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1、15-1 概述,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。,第15章 高效液相色谱法,液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法,高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法,与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid
2、Chromatography，HPLC),又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLC)，也称现代液相色谱,15-1-1 高效液相色谱法,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快：通常分析一个样品在15 30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备,液相色谱的发展过程,液相色谱法的分离原理是
3、：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。,15-1-2 液相色谱分离原理,样品形态：液体 气体或液体(加热气化)流动相:液体(黏度大，102倍)气体(黏度小)输送压力：5-50MPa 0.1-0.5MPa固定相：粒度5-10m 粒度0.1-0.5 mm柱长:10-25cm 1-4m(填)10-100m(开)检测器：紫外 TCD 示差折光 FID 荧光 ECD 电化学 FPD应用范围：高沸点 低沸点 热不稳定（活性）永久性气体 强极性、大分子 裂解产物,15
4、-1-3 液相色谱与气相色谱的比较,高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统,15-2 高效液相色谱仪,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,输液系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,进样阀,进样系统,由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成,15-2-1 高压输液系统,(2)高压输液泵：主要部件之一，压力：550M Paa.为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），要使液体的流动相通过，将施加很大的驱动力b.应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(1)贮液器：提供流动相，脱气，耐压，溶剂装入前要过滤,色谱输液系统内部结构,压力传感器,清洗瓶一
5、般为50甲醇，每周更换一次,清洗阀,比例阀,进口单向阀,出口单向阀,泵,往复柱塞泵结构示意图,往复柱塞泵结构示意图,往复柱塞泵结构示意图,往复柱塞泵结构示意图,(3)梯度淋洗装置,外梯度:将不同极性的溶剂在常温常压下按一定的比例送入梯度混合室，利用一台高压输液泵，泵压进入色谱柱,内梯度:将两种或多种不同极性的溶剂分别增压后，按设定的程序，注入混合室混合，再进入色谱柱,A:绿原酸 B:芦丁,P680A LPG流路图,低压四元梯度泵（只有一个泵，四个通道，溶液泵前混合）需配在线脱气机，因为容易形成气泡,15-2-2 进样系统-手动及自动进样,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，
6、其结构如图所示：,Load状态 Inject状态,样品盘,机械手,自动进样,15-2-3 分离系统-高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm目前已采用小粒度的填料和柱径以提高柱效,应用最广，对大部分有机化合物有响应特点：.灵敏度高、线性范围广；.对流动相的流速和温度变化不敏感；.波长可选，易于操作；.可用于梯度洗脱,1.紫外检测器,15-2-4 检测系统,2.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，检测各特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示,可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值,差值与浓度呈正比,
7、通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）,3.示差折光检测器,示差折光检测器光路图,安培检测器,4.电化学检测器,柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化、还原反应，电极间有电流产生，电流大小与流出物浓度成比例，主要用于检测具有电化学活性的物质,其它电化学检测器：电导、伏安检测器,15-3 液相色谱的分类,液固色谱,液液色谱,离子交换色谱,排阻色谱,化学键合相色谱,反相色谱：非极性键合固定相，ODS,正相色谱：极性键合固定相，CN基或NH2基键合相,15-3-1 液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
8、 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与脱附 适用于分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾,15-3-2 液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，现较少采用 流动相：极性或非极性溶剂均可,分配色谱法使用的固定液,15-3-3 离子交换色谱,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子
9、交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长 阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可解离的化合物，氨基酸、核酸等,15-3-4 排阻色谱色谱,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布),原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰 全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,15-3-5 化学键合相色谱,化学键合固定相：（将各种不同基团通过化
10、学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C-18柱（反相柱）流动相的极性小于固定液的极性，称为正相 色谱（normal phase）流动相的极性大于固定液的极性，称为反相 色谱（reverse phase）,根据化学键合相与流动相极性的相对强度，分为正相与反相色谱,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相 a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐
11、有机溶剂，稳定（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性（5）有利于梯度洗脱,R：-C4,-C8,-C18-C6H5,-CN,-NH2-SO3H,-COOH,-NR4Cl-,化学键合固定相上键合的基团R有:,HPLC的应用,1.环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：示差折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质,固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱
12、温：50 C 柱 压：7.0 105 Pa 检测器：紫外检测器,芴、苊、菲三混合,美国标准局16组分PAH混合物标样,已知峰9为苯并a蒽和屈，峰14为苯并芘和二苯并蒽的二组分重叠峰,氨基酸分析,HPLC含量测定应用实例,A B C A.绿原酸对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.绿原酸测定方法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10uL，按上述色谱条件测定，记录绿原酸的峰面积，并按外标法计算绿原酸的含量。结果：绿原酸峰面积供试品为：30.1562，对照品为：28.6288,HPLC与UPLC（Ultra performance liquid chromatography),固定相粒径改变引起
13、的范氏曲线的改变,which shows a separation of eight diuretics in under 1.6 minutes.The same separation on a 2.1 by 100mm 5m C18 HPLC column yields almost identical resolution,but takes ten minutes.,Figure 5 shows a peptide map where the desired goal is to maximise the number of peaks.In this application,the
14、increased peak capacity(number of peaks resolved per unit time)of UPLC dramatically improves the quality of the data,resulting in a more definitive map.,15-9 高效毛细管电泳（CE),高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一、采用了50-75m内径的毛细管 二、采用了高达数万伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子
15、可以达到数百万。,电泳：带电粒子或离子在电场的作用下作定向移动毛细管电泳：电泳在充满缓冲溶液的细内径毛细管中进行,15-9-1 基本原理,1.仪器流程与主要部件电压：030kV；分离柱不涂敷任何固定液紫外或激光诱导荧光检测器可检测到：10-1910-21 molL-1,2.毛细管柱（1）材料：石英，涂敷聚酰亚胺，具柔性（2）规格：内径5075m，外径350400m；长度1m,3.分离过程,电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象和电渗现象,带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和 阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出 阴离子：两种
16、效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,电渗：由于外加电场对管壁溶液双电层的作用而产生的溶液的整体流动。,4.高效毛细管电泳的特点,仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、缓冲溶液瓶（电极瓶）分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数操作方便、运耗费低 进样量极少，在水介质中进行应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等,15-9-2 分离模式,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和 阳离子：两种效应的运动方向
17、一致，在负极最先流出 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出,阴离子：最后流出同种类离子由于荷质比的不同而被分离最基本、应用最广的分离模式,1.毛细管区带电泳CZE,（1）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束,2.胶束电动毛细管色谱（MECC、MEKC）,在电场力的作用下，胶束在柱中移动,（2）电泳和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动,（3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间晚（4）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围,在毛细管壁上键合或涂渍高效液
18、相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程 目前电色谱采用填充柱、开管柱、整体柱等,3.毛细管电色谱 CEC,一、离子分析 1.阳离子分析,离子迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24多种金属离子阳极进样，阴极检测,15-9-2 分离分析实例,2.阴离子分析,加入电渗流改性剂，如：十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子阴极进样，阳极检测,二、药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段 采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物,采用MEKC
19、模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLC法,三、手性化合物分析,HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高分离效率 常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,四、氨基酸与蛋白质分析,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸HPCE可取代传统的氨基酸分析仪,蛋白质分析,五、核酸分析及DNA排序,重要分析手段如图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离,进展,1.微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.联用仪器 CE-MS3.阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支,
