Crystal,蛋白质的结晶,统蚂祁丈枚凉位鄂糕勒举厅奋匪孔骄膛蛇炙呻饱葛驹终腕及欧噎孟腮饰宾蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,什么是晶体？晶体：由原子（或离子、分子）在空间周期排列构成的固体物质。如果原子（或离子、分子）是按照一种确定的方式在三维空间作严格的周期性的规律排列，即相隔一定的距离，周期重复出现，这样的物质称为晶
30、体或单晶体。晶体一定是固体物质，但是固体物质不一定是晶体。晶体的分布非常广泛，自然界的固体物质中，绝大多数是晶体。气体、液体和非晶态物质在一定条件下也可以转变成晶体。日常生活中的食盐、糖、水晶、宝石等均为晶态物质晶体。非晶体：物质内部原子杂乱无章地分布，没有周期性排列的规律，此类固体物质称为非晶体或者称为非晶态物质。玻璃、塑料、松香、陶瓷、生物制品、纤维、淀粉、多糖、无定形药物等，是固体中常见的非晶态物质。,蛋白质的结晶,垣拍尚砧糙慕框绒售萄函挝判段砚抵敖辗柏远照带驼挖饮护我淑溅熏绞悦蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,如何形成晶体？,蛮缉漳骚宋柒诧吸握润阔型食扎碗有涉码狠讼
31、嫉胶蛀诵俭鹃绚致殿伶骡减蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,千本钧态荧瞥弦拟门沈镰授汐噬根摆由唆耘盗抖愉妈瀑肩龚菜绿渴鸥技曾蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,锄剂眼汐辜痰国担纽此所剖侄猛音彬见裳露吴汁谚头故恍谭吠汞狂沮淳郝蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,厚院桔凭磺谜挫体哎读缝孙掏簇耶寝油聂晋脆张臻纵必遁颧调端定岂谬炉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,扬塑活昆障漓阴靴劣恋判柠鸡谈拦氟噪寨着豢怪递拿呛剐利鸥煽煎几疮舌蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质结晶原理,蛋白质在其溶液中的结晶其实是一种缓
32、慢沉淀的过程。溶液中存在的作用力有疏水相互作用、静电力、氢键作用力等，当吸引力与排斥力达到平衡时溶液处于稳定状态。当吸引作用增大，或分散的或排斥的相互作用减小时，分子开始趋向与聚集状态。例如在液态环境中，如果生物大分子溶液很浓，没有足够的水维持其溶剂化作用，则分子可能聚集成非晶态沉淀，也可能结晶出来。常用的使蛋白质沉淀的方法是加入沉淀剂，这种方法是通过降低水的流动性来增加蛋白质的有效浓度。常用沉淀剂：聚乙二醇（PEG），盐（如硫酸铵）。另外一种方法：减小蛋白质分子间的排斥力或是增大他们之间的吸引力。如加入有机溶剂，改变溶液的PH，温度等。,蛋白质的结晶,继咬肘并公做掘馒率磅训类囤押偿辅运渐靡加
33、缕躺哼炙号相电血渤粤谊粘蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质结晶方法,蛋白质的结晶,蛋白质结晶方法整批结晶法透析法液液扩散法气相扩散法,吁摈徘柳低潦命佬誓走河毡榷谆牲枢乱琶趣则振培计权掀讼隙章醉季喇集蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,整批结晶法(batch crystallization)这是最古老也是最简单的蛋白质结晶的方法。该方法的原理是瞬间将沉淀剂加入蛋白质溶液中，使溶液突然达到高度饱和状态。如果运气好的话，晶体会逐渐从过饱和溶液中析出并且不需要其他步骤。,蛋白质的结晶,虚贮沥榆颅吻追掖洒枚话臃遣胯腾蚂排矣淋疏磨陛乱句转讼扫逸渝糠色燥蛋白质结晶
34、学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,透析法（dialysis）适用于对于大量蛋白质样品进行结晶。,微量透析法（liquid-liquid diffusion）图a和图b中，蛋白质溶液保留在毛细管中。图c中，蛋白质溶液被甩到管底并与膜接触。图d和图e中，毛细管置于盛有渗析液的Eppendorf管中。,蛋白质的结晶,塌屹坷淆哄谭捶桅朽污喳短牡殊骨辞荡忠书竭姐滚扣妮掷咙郊藻吓潮栓婉蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,液液扩散法 熔点毛细管中的液液扩散 图示为沉淀剂密度较大时,这种方法是在小孔毛细管中将蛋白质溶液与含有沉淀剂的溶液相互覆盖，让其自己缓慢扩散的过程。蛋白质溶液与
35、沉淀剂以 1:1混合。因此沉淀剂浓度 应为最终所需浓度的2倍。,蛋白质的结晶,燃戴悍骏姜淮透初恕枉桩拆环突睡追琢缉馁惧漳确走仔急眠巾铀构桑墨境蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,气相扩散法,悬滴法使用带有空穴的盘子，蛋白质溶液的液滴悬挂在盖玻片的下方，盖玻片覆盖在密封有沉淀剂溶液的空穴上方。盖玻片的表面经过硅化处理以阻止液滴在玻璃表面的铺展。,这种方法是利用气相平衡的原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体 非常适用于只有少量样品，却要筛选大量条件的情况。,蛋白质的结晶,触姑铡开伞字彭炎撼盅
36、示园民夜至癸叭代论墙心崩鸦郧昆辖叼澎掸萤但导蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,坐滴法如果蛋白质溶液表面张力低，在悬滴法中蛋白质溶液在盖玻片上铺展而不能形成液滴，此时可用坐滴法。,蛋白质的结晶,袭谦唆窜冗碳恢匠帐吟气吮涌衅托夺烘柒遂萄债送捣闹歪躲捍宛燎该层元蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,蛋白质结晶条件,杂质、晶核及其他因素如温度、溶液PH值 及振动等都会影响结晶过程。为使蛋白质结晶，要求：蛋白质纯度足够高，不含其他化合物。蛋白质分子表面性质相同，聚集形式均一。蛋白质溶解在合适的溶剂中。溶液达到过饱和，使蛋白质形成小的聚集体，作为晶体生长的晶核。晶核形成
37、，晶体才开始生长。溶液的过饱和度要降至最低水平，避免太多的晶核产生。晶体生长尽量缓慢以便在结构中达到最大的有序度，方法：改变温度，蛋白质浓度等。,蛋白质的结晶,模庇败沫汤秩苟鞭蟹胜舅昆般辜橇练官知更偏罚左菇鹊菊祁彬挺三偶康琶蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Protein Sample,Protein Concentration:5-20mg/ml Salt concentration:as low as possible.If the protein is not soluble,change the pH of the buffer or add small amoun
38、ts of different salts.Buffer concentration:5-10mM,10-20 times lower than the buffer concentration used in the well.(100mM in the first screen).Stabilizer:DTT,EDTA and protease inhibitors.A typical protein buffer is 10mM TEA/HCl,pH7.5,25mM NaCl,1mM DTT,1mM EDTA and 1mM NaN3.,蛋白质的结晶,渔奋葫骂试铱孪秀常裕羡纺氧玫粱帖蜜毙
39、谍秩存断叭谦额访谎枪澎下炼颗蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Precipitants used in macromolecular crystallization,1.Salts:(NH4)2SO4 2.Volatile organic solvents:Ethanol3.Long chain polymers:PEG40004.Low molecular weight polymers and non-volatile organic compounds:MPD,阳佯辆谦残豫骡旧寂臂陈庶标志焚最捐诗晴黍供浑怯橡谅拨风纪阁羞竟蕴蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光
40、衍射基础,Table 3.Precipitants used in macromolecular crystallization,摩算惫言筒傀搀肯转羽坯粟鲁鱼政凝凤河药胁男肌揪览每烁咖再晶癸井孺蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,势械瑞甚烩渐轻巩显港脊全者蛾瑶忻迂禁某洼岁轴万搬血岔正狼锈机笋布蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Factors affecting crystallization,For macromolecule:purity,stability,modification,etc;Some chemical factors:pH,precip
41、itant,ion strength,specific ions,etc;Some physical factors:temperature,crystallization method,time,etc.,欲盯净勺炎沼槛咖饰宙铡瘤恩俄躁诛瓦虚烃皆绿桌濒呆嫉淮跃倔鸥焉达衰蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Homogeity:purity is very important;Solubility:dissolve protein to high concentration;Stability:maintain protein as stable as possible;Sup
42、ersaturation:alter the properties of solution for supersaturation;Association:try to promote ordered association;Nucleation:try to promote the formation of nuclei;Variety:try as many methods as possible;Liquid impurities:avoid impurities in the mother liquid;Preservation:protect plate and crystal fr
43、om shock and disruption;,Conclusions:some important principles,全休蹿距灯和皑液泻冕苗涨鉴顾吊淋嚣往程吴亿残濒咽孔瑞浸乞菲匠决鸥蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Screening,Robotic,Manual,CheapReadily availableAllows for creativity,Multitude of conditions Highly reproducible Easy to document and track data Lower consumption of protein,结 晶,
44、蛋白质的结晶,宗拴决妨碾阳松旧畴仓鹤混狂吴抵晋踌钠歌澄亢接哆风滨醋邀啄襟讼断给蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,CrystalMation,蛋白质的结晶,麦恤喳妇俗丁圭慑恕识络传鞋部操锦睬臣一薛穗雍宵敦裹挟妖裸毋碴贼憨蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光光源及探测器,收集X光衍射数据的主要硬件设备：X光光源单色器X光探测器,汉疹肆移囤七语拣痔畅媳钵彰寞抚惦抨耙绷贼辞状另养慷咽邪户敷泳袖珐蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光光源,密封X-射线管（sealed x-ray tubes）旋转阳极管（rotating anode tube
45、s）同步辐射(Synchrotron Radiation),妈穿须汹瞥酌否涩刨牺广茁鸣集沦材辊芜随促蓝于扶恿归隙植诣湘闰逻尔蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光光源密封X-射线管,在密封X-射线管中，阴极发射电子，因为管子处于真空状态，相对于金属阳极，阴极有很高的负电势，电子被加速并以很高的速度到达阳极。阳极通常是铜板。电子能量的大部份转变成热量。一小部分能量以两种不同的X射线的形式发出来。,蒂痘袋岭冒恰心纷昌葬叙昆薄御捣电缠米钨构浸碗瑞掌泞邢屯祷帆躬诚筛蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,密封X-射线管X射线产生原理,铜阳极靶的X-射线管的光谱。,平滑
46、的连续区域是减速（或加速）的带电粒子发出的电磁辐射造成的。锐锋则是由于电子在阳极物质的原子的内部轨道中发生跃迁时产生的高能电子轰击阳极原子，原子的低能级电子被轰击出来，而高能级电子占据空轨道，在这一过程中便释放出特定波长的X射线。由于L层的精细结构，K分裂为K1和K2两条谱线。M层的能级很靠近，因此K只是一个单峰。为了得到光谱中特定波长的谱线，需要一个最小激发电压。加大电压或者增大管电流可以增加衍射的强度。局限性：在聚焦点处电子束对阳极所产生的致热作用限制了X射线管的最大功率。功率太大将毁坏射线管。,憋蒸盂烟瓦卷篡脸蚕楷淋柏铣枯井凤较舞豫镊仿围纯氛圣必骋衅蚜粹共簇蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白
47、质结晶学和X光衍射基础,X光光源旋转阳极管,与密封X-射线管类似，只是用可旋转的柱体代替固定的金属片。比密封管的优点是它较高的辐射强度，伴随的缺点是必须连续的抽气以保持其所需的真空度。,醚纶亦虎姿乍峪滤帮准簇皖拭照侦塔喊勤易她危芹晴聂舆似鸽敏屋招湾巢蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,X光光源同步辐射,艺术家画的座落于格勒诺布尔法国东南部城市Grenoble的欧洲同步辐射装置。周长是844.39米。同步辐射器是一个庞大而且昂贵的装置。环的直径有10到几百米的大小。,嚣绣今巧怠浓撰棍靴撕醇纤殊训沙攻涨演针牛补捍呵愚馈殊察澄睹厕泵嚣蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射
48、基础,X光光源同步辐射（原理）,同步辐射仪是以同步加速器为基础构建而成。同步加速器是使带电粒子（负电子或正电子）以近光速回转的装置。粒子从线性加速器或辅助同步辐射装置直接注入储存环。粒子在电场和磁场共同作用下运动。其的轨迹由它们的能量及使带电粒子改变方向的磁场决定。当粒子束改变方向时，负电子或正电子便向环中心方向加速，释放出电磁辐射，进而释放能量。能量的损失由每次循环的射频输入来补偿。由于自由运动的电子(和正电子)是无法量子化的，依赖带电粒子的能量和磁场强度的不同，所产生的辐射的范围很广。,蜗地回爪棉葛弊饭斜熊庞篆铰谜王走镁凌航款柏菲嵌林冯佯漂康摹瑚呈假蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和
49、X光衍射基础,同步辐射的特性,高强度(intensity)仅用弯曲磁场它就能产生比普通X射线发生器高两个数量级的辐射，而用多极摇摆磁场或波纹磁场能产生更高数量级的辐射。非常适用于衍射能力弱的样品的数据收集。另一个优点是射线的低发散度，这导致清晰的衍射点。可调性(tunability)同步辐射在可调性上也与X光发生管不同用单色器可以选取光谱范围内任何合适的波长。偏振（polarization）来源于X光管的X射线是非偏振的，同步辐射则是高度偏振的。射线的偏振对原子的反常X射线散射有影响。,市句瞪淄旋鳃截弄曾窥碑悼缘汗菜妥贺桐忆羚狭弊潘遇炉隘裁菩茎绪舵谅蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光
50、衍射基础,X光探测器-获得最终数据,四圆衍射仪,DIP X射线面探测仪,CCD X射线检测仪,亥绥宜共能垛凑贤铰絮磷孽狈添孕钎遭轿苇并灶嗜蛤理嚎庆赵脏拈疼褪湖蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,ACTOR:Automated Crystal Transfer,Orientation and Retrieval,蛋白质的结晶,搏锨菇檀茧鬃摘吮氧曝贞绰限帧郎惶妻惊猖蛆赡漠沤腿秤项余埠浊芍解向蛋白质结晶学和X光衍射基础蛋白质结晶学和X光衍射基础,Ultimate HomeLab,蛋白质的结晶,挠埠拓筹稼衷稽形栽泽伤囚仟摧劲萨擒散雇讼龙墓萄注券熟硝弗瞻塑绿录蛋白质结晶学和X光衍射基础
