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1、,第四章,糖蛋白与蛋白聚糖,4.1.概述 糖类指多羟基醛和多羟基酮及其缩合产物，carbohydrate曾译为碳水化合物；saccharide更多地与前缀组词，如monosacchride(单糖)、oligosaccharide(寡糖)和polysaccharide(多糖)等；sugar除表示食糖外还用于表述糖类的组成，常有单糖的含义；glycan则译为聚糖，是寡糖和多糖的统称。，糖类仅仅被视为主要的能源物质、碳源和结构材料，对糖类的研究局限于单糖及其代谢，以及淀粉、糖原等少数多糖。虽然早就发现糖-肽共价复合物，鉴于一些含糖的酶类去掉糖组分之后活性并无明显改变，因而把糖组分当作杂质，千方百计加
2、以去除。,(1)复合糖的分类：复合糖(complex carbohydrate)可分为 聚糖(glycam)和糖缀合物或糖复合物(glycoconjugate)。其中聚糖包括同聚糖(homoglycan)和杂聚糖(heteoglycan)；糖缀合物则包括糖肽复合物(glycopeptede complex)、糖脂复合物(glycolipid complex)和糖-核酸复合物(carbohydrate-nucleic acid complex)。糖肽复合物可分为肽聚糖(peptideglycan)或胞壁质(murein)，是细菌细胞壁结构材料；糖蛋白(glycoprotein)和蛋白聚糖(pro
3、teoglycan)。糖脂可分为糖鞘脂(glycosphingolipid)、糖基酰基甘油(glycosylacylglyceride)和脂多糖(lipopolysaccharide)。,(2)糖蛋白和蛋白聚糖中常见的单糖组分：糖复合物中常见的单糖组分包括4种己糖：D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、L-岩藻糖(L-Fuc)；两种乙酰化己糖胺：N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；两种糖醛酸：D-葡萄糖醛酸(GlcA)和L-艾杜糖醛酸(IdoA)；一种戊糖：D-木糖(D-Xyl)以及甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸缩合产物，它的
4、4、7、9-位羟基和5-氨基发生取代产生一系列产物，统称唾液酸(Sia)，其中最重要的是N-乙酰-D-神经氨酸(NeuNAc)等。,(3)聚糖结构的复杂性：糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分尽管由上述为数有限的几种单糖组成，但每种单糖有吡喃式与呋喃式结构之分，异头碳有-与-型之分，每个单糖有多个羟基，可能以不同的方式形成糖苷键和分枝结构。两种不同的氨基酸可形成两种二肽；3种不同的氨基酸可形成6种三肽；6种不同的氨基酸可产生176种六肽。而两种相同的己糖可能形成11种二糖；三种相同的己糖可产生176种三糖；6种不同的己糖则能形成109种六糖，如带有分枝六糖的数目可达1012个。如果考虑到糖残基不同部位进
5、一步修饰：磷酸化、硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基内部脱水成内醚等，聚糖的 数目无疑会更大。聚糖结构的复杂性增加了研究工作的难度，同时暗示它可以蕴含更多的信息，成为生物信息的理想载体。,(4)糖缀合物的许多重要的性质和功能与其糖链特有的结构密切相关，为了便于表现糖链的结构，我们将采用一套流行的简化符号系统(图4.1)，标明糖链单糖之间的连接方式及其修饰状况。,图4.1 推荐的描述糖链结构的简化符号与惯例以一个复杂型分枝的双天线N-聚糖为例。除L-Fuc和L-IdoA外，其余糖基均为D-型；糖链中的单糖都是吡喃型(六元环)的；除Sia的糖苷链从C2开始，其余糖基的糖苷链均从C1开始。,4.2.糖蛋白
6、(glycoprotein)广义的糖蛋白泛指糖肽共价复合物。为了研究的方便，目前已将肽聚糖和蛋白聚糖划分出来，狭义的糖蛋白专指肽链与一个或多个聚糖链共价结合形成的复合物，其聚糖链通常少于15个单糖残基（少数聚糖链可能含有20030个单糖残基），且大多数具有分枝。,4.2.1 糖蛋白的结构4.2.1.1 糖蛋白结构研究 糖蛋白的结构研究包括蛋白质部分的结构测定和糖链部分的结构测定。,(1)聚糖链与蛋白质的分离：从糖蛋白释放完整的N-聚糖可采用专一的肽：N-糖苷酶F水解，也可用肼解裂解。O-聚糖可用内切-N-乙酰氨基半乳糖苷酶水解，或在0.050.1mol L1 NaOH_ molL1 NaBH4
7、通过-消去反应来完成。反应中产生的聚糖还原端被NaBH4还原成对碱稳定的糖醇，以防糖链被碱降解。如用3H标记的硼氢化钠，可对释放的聚糖还原端进行标记，便于在分离纯化中跟踪。也可用蛋白酶降解。产物进行分级分离与纯化，得到不同的糖肽和或聚糖链，即可用于结构分析。,1,(2)聚糖的单糖组分分析：用糖苷酶或酸碱将上述糖肽水解，把其中的单糖组分转变成热稳定挥发性衍生物(如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等)，再用气-液相色谱法(gas-liquid chromatography,GLC)进行鉴定和定量，检测精度可达n mol级。GLC与质谱法(mass spectrometry,MS)联用，检测精
8、度可达10pmol级。如将单糖还原端进行荧光标记，再用HPLC(high-pressure liquid chromatoqraphy)与荧光测仪对其进行鉴定和定量，检测精度可达pmolfmol水平。1980年代HPAEC-PAC(high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)用于单糖组分分析，无需制备单糖衍生物，检测精度可达550 pmol水平。氨基糖可用氨基酸分析仪测定；唾液酸除用灵敏度较低的比色法测定外，已能利用高灵敏度GLC-MS对离子化的唾液酸进行测定。,(3)糖链结构分析：已发展了一
9、系列技术，可对糖链中每个单糖残基的异头结构(或)、环式结构类型(p或f)以及与其它糖残基连接键的位置进行测定。这些方法包括外切糖苷酶消化，利用特异性极高的外切糖苷酶水解糖链，再用HPLC、HPTLC(high-performance thin-layer chromatography)和HPCE(high-performance capillary electrophoresis)成套仪器进行检测，精度达fmolpmol级，可得到糖基连接链位置的信息。由于可用的高专一性外切糖苷酶种类有限，这种方法的应用有很大的局限性。甲基化分析法利用甲基化等修饰反应制备糖衍生物，经GLC与质谱仪联用进行检测，
10、精度可达0.110 pmol，可鉴定和定量残基上特定位点取代以及糖的环式构型。质谱法在糖结构分析中可测定糖环上键的类型与位置，如采用FAB(fast-atom bombardment)、LSIMS(liquid secondary ion mass spectrometry)和MSMS(tandem mass spectrometry)，检测精度可达fmolpmol水平。NMR(nuclear maqnetic resonance)用于糖结构分析可测定糖基的异头构型和键的位置，精度达10pmoln mol水平，最显著的优点是无需制备糖衍生物。,(4)糖链序列分析：早期曾用外切糖苷酶从糖链非还原
11、端依次切下特定的单糖，同样由于可用的酶种类有限，而且进行糖链序列分析的糖苷酶纯度应当极高，因而限制了这种方法的应用，常用的糖苷酶见表4.2。1980年代之前，糖链测序主要用MS和MS-GLC法，需对样品进行甲基化、乙酰化等预处理。1980年后采用FAB-MS和ESI(electrospray ionization)-MS，检测精度达n molp mol水平。,4.2.1.2 糖-肽连接键的类型 糖蛋白中的聚糖链均由其还原端以接枝方式与肽链特定部位的氨基酸侧链基团相连接，主要分为以下两大类：(1)N-连接键：D-GlcNAc-Asn，又称型糖肽键，由糖链还原端的-D-GlcNAc残基C1-OH基
12、与多肽链Asn残基侧链酰胺-NH2间缩合，形成C-N糖苷键，广泛分布于许多糖蛋白中。以肽链N端-NH2为连接点形成的N-糖-肽键迄今仅见于血红蛋白Alc。(2)O-连接键：由糖链还原端与含羟基的氨基酸侧链-OH间形成C-O糖苷键。又可分为：D-GalNAc-Ser/Thr，又称为(i)型糖-肽键，分布广泛。D-Xyl-Ser/Thr，又称(ii)型糖-肽键，主要存在于一些蛋白聚糖中。D-Gal-Hyl，又称型糖-肽键，主要存在于胶原和丝心蛋白中。D-Ara-Hyp，仅见于高等植物中的一些糖蛋白。,型乳糖,Gal（14）Glc,蔗 糖,Fru（21）Glc,茧 蜜 糖,Glc（11）Glc,血清
13、糖蛋白多以N-糖肽键连接，因而N-聚糖又称为血清型(plasma type)。血清型聚糖均由一个共同的五糖核心和不同数量的外链组成。核心五糖结构如下：,Man1,Man1,3,6,4.2.1.3 N-聚糖的结构,根据核心五糖中两个-Man上连接的糖基，N-聚糖可分为三类：高甘露糖型（high-or oligo-mannose type)、复杂型（complex type）和杂合型（hybrid type）。,图4.2 三种类型的N-聚糖结构示意图虚线框内为核心五糖。A.高甘露糖型；B.复杂型；C.杂合型,高甘露糖型,复杂型,图4.3 复杂型N-聚糖天线数及其位置,图4.4 N-聚糖外链结构示意
14、图见于1型糖链；兼有2，3和 2，6 Sia的外链；1型H抗原；无Fuc1-2者为Lae抗原；有Fuc1-2者为Leb 抗原；5Lea抗原；见于2型糖链；常见的唾液酸化三糖外链；2型H抗原；无Fuc1-2者为Lxe抗原；有Fuc1-2者为L ey抗原；(10)sLex 抗原；(11)仅存在于灵长类以下的哺乳动物；(12)存在于少数糖蛋白外链中,4.2.1.4 O-聚糖的结构 GalNAc-O-Ser/Thr糖肽键最早发现于粘蛋白，因而O-GalNAc聚粘又称为粘蛋白型(mucin type)。最简单情况Ser/Thr只连接一个GalNAc,见于不多几种粘蛋白和分泌性糖蛋白中。少数糖蛋白中Ser
15、/Thr上连接一个二糖，包括Sia2-6 GalNAc-；Gal1-3 GalNAc-；GlcNAc1-3 GalNAc-；Gal1-3 GalNAc-。含有两个以上糖残基的O-聚糖可将其结构分为核心、骨架和非还原端三部分。(1)核心：与N-聚糖都只有核心五糖不同，O-GalNAc聚糖至少有7种核心结构，如图4.5所示；其中核心结构较为常见；核心结构和分别是上述二糖和；核心和有分枝。,(2)骨架：指核心结构外侧的延长部分，与N-聚糖的外链相似，基本上由连接的Gal-GlcNAc二糖单位组成，包括Gal1-3 GlcNAc(1型结构)、Gal1-4GlcNAc(2型结构)和(Gal1-4 Glc
16、NAc1-3)n以及N-聚糖中不存在的Gal 1-3 GalNAc(3型结构)和Gal1-3 GalNAc-(4型结构)。O-GalNAc聚糖骨架的Gal C6位常连有GlcNAc1-6分枝，如Gal1-4 GlcNAc1-3(Gal1-4 GlcNAc1-6)Gal1-结构，i抗原直链结构上如形成这种分枝就转变成I抗原。,(3)非还原端：O-GalNAc聚糖的非还原端常是在Gal上连一个Sai2-3或在GalNAc上连一个Sia2-6。还有相当一部分O-GalNAc聚糖末端糖基被硫酸化，虽然糖链中部的糖基也可能被硫酸化。O-GalNAc聚糖非还原端部分往往构成血型抗原，例如图4.4中和分别为
17、1型H和2型H抗原；则根据有无Fuc1-2分别为Lae和Lbe抗原；则按有无Fuc1-2分别构成Lxe和Lye抗原。在H-1和H-2抗原结构Gal上分别以1-3链连接Gal或GalNAc，就成为B-1、B-2和A-1、A-2抗原。,4.2.2 糖蛋白的生物合成 糖蛋白肽链部分的合成由特定基因转录的mRNA直接编码，聚糖部分是后加的。N-聚糖的合成在肽链合成尚未完成时即已开始，是伴翻译(co-translational)过程，O-聚糖的合成则是翻译后(post-translational)修饰过程。糖基化位点的选择、糖肽键的类型以及聚糖链的组成和结构，都是在基因组编码的一系列特异性酶顺序作用下，
18、在细胞内特定的微环境中形成的，因而可以认为聚糖链的合成受到基因组严格而精准的间接控制。,4.2.2.1 活化糖基供体的合成 所有的生物合成都需要把单体事先活化，以利于反应朝着合成的方向进行。聚糖链合成所需要的单糖也必需转化成相应的活化形式，才能在糖基转移酶催化下参入聚糖。蛋白质糖基化反应所需活化糖基供体有三种类型：Glc、Gal、GlcNAc、GalNAc、Xy1和GlcA均为UDP-糖基；UDP-GlcA经表异构酶催化可转化成UDP-IdoA；Man和Fuc为GDP-糖基；Sia则以CMP-Sia为活化供体；此外，UDP-Glc和GDP-Man还能将糖基转移到ER膜中的Dol-P上，以Dol
19、-P-Glc和Dol-P-Man的形式被糖基化反应利用。图4.6简要概括了这些活化糖基供体的合成路线与相互转化。,图4.6 活化糖基供体的生物合成及其相应转化带阴影的矩形框为活化糖基供供；椭圆为单糖；星号处为控制点,4.2.2.2 N-寡糖的合成 早在1960年代至1970年代，利用重建的无细胞系统和凝集素耐受细胞系阐明了N-聚糖生物合成的基本途径。结果发现首先在ER中组装一个脂质载体连接的寡糖前体，再把这个寡糖前体转移到新生肽链合适的糖基化位点上，最后在ER和Golgi器中经过一系列剪接加工，形成成熟的糖蛋白。从1980年代开始克隆N-聚糖生物合成涉及的糖基转移酶和糖苷酶的基因并延续至今。这
20、些基因特殊的表达模式以及它们编码的酶突出的底物专一性为阐明N-聚糖特殊结构的形成与变化具有重要意义。还注意到胚胎发生、细胞活化和肿瘤形成等条件下N-聚糖的结构发生改变，为研究N-聚糖的生物学功能提供了新的契机。,(1)多萜醇寡糖前体的组装：N-聚糖的前体由14个特定的单糖连接而成，在所有真核细胞中这个寡糖前体的结构是保守的。寡糖前体在磷酸多萜醇上组装(图4.7)。动物的多萜醇含1721个异戊二烯单元，真菌类和植物的多萜醇含有1424个异戊二烯单元。多萜醇的极性端通过焦磷酸与糖相连接，长长的烃链插入ER膜，把正在合成的寡 糖前体锚定在ER膜上。,如图4.8所示，多萜醇焦磷酸寡糖前体组装的第1步反
21、应由GlcNAc-1-磷酸转移酶把GlcNAc-P从UDP-GlcNAc上转移到给Dol-P,同时释放1分子UMP；然后再由GlcNAc转移酶从UDP-GlcNAc上把第二个GlcNAc转移到Dol-PP-GlcNAc上，同时释放1分子UDP。接下来，在第2步反应中由5种不同的Man转移酶以GDP-Man为糖基供体，依次添加5个Man。通过尚不完全了解的机制，Dol-PP-GlcNAc2-Man5穿越ER膜翻转到ER腔(步骤3)。4个GDP-Man在ER膜胞液一侧把Man转移到Dol-P上，生成的Dol-P-Man翻转到ER腔（步骤4和5）。在ER腔，4种Man转移酶以Dol-P-Man为活化
22、糖基供体，向Dol-PP-GlcNAc2Man5 再添加4个Man残基(步骤6)。3个UDP-Glc在ER胞液一侧把Glc转移到Dol-P上，生成的Dol-P-Glc也翻转到ER腔(步骤7和8)。最后，由Glc转移酶以Dol-P-Glc为糖基供体添加3个Glc残基(步骤9)，完成Dol-PP-GlcNAc2 Man9 Glc3,寡糖前体,寡糖前体的组装。,多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成过程涉及拓扑变化。正如图4.8所示，反应1、2、4和7都发生在ER胞液一侧，反应6、9和10都发生在ER腔内。反应2形成的中间产物和反应6、9所需要的糖基供体都必需在ER膜中翻转到ER腔。尽管目前尚不清楚这种翻转移位
23、的机制，但用糖基化抑制剂、内翻外的粗糙型ER囊泡进行的研究都直接或间接证明了上述中间产物翻转移位的事实。,图4.8 多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成途径,(2)寡糖前体转移到新生肽链上：上述完成组装的寡糖前体已具备了转移到新生肽链上的条件，当肽链中出现合乎要求的Asn残基(Asn-x-Ser/Thr)时，包括14个糖残基的寡糖前体整体转移，同时释放1分子Dol-PP，再翻转到ER胞液面(步骤10和11)，其后经磷酸酶作用Dol-PP失去一个磷酸基，又变成Dol-P，可以参与下一轮寡糖前体合成(步骤12)。寡糖前体的转移是由ER膜中的寡糖转移酶(oligo-sacharyl transfrase,OS
24、T)催化的。酵母OST复合物至少包含9种不同的亚基：Ostlp、Ost3p、Wbp1p、Stt3p、Ost6p、Swplp、Ost2p、Ost5p和Ost4p，所有这些亚基都是跨膜蛋白，有18个跨膜域，其中Ost1p对其活性必不可少(图4.9)。寡糖前体末端的3个Glc显然是其转移信号，OST可识别其非还原端的3个Glc和还原端的GlcNAc，如果切掉最外侧的两个Glc，其转移活性只剩下1/9；如将3个Glc全部切掉，就不能再被转移。OST同样具备识别多肽链中合适糖基化位点的能力。,(3)N-糖链的加工和成熟：结合在肽链上的十四寡糖首先被ER中的葡萄糖苷酶切去非还原端Glc1-2残基，再由-葡
25、萄糖苷酶切下另外2个Glc残基。切除Glc不仅是开启后续加工的信号，而且与蛋白质折叠有关。如果糖蛋白折叠不适当，即可被ER 腔一种UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶识别并重新糖基化，带有Glc-Man9-GlcNAc2寡糖的不当折叠蛋白质即可被ER腔中的一种有糖结合活性的分子伴侣钙连蛋白(calnexin)识别并结合，然后结合于多肽链部分，把十二寡糖的Glc1-3Man-暴露给-葡萄糖苷酶。-葡萄糖酶和UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶交替作用，直至多肽链正确折叠。正确折叠的肽链糖基化位点附近的疏水片段不再暴露，葡萄糖基转移酶不再结合，最后一个Glc被切去，钙连蛋白解离，寡糖的加工继续进行
26、(图4.10)。,图4.10 ER钙连蛋白(calnexin)在糖蛋白的折叠中的功能Glcase和为-葡萄糖苷酶和，Glc-T为UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶,上述带有十一寡糖Man9-GlcNAc2-糖蛋白随即被ER中的-甘露糖苷酶切去核心糖1-6臂上的1-3分枝末端1-2连接的Man残基，生成的Man8GlcNAc2-Asn结构即可进入Golgi体继续加工。有些糖蛋白的Man8GlcNAc2-Asn结构可被一种特殊的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶识别，在两个1，2连接的末端Man内侧Man上各转移一个GlcNAc-P-基团，然后再由一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切去GlcNAc,把磷酸基留
27、在Man C6位。这种有Man-6-P的寡糖是糖蛋白被分拣和运输到溶酶体关键的结构信号。上述反应在ER/Golgi中确切的定位尚不明确。另一些糖蛋白则可在Golgi器-甘露糖苷酶作用下，切去以1-2连接的其余3个Man残基。,除上述逐步加工途径外，ER中还有一种内切-甘露糖苷酶，可切除Glc-Man9GlcNAc2-Asn 结构末端的Glc1-3Man,生成的Man8GlcNAc2-Asn进入Golqi体，由其中的-苷露糖苷酶切去3个1-2连接的Man(图4.11)。,图4.11 ER和Golgi体内N-寡糖的加工,GlcNAc-P-T:N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶；GlcNAcase:N-乙
28、酰氨基葡萄糖苷酶。,在Golgi体内，上述Man5GlcNAc2-Asn结构如继续添加Man，可形成高甘露糖型N-聚糖。如果由N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶在核心结构1，3臂的Man上添加一个1-2连接的GlcNAc，或由-甘露糖苷酶继续切除1-6臂上的两个Man，再添加适当糖基，可形成杂合型N-聚糖。如果Man5GlcNAc2-Asn结构在-甘露糖苷酶作用下切去1-6臂上两个Man，再由N-乙酰氨基葡萄基转移酶添加1个GlcNAc，产物再由N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶作用在1-6连接的Man上以1-2连接1个GlcNAc，产物还可由岩藻糖基转移酶在Asn连接的GlcNAc上以1-6连接一个Fuc,
29、生成的寡糖都可以成为复杂型N-聚糖的“核心”部分(图4.12)。,图4.12 Golgi体中产生高甘露糖型、杂合型和复杂型N-聚糖的基本途径GlcNAc-T，-T：N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，,上述复杂型N-聚糖“核心”在不同糖基转移酶作用下，顺序添加糖基，形成各具特点的聚糖链。图4.13出示了几种双天线复杂型N-聚糖的合成路线，包括末端为1-3连接的Fuc、2-3/6连接的Sia以及1-4连接的GlcNAc 4-SO4残基的外链。,图4.13 几种双天线复杂型N-聚糖的合成1-4GaT为1-4半乳糖基转移酶；1-4GlcNAc T为1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；1-3Fuc为1-3岩藻糖基转
30、移酶；ST6 Ga1-1为CMP-Sia：Gal2-6唾液酸转移酶-,上述外链延伸和修饰主要在trans-Golgi垛叠和trans-Gogli网络(TGN)中进行(参看图3.31)。除1-4Gal T外，还有一种1-3GlcNAc T-i，二者交替作用，合成(Gal1-4GlcNAc1-3)n。外链带有Gal的N-聚糖进入TGN后，在非还原端添加Sia而终止外链的合成。N-聚糖“核心”在1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶和GlcNAc-4硫酸转移酶相继作用下完成4位硫酸化的外链合成。1-4GlcNAcT对受体糖链(杂合型或双天线复杂型)有专一性，能识别LH和TSH肽链糖基化位点氨基一侧含有Arg
31、(或Lys)的序列。接于外链GlcNAc上的Fuc由1-3岩藻糖基转移酶催化。高等动物至少有5种1-3FucT,分别为、和，有组织分布专一性。其中型1-3FucT以2型糖链为受体时形成Fuc1-3连接；以型糖链为受体时则形成Fuc1-4连接，是“一种糖基转移酶只形成一种糖苷键”这一法则唯一的例外。,多天线N-聚糖的合成涉及6种不同的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GlcNAc T),其中GlcNAcT-和T-作用于核心五糖1-3臂Man，分别形成1-2和1-4连接键；GlcNAcT-、T-和T-作用于1-6臂Man，分别形成1-2、1-4和1-6连接键(图4.14)。合成单天线只需要GlcNAcT-
32、；双天线需要GlcNAcT-和T-；C2，4，C2三天线需要GlcNAcT-、T-和T-；C2，2，6 三天线需要GlcNAcT-、T-和T-；合成四天线则需要GlcNAcT-、；GlcNAcT-负责合成平分型GlcNAc。这6种GlcNAc T均以UDP-GlcNAc为糖基供体，而受体各不相同，有严格的糖基序列专一性，因而它们的作用先后也有严格的顺序：GlcNAcT-最先作用，其次是GlcNAcT-，然后是-甘露糖苷酶，接下来是GlcNAcT-和T-，最后是GlcNAcT-。,C,图4.14 6种GlcNAcT(1)的作用位置及形成的糖苷键,4.2.2.3 O-GalNAc聚糖的合成 O-G
33、alNAc聚糖的合成是在已折叠的蛋白质表面适当的Ser/Thr上逐个添加糖基。O-GalNAc糖基化的发生比N-糖基化要晚，尚不能确定加上第一个GalNAc的确切亚细胞定位。很可能不同的糖蛋白O-GalNAc糖基化起始部位也不同，可以在ER、过渡小泡或cis-Golgi扁囊。起始之后，O-GalNAc聚糖其它糖基的添加、糖链延伸和非还原端形成都发生在Golgi体内。O-GalNAc聚糖合成起始步骤由多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化。哺乳动物至少可编码8种ppGalNAcT，其中的4种(ppGalNAcT-14)已进行了体外重组研究。多种GalNAcT同工酶很可能有差异地
34、定位于不同的亚细胞区隔，与一些糖蛋白糖基化作用的组织和细胞类型专一性有关。可将O-GalNAc聚糖酶合成划分为三个阶段：核心结构的合成；糖链延伸和分枝；非还原端的形成。,(1)核心结构的合成：O-GalNAc聚糖至少有7种核心结构，都是在GalNAc被pp GalNAcT添加到肽链上之后，再由有关的糖基转移酶顺序添加糖基形成的(图14.15)。核心11-3半乳基转移酶(corel Gal T)负责把1个Gal以1-3键连接到GalNAc-Ser/Thr上，形成核心1。已在脊椎动物中发现至少3种corel GalT，可能也存在一个像ppGalNAcT一样的家族，有差别地在特定的组织和细胞类型中表
35、达，并表现出底物选择性。核心21-6N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(core 2 GlcNAcT)把1个GlcNAc以1-6键连接到核心1GalNAc残基上，形成核心2。核心31-3GlcNAcT转移酶(core 3 GlcNAcT)把1个GlcNAc以1-3键连接到GalNAc-Ser/Thr上，形成核心3。由于core 3 GlcNAcT与core 1 Gal AT都要利用相同的糖基受体，与core 2 GlcNAcT利用相同的糖基供体和相似的受体，因而在某些情况下，它们之间会出现竞争。核心41-6 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶负责把另一个GlcNAc以1-6键连接到核心3的GlcNAc残基上，产生
36、核心4。另外三种出现频率较低的核心结构分别由core 5 GalNAc T、core 6 GlcNAc T和core 7 GalNAc T以GalNAc-Ser/Thr为糖基受体而生成的。,图4.15 Gal NAc聚糖核心结构的合成,(2)糖链的延伸和分枝：糖链延伸就是在上述核心结构上逐个添加糖基，通常是1-3连接的GlcNAc或1-4连接的Gal。例如由1-3GlcNAcT在核心1或核心2的Gal上添加一个GlcNAc1-3，或由1-4Gal T在核心2，3，4中1-3GlcNAc或1-6GlcNAc残基外侧添加1-4连接的Gal。其次，还有1-6GlcNAc T、1-3Gal T参与链延
37、伸，形成前面14型骨架结构（图4.16）。1-3GlcNAc T和1-4Gal T交替作用，可形成LN重复序列（图4.17）。,图4.16 1型和2型骨架的合成,图4.17 多聚N-乙酰乳糖胺的合成,外链骨架上的Gal1-4可接受1-6GlcNAc T转移的GlcNAc T1-6残基而形成分枝（图4.18）。这个酶不同于参与N-聚糖合成的GlcNAc T-V和参与核心2和核心4合成的GlcNAc T，只能以O-GlcNAc 聚糖外链中的Gal1-4为糖基受体。参与O-GalNAc聚糖核心和骨架合成的糖基转移酶具有严格的底物序列专一性，因而作用有一定的先后顺序。例如核心1的Gal上接受1个1-3
38、连接的GlcNAc后，就不能作为core2 GlcNAc T的底物。同样，核心2中的Gal可接受1个1-3连接的GlcNAc，然后才能在Gal上连接1-6GlcNAc。这种3位取代抑制6位取代的现象被称为“3先于6（three-before-six）”规律。,图4.18 由线性多聚乳糖（i抗原）生成1-6分枝多枝多聚乳糖胺（I抗原）示意图,（3）非还原端的形成：O-GalNAc聚糖的非还原端大致可通过三种方式形成：唾液酸化、硫酸化和岩藻糖基化。其中硫酸化只能对原来的非还原端糖基进行修饰。2-3唾液基转移酶家族至少已发现5个成员（ST3Gal-I、ST3Gal-、ST3Gal-、ST3Gal-和
39、ST3Gal-）负责以2-3键在末端Gal上引入一个Sia残基。这些酶的表达有组织专一性，只作用于O-聚糖和某些糖脂末端的Gal（图4.19）。,图4.19 糖链末端Gal的2-3唾液酸化 括号内的酶在体外系统活性相对较低,带有2-3Sia的聚糖通常不再接受其它酶进一步的修饰。糖链末端或次末端甚至内部的GalNAc残基可2-6唾液酸化。催化该反应的2，6唾液酸转移酶家族至少存在5个成员（ST6Gal-I、ST6GalNAc-I、ST6GalNAc-、ST6GalNAc-和ST6GalNAc-）（图4.20）。末端2-6唾液酸化的聚糖通常也不接受进一步的修饰。此外，还有一个2-8唾液酸转移酶家族
40、，在糖蛋白和某些糖脂上合成2-8连接的线性多聚唾液酸。,图4.20 GalNAc的2-6唾液酸化括号内的酶在体外系统相对活性较低,聚糖硫酸化通常出现在Gal、GalNAc、GlcNAc、GlcA和IdoA上，这些硫酸化的糖基可以是非还原端的也可能是内部的。反应由硫酸转移酶家族催化，以PAPS为活性硫酸供体。例如唾液酸化的Lewis X抗原末端四糖为1-3GlcNAc（1-3Fuc）1-4Gal2-3Sia中的Gal第6位被硫酸化或GlcNAc第4位被硫酸化，或者二者均被硫酸化。硫酸化还可发生在末端Gal和GlcNAc第4位、GlcA第3位等位点上。部分聚糖链（尤其是血型抗原）合成中，非还原端G
41、al的岩藻糖基化是必需步骤，反应由1-2FucT催化。此外，还有1-3Fuc T催化外链中GlcNAc的1-3岩藻糖基化以及N-聚糖与Asn相连的GlcNAc的1-6岩藻糖基化（参看N-聚糖加工成熟有关叙述）。,4.2.2.4 糖蛋白生物合成的调控（1）糖基化位点的选择：据统计，多肽链中的N-糖基化位点Asn-x-Ser/Thr三联序列子大约只有三分之一被N-糖基化，说明决定是否糖基化还有很多因素。如 这个三联序列如处于亲水片段才能被N-糖基化。三联序列子约70%处于-转角，N-糖基化的几率最高；约20%处于-折叠，而10%处于-螺旋中的三联序列子N-糖基化几率最低。三联序列子中的X也明显影响
42、N-糖基化效率。如狂犬病病素糖蛋白3739位的Asn-Leu-Ser糖基化率为43%，把Leu38分别突变成Glu、Asp、Trp和Pro，糖基化率依次递减为24%、19%、5%和0；如X为Cys，可因形成二硫键降低N-糖基化几率。邻近三联序列子的氨基酸也可影响其糖基化率，如为Pro则降低糖基化率，羟基氨基酸则促进N-糖基化。,尽管对许多O-糖基化位点周围的氨基酸序列进行了对比和分析，至今尚未找出一致序列。许多O-糖基化位点Ser/Thr附近多为Ala、Ser、Thr等，1和3位多为Pro，没有带电荷的残基，大多数处于-转角。,常识告诉我们，蛋白质是否被糖基化？在何处糖基化？合成什么样的聚糖链
43、？都与蛋白质自己的结构有密切的联系，只是现在所知尚少。,（2）糖基供体的可利用性：活化糖基供除CMP-Sia在核内合成，其余的都在胞液中合成，ER-Golgi膜上的糖核苷酸运输系统必然影响糖基供体的可利用性，从而对糖基化作用进行调控。利用ER-Golgi膜微囊以及运输系统有缺陷的突变体细胞进行的研究表明，Golgi体拥有的运输系统如图4.21所示，而ER拥有其中UDP-Glc、UDP-GlcA、ATP、UDP-GalNAc和UDP-GlcNAc的运输系统。这些运输系统实际上是双向搬运工，一方面把活化糖基供体运入ER-Golgi腔内，使它们的浓度增加1050倍，足以达到或超过估算的多数糖基转移酶
44、对其糖基供体的Km，保证了糖基化反应对供体的需求；另一方面，糖基转移反应生成的5-NMP不仅抑制运输装置，还强烈抑制糖基转移酶的活性，及时将其移出ER-Golgi腔对保证糖基转移酶有足够的活性很重要。作为整个调节机制的一环，上述运输系统显然是不可或缺的。,图4.21 Golgi膜上糖-核苷酸、ATP和PAPS的运输系统,（3）遗传控制：除了不多几种加工性糖苷酶，聚糖生物合成主要涉及糖基转移酶。大多数糖基转移酶是膜蛋白，迄今已研究过的Golgi糖基转移酶均为型膜蛋白：短的N-端在细胞溶胶内，单跨膜，巨大的C-端催化域位于膜的非胞液一侧。与溶酶体中P-6-Man合成有关的两个酶：N-乙酰氨基葡萄糖
45、-磷酸转移酶和-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶为型膜蛋白，N-端催化域在Golgi腔内。糖基转移酶显著的特点是具有极高的底物专一性，即对糖基供体和受体的结构有高度选择性，前一个酶的产物优先被另一糖基转移酶用作后续糖基化的受体底物，结果一组相关的糖基转移酶按一定的顺序作用，以非凡的精确度把单糖基彼此连接成特定的聚糖。,人体红细胞A、B、O（H）血型抗原是说明聚糖结构受基因型间接控制的良好范例。图4.22出示了14型A、B、O（H）血型抗原结构。A、B、O（H）抗原的合成起始于1-2Fuc转移酶对前体聚糖的修饰。人类基因组的H基因编码一个H1-2Fuc T，Se基因编码一个Se1-2Fuc T，前者在红细
46、胞中表达，利用2型和4型聚糖前体；后者在消化道、呼吸道、生殖道和唾液腺上皮细胞中表达，利用1型和3型聚糖前体，合成分泌型血型抗原，分泌到血浆中，被红细胞吸附于表面。1-2FucT把1个Fuc以1-2键连接到14型聚糖前体的非还原端Gal残基上，形成O（H）抗原。A基因型ABO基因座位的A基因编码一种1-3GalNAc T（A转移酶），在H抗原的Gal上添加1个1-3连接的GalNAc,成为A抗原。B基因型ABO基因座位的B等位基因编码一种1-3Gal T（B转移酶），在H抗原的Gal上添加1个1-3连接的Gal，形成了B抗原（图4.23）。,图4.22 A、B、O（H）、血型抗原的结构,O基因
47、型的O等位基因缺258位碱基，结果不能编码有活性的酶，不能对H抗原进一步修饰。AB血型的人既有1-3GalNAc T，又有1-3Gal T，所以同时拥有A抗原和B抗原。A转移酶和B转移酶要求其糖基受体末端1-3（4）Gal必须1-2岩藻糖基化。,图4.23 A、B、O（H）血型抗原的合成,Bombay基因型个体因1-2Fuc T缺失而不能进行岩藻糖基化，或者先被唾液酸化，A转移酶或B转移酶都不再利用它作为底物。所以Bombay型的人既没有H抗原，也没有A抗原和B抗原,再次表明，在糖基转移酶组成的聚糖装配线上，位置越靠前的酶，一旦出现缺失影响的聚糖结构越多。人体免疫系统产生的IgM可与相应的AB
48、O抗原相互作用。O型个体可产生抗A抗原的抗体和抗B抗原的抗体，血液中都保持相当高的IgM效价；A型个体血浆中含有相当多的抗B抗原的IgM抗体；B型个体血浆中含有很高的抗A抗原的IgM抗体；而AB型个体既不产生抗A抗原的IgM，也不产生抗B抗原的IgM。血浆中的IgM抗体能与“异己的”红细胞膜上相应的抗原发生凝集反应，并激活补体系统，导致低血压、休克、肾衰竭、循环衰竭甚至死亡。因此必需对供血者和受血者进行正规的交叉匹配，以避免发生输血反应。,合成A抗原的A转移酶与合成B抗原的B转移酶同属一个1-3Gal转移酶家族，它们之间只有4个氨基酸不同，它们的基因也只有4个碱基不同：,研究表明，不同种属的同
49、一组织或同一种属的不同组织中，相同肽链上连接的聚糖并不相同，即聚糖结构具有种属和组织专一性。例如质膜糖蛋白-谷氨酰转肽酶（-GT），人和牛的肾-GT聚糖结构相差甚远，主要区别为人肾-GT的N-聚糖全部为复杂型，而牛肾-GT含10%高甘露糖型；人肾-GT含酸性聚糖仅31%，且均为C2,4C2三天线，而牛肾-GT含62%的酸性聚糖，除三天线外还有二天线和四天线；人肾-GT的天线外链有60%以上的GlcNAc与1，3Fuc相连，且有LN重复序列，而牛肾-GT没有外链Fuc和LN重复序列。同一物种的肾-GT的N-聚糖全部含有平分型GlcNAc，而其肝-GT则几乎完全没有平分型GlcNAc。,4.2.2
50、.5 糖链结构的微观不均一性（microheterogenity）,此外，同一个体同一组织中不同糖蛋白也表现出糖链结构的不均一性。例如同样在人肝中合成的-GT与运铁蛋白（Tf），-GT的N-聚糖约2/3为二天线，其余1/3为三天线和四天线，其中四天线聚糖约1/3含LN重复序列，而Tf超过95%都是不含LN重复序列的二天线N-聚糖。即使是同一蛋白，其中不同的N-糖基化位点所连接的N-聚糖结构也不尽相同。上述聚糖结构的这种不均一性又被称为糖形（glycoform）。图4.24出示大鼠胸腺细胞和脑中Thy-1糖蛋白3个位点上聚糖结构的变化。尽管肽链结构完全相同，但在这两种细胞中这3个糖基化点上的聚糖
