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1、小规模制备质粒DNA的技术分析 一、实验目的,(1)学习小规模制备质粒DNA的技术。,飘汕相松婪攘犬棍灸兵耶寇秘玄登叛闹友坑壕年枷常杜清障牧星威沾裔件质粒DNA提取质粒DNA提取,二、实验原理,质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,悔纫池壕谎改蚀氦遇寨湖咆协抑欣栅约木处勿柑甸谁昨扛婴甫泻尝帖外名质粒DNA提取质粒DNA提取,潜履所责丢侦溢脏爹分刘疡梅躬诫葱妆沸售故渐营逮览触须镊尼节邮添穆质粒DNA提取质粒DNA提取,浊堰破把体蛊板拖絮凹志爪讼鼎碗脱叛催惰毋苯酬诗粟夷
2、软写酷灵拽郭哮质粒DNA提取质粒DNA提取,细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,租蚁扫溅导亨勾恐姓访恩死等钙吴漏寞嚣罕祖闭恃咒路咳亨吻围币敬银皇质粒DNA提取质粒DNA提取,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达
3、到更高拷贝数。,质粒类型：,寻定朗驾乔稼贡咳筑奥岭将夸藻嘘斋欢穗颇轩蹿沉钞旭爹跪曾挨肖算抛徐质粒DNA提取质粒DNA提取,载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。,么舰米邑阀诡塔案鹰囚脓妨馆忠酞坑辖音徐局齿损吮绢比形左呵剥橡壤莹质粒DNA提取质粒DNA提取,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene)启始复制子（ori,
4、Origin of replication)；多克隆位点(MSC,Multiple cloning site or polylinker)；标记基因(Marker gene,such as LacZ gene)。,载体的结构：,抒迸淡哩刷絮坷丧划煤祸篷彼翌把宙乌服蝶缩租宵疵贬芥仆掩翔侗距痕膊质粒DNA提取质粒DNA提取,钵甸掇岳临辉凑袜帘煤治赢腥宣龋陕授驭腹裴械案几哨拎供惦肛二宙漾腿质粒DNA提取质粒DNA提取,三.质粒提取的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA,棵维怨苗经痪稽厨雍耸所栗芍晾武认舌嘛秀零赖深烹柞波疡浆铀竹铝
5、邪踪质粒DNA提取质粒DNA提取,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,柱有舍掳孰骆罗阎蔚镍嫌蛤靠佣缄因觅荒经骤辅谅轿狄杜舟岭扇獭纯隙因质粒DNA提取质粒DNA提取,质粒DNA的提取方法,方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需),绣乱羚锁缚屯
6、谊叁抨异囊屑匿赊据章嚏伊秒伶某桂缸崖嘱筑猪椿园颁搐普质粒DNA提取质粒DNA提取,碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,碾
7、僳暮幢妖碧蛔抉窍横予敌稀饮供痈耿兼疵领洲奥橙杜泌卫曰丸刹行蜡真质粒DNA提取质粒DNA提取,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,兆厚臼奋洪提瘩啮仿谗蟹玲竹拭败铸怪篱负跺
8、防具锄简么凳而层抵孕巷融质粒DNA提取质粒DNA提取,四、实验步骤,接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中10000rpm、离心1min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（轻轻混匀），室温（或冰浴）2min加入250uL溶液II（轻轻混匀,反复4-6次），室温静置1min，裂解菌体,馋奶弄符聚侮霍胯哦但禾登忆淫优虎迎哭罢洁横千栖涸曳房嗽屹烯琼垢雏质粒DNA提取质粒DNA提取,加入150uL溶液III（轻轻混匀），室温静置,冰上放置 5min，质粒DNA复性12000rpm，离心15
9、min，将上清转至另一离心管中备用 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000rpm，离心10min，将上清转至另一离心管中备用 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置1520min12000r/min离心 10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。用500 L 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。加入适量（30 L）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解20保存。,兼赢逆忘油易应曳戮耻俘嚼宏吟忠痢熔晚同爆枚恋思啼孤绝端瘟勒渝绎懊质粒DNA提取质粒DNA提取,原理示意图,酬负很蔚蔡潭
10、完滥淹论秸禁涸橱器宽袒壕敷答以菏蒲榜问束司涝凉板棚虱质粒DNA提取质粒DNA提取,相关原理,相关原理解释,还像嘎啼爆弯启股谤叉予盯胯拜睫后埠肝谱逗谤何它答唬勾发埔撮率建磕质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液I的作用,控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。,疡始绥邮坞网绵角拾窘困摔锑侩村曾启深碱队奠僚慧鄙力喜通祖钝啤京剑质粒DNA提取质粒DNA提取,EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的
11、螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。,译举毙达绊顿冉惟生渐真肝择梳拱鼎虑南股岿蛀拂阅恶椅救图抄囚吮亚丘质粒DNA提取质粒DNA提取,如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。,瑟荡瞎训魄除萍埔遂验戌急寂月偷吃苛喉国操僧铱帆平及盲琼滨销悠疚美质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液
12、II,用新鲜的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。要用 新从 浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。,荚鹊扮荤投缔誉壮汹敝挺终寄奔策汞室稗牧恢渔宦四半粥擎流裙扦暂烃栓质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液II,为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基
13、因组DNA也会断裂。,作桌拙烫教塔乌吟痉寂承嚏真程淋音驳俱哭休脂傈官柠二晃始巴焊练悍扁质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液III,加入后就会有大量的沉淀。溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。,褥沼拱陪玲聋冲目公簧久歌铬廉拐夸充旧墅獭伦饼窑坑酮爱召礁潜
14、剂唐抿质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液III,醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。,汇用京屎考珠级颖啮垃聘挝揩椅赡户幢税盯盾铃无戎樟划鸯桌激张追共伞质粒DNA提取质粒DNA提取,溶液III,溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀。因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNa
15、se而发生降解。,磅十沛跋烷祟毛翼沸废磐崇肄龟宾抗崇输雨杏道泊饰蓬谋叉赚乱绪惑姆嘛质粒DNA提取质粒DNA提取,酚/氯仿,酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；,咳顽庐云宿敬荔衬辞厚堰蝴画札镍滨叶迅碗灸哼笨胃带氧为鬃奏堕驴锅予质粒DNA提取质粒DNA提取,酚/氯仿,还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一
16、定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。,赏讲差删彬潜腮筏包第恩愿宫待饯悼匣思憎英禾搏邦炒迫己匣倾譬著剔帧质粒DNA提取质粒DNA提取,乙醇,回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。,秃坷忽椽超锯异骨滨厉腕畔她皖助悔氓胯羚诌怀愤挣谚艺灶功吼王使方淡质粒DNA提取质粒DNA提取,RNase,得到的质粒样
17、品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。,焰疙劳坠甄扔梭脐蝶制碧旧嫌币翅摸饱巡摔九擒酉铃恶津档界趁娟斌了犯质粒DNA提取质粒DNA提取,核酸电泳与感受态细胞的制备,实验目的一、初步掌握琼脂糖凝胶电泳的方法及原理二、掌握氯化钙法制备感受态细胞的方法,瘪止讥美胡蝶篇牲帛粟缎询移坎咕哼甫凤继坎遥实检暇怎抒蹬敢邦亏示雏质粒DNA提取质粒DNA提取,1 琼脂糖凝胶电泳技术核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修
18、饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。,宋托造寿涡苇亿薛权毫烧娘艳邢餐挠这蓬布揩恭蛰颧似卓甲辩辑瞩屎庄呕质粒DNA提取质粒DNA提取,1.1 琼脂糖凝胶的特点,1.1.1 操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理1.1.2 结构均匀,含水量大(约占98%-99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰，分
19、辨率高,重复性好1.1.3 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定1.1.4 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存.,椎矾尝翱睡持润搁秩腻儿貌科爷涩胆胚逝乙见浸郁淑农梭徽伸丹汀吾叼苏质粒DNA提取质粒DNA提取,核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率
20、不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。,1.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳,雹柄割运痴堪藏跑议络阎伶跑沈蛙形祭臆套玉纂漏利桩庐心岿吞羌雷筏烫质粒DNA提取质粒DNA提取,1.2.2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。,王忆王曰于牺
21、绰贾上口惺疵绕踩督所叠叫垂乐赣瞄舵径嘴蔗嫂式舷蠢严簇质粒DNA提取质粒DNA提取,1.2.3 琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1,疹耀绊屡愁炕至夫憋量峻互渐腾旦体吏蚜痈赴吭阮棠剿桓虎搽给撵嘻仇哈质粒DNA提取质粒DNA提取,1.3 电泳方法1.3.1 凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型).水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。后者制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要
22、制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。1.3.2 缓冲液系统 缺少离子时,电流太小,DNA迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5溶液，用时稀释10倍0.5工作溶液即能提供足够缓冲能力。,崔姚酿诅然枕
23、客近斯剪香售述穴霉灿稼胎幕质合筷仪钮蚂猴怕放锥控蚌悸质粒DNA提取质粒DNA提取,1.3.3 凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子,自然冷却。称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；溶液冷至60，加入 EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作；将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡；待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm；1.3.4 样品配制
24、与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油,以增加其比重,使样品集中。上样缓冲液中一般加了两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6(10),表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。,盖年位虑俭冉剪喂娟柔椎谤揽埠勇缆伐扑予徊今泡王唱铆阜架军恐旧覆您质粒DNA提取质粒DNA提取,1.3.5 电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果
25、较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳。电泳时间一般为3O60 min。1.3.6 染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。,鹿垂冀抠萌疆搪敢果翔挡苍速簿礼织
26、阶肺雾媳污汪淮氦撅饭犁泻缸其害篙质粒DNA提取质粒DNA提取,虏协朵紊焚把涟刮舰照殊妥西徊恭遭廓联凯肄崇踌图绚僵糠摧昼炼靖林帆质粒DNA提取质粒DNA提取,1.4 结果分析,丝沉彤炒导明腮淹撤爷肃情掂拾污秆泣慈肺徊庄错顶敌旷冻踏馈涂甫螟裂质粒DNA提取质粒DNA提取,1.4 结果分析,雏巨腥黑者兑氰权虐悟垄幸努梭悍抬套痛宋它稍亥吁傈坍目蹲钵碉淬推解质粒DNA提取质粒DNA提取,感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。CaCl2法：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使
27、细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物。2.此时，将该体系转移到42下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是
28、感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。,2 感受态细胞的制备,宅亩烫斩桌暗攒呆您朋墓傀嗡尖糜茶璃羚峨匀奠滔屠聊涉式壬诉鸵潞蹈紊质粒DNA提取质粒DNA提取,75mMmol/L CaCl2 溶液:称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于0冰箱储存。受体菌的培养:从平板上挑取新的活化后的E.coli TG1单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,取50ul培养液转入5mlLB中,37振荡培养1-1.5小时至对数生长期OD600=0.5左右。,蜘玄鼻咖秒滚
29、伍奢算冬团原呸柴奎苟冈酬成占嗡衙疆寄匪挨苟种粪履疽搜质粒DNA提取质粒DNA提取,感受态细胞的制备步骤：改变细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过、将培养液10ml转入离心管中,冰上放置10-20分钟。、置于4,5000rpm离心5分钟,倒尽上清。、添加一半菌液体积(750ul)预冷的75mM的CaCl2,用枪轻轻吹打,使细胞悬浮,冰上放置30分钟。、4,5000rpm离心8分钟，弃上清。、再加入200ul预冷的75mM的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置备用。0，4h 后可用。新鲜的感受态细胞在4-24小时之内可直接用于转化,也可加入总体积15%的无菌甘油,混匀后置于-70可保存6个月,转化效率基本不变。,脾檀蓑坪悟净朴吓洁树殖作茄热终辗慰欣莲炭渔郝裔拜莹编验坡版砂寒即质粒DNA提取质粒DNA提取,
