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1、,第十五章 免疫学应用,教学目的：掌握：基于抗原抗体反应的检测方法；免疫细胞的检测方法；人工（自然）主动免疫、人工（自然）被动免疫的概念。理解：基于抗原-抗体反应的特点及影响因素；免疫分子的检测原理；免疫细胞的检测方法与原理；以抗体、细胞和细胞因子为基础的免疫治疗了解：免疫分子的检测原理；免疫学诊断的原理、常用的免疫功能检测指标；免疫治疗制剂的类型和作用机制,教学重点：基于抗原抗体反应的检测方法及原理；人工（自然）主动免疫、人工（自然）被动免疫的概念。教学难点：抗原-抗体反应的特点及影响因素。,使用教材：医学免疫学（第二版），龚非力主编，科学出版社，2007年。参考教材：医学免疫学（第五版），
2、金伯泉主编，人民卫生出版社，2008年；/,主要内容,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法第二节免疫细胞的检测第三节免疫分子的检测第四节 免疫学预防,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法,抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction)应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。,（一）特异性和交叉反应 特异性：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。,一、抗原-抗体
3、反应的特点,交叉反应（cross reaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。,结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多价。单体形式的抗体分子有两个Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为两价。前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩,（二）抗原-抗体结合的带现象与可见性,前带现象（prozone）和后带现象(postzone)Ab过剩和Ag过剩,比例合适：若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个Fab段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合
4、体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。,抗原-抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但可逆。在一定条件下（如低pH、高浓度盐、冻融等），抗原-抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。,（三）可逆性,（一）电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。,二、抗原-抗体反应的影响因素,（二）酸碱度 抗
5、原抗体反应的最适pH是6-8。（三）温度最适温度为37。有些例外，如冷凝集素在 4左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。,（四）抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。,抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力,亲和力(affinity),一个抗体分子与整个抗原分子间的结合强度,亲合力(avidity),根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术,三、Ag-Ab反应的基本检测方法,颗粒性抗原（细菌或细
6、胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应(agglutination)。,（一）凝集反应（Agglutination Tests）,1直接凝集（direct agglutination)：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。2间接凝集（indirect or passive agglutination)：检测针对可溶性Ag的Ab3间接凝集抑制试验(direct agglutination inhibition test)4.协同凝集试验（co-agglutination test）,1直接凝集,Applications Blood typi
7、ng（血型测定）Bacterial infections（细菌性感染）,Practical considerations Easy（简便）Semi-quantitative（半定量）,2、间接凝集,Definition-agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particle,ApplicationsMeasurement of antibodies to soluble antigens,3、间接凝集抑制试验,应用：可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其 灵敏度高于一般间接凝集试验。,各种凝集反应示意图,Ag
8、-Ab反应的基本检测方法（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术,Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。,（二）沉淀反应（Precipitation Tests）,1单向免疫扩散(single immunodiffusion)2双向免疫扩散(double immunodiffusion)3免疫电泳(immunoelectrophoresis)4免
9、疫比浊(immunonephelometry),（二）沉淀反应,单向免疫扩散(single immunodiffusion),双向免疫扩散(double immunodiffusion),单扩与双扩原理,Ag-Ab反应的基本检测方法（一）凝集反应（二）沉淀反应（三）补体参加的反应（四）免疫标记技术,用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。,（四）免疫标记技术（Immunolabelling technique）,此法乃用
10、荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。,1免疫荧光法(immunofluorescence,IF),（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。,免疫荧光法分类,免疫荧光法图示,Mouse kidney section,Laminin-green-fluorescent Q
11、dot 565 IgG CD31-red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei-blue-fluorescent Hoechst 33342,Control,TSLP,TSLP-AlexaFluor 488 Nuclei-propidium iodide,HASMC,此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）,酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA),常用
12、的方法如下：（1）酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)（2）免疫细胞或组织化学（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC),1）ELISA是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。,双抗体夹心法：用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。间接法
13、：用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。,ELISA分类,间接法图示,ELISA反应过程,动画演示,2)酶联免疫斑点试验(ELISPOT),生物素（biotin）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。亲和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由4个亚单位组成。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。,3）BAS（biotin avidin system)-ELISA：,BAS-ELISA,应用酶标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组
14、织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。,4）免疫细胞或免疫组化技术,ICC,IHC,乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgE等。,3放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA),化学发光免疫分析,将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原
15、含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。,该法又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。,免疫印迹法(immunoblotting),免疫印迹法,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法第二节免疫细胞的检测第三节免疫分子的检测第四节 免疫学预防,一、淋巴细胞及亚群的分离,外周血单个核细胞(PBMC)的分离：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴细胞分离液）密度梯度离心法,淋巴细胞亚群的分离 淋巴细胞为不均一的群体，可
16、借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。1尼龙棉分离法 2E花环分离法 3洗淘法 4流式细胞术(flow cytometry，FCM)5磁珠分离技术,E花环实验,磁珠分选,Removal of T cells from marrow graft,二、免疫细胞功能的测定 1.T细胞功能测定：(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、Con A和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；,淋巴细胞增殖实验,(2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL,(1)B细胞增殖(转化)试验(2)溶血空斑形成试验(3)酶联免疫斑点法(ELISPOT)
17、:,2.B细胞功能判定,溶血空斑实验,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法第二节免疫细胞的检测第三节免疫分子的检测第四节 免疫学预防,在体外用已知抗原检测相应抗体：见前述 用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定：检测血清含量高的IgG、IgA和IgM时，可用免疫比浊法；检测IgD和IgE选用ELISA、RIA等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法。,一、免疫球蛋白的测定,了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助ELISA、RIA等方法。血清总补体活性测定常采
18、用50%补体溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果。,二、补体测定,（一）免疫学测定法以细胞因子作为抗原，用相应抗体进行定量或半定量检测。对于分泌性细胞因子，常用方法为双抗体夹心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印迹法等方法检测。对于胞内细胞因子，采用FCM免疫荧光技术检测,三、细胞因子（CKs）检测,（二）生物活性测定法根据细胞因子特定的生物学活性，借助相应指示系统，如选用各种依赖性细胞株或靶细胞，同时与标准品对照测定，从而得知样品中细胞因子活性水平
19、，一般以活性单位（U/ml）表示。（三）分子生物学测定法具体方法为聚合酶链反应（PCR）、实时定量PCR等。,第一节基于Ag-Ab反应的检测方法第二节免疫细胞的检测第三节免疫分子的检测第四节 免疫学预防,一、免疫学预防,免疫学预防（immunoprophylaxis）是指通过人工刺激机体产生或直接输入免疫活性物质，从而特异性清除致病因子，达到预防疾病的目的。,免疫包括：先天免疫：生物体在长期种系发育和进化中逐渐形成的一系列防卫机制。特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。,特异性免疫获得方式有两种：1、自然免疫（natural immunization),自然主动免疫：
20、指机体受到各种病原体隐性或显性感染后主动产生的特异性免疫。自然被动免疫：指机体经胎盘或初乳被动获得的特异性免疫。,2、人工免疫（artificial immunization）即免疫学预防，指采用人工方法，将疫苗、类毒素或含特异性抗体和细胞的免疫制剂接种于人体，以增强宿主的抗病能力。人工主动免疫人工被动免疫,人工主动免疫(artificial active immunization)：指给机体接种抗原性物质如疫苗、类毒素等，刺激机体免疫系统产生特异性免疫力的方法。人工被动免疫(artificial passive immunization)：指给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂,
21、使受者迅速获得特异性免疫力的方法。,人工自动免疫与人工被动免疫的比较,人工主动免疫的接种物,疫苗（Vaccine）：细菌，病毒，螺旋体，立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。理想疫苗的标准：安全；有效；实用,分类：1、死疫苗（death vaccine）:选用免疫原性强的微生物标准株经大量培养后，用物理或化学方法将其杀死或灭活而制成的预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。优点：主要诱导特异性抗体产生，安全 缺点：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反应严重,2、减毒活疫苗（live-attenuated Vaccine）用人工定向变异或从自然界筛选得到的毒力高度减弱或基本无毒的
22、病原微生物制成的预防制剂。优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态下的轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。缺点：不易保存，存在回复突变的危险如卡介苗，牛痘，麻疹等,死疫苗与活疫苗的区别,3、类毒素（Toxid）细菌外毒素经0.3-0.4%甲醛处理，使其毒性减弱而保留其免疫原性。白百破：白喉类毒素+百日咳杆菌死疫苗+破伤风类毒素4、新型疫苗 亚单位疫苗（Subunit Vaccine）结合疫苗 合成肽疫苗 基因工程疫苗,人工被动免疫的接种物,1、抗毒素（antitoxin）是用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素毒性的作用。使用时注意超敏反应。2、人免疫球蛋白：胎盘
23、球蛋白和血浆丙种球蛋白分别由健康产妇胎盘血和正常人血浆中提取的丙种球蛋白制成的生物制品：IgG和IgM3、激活的淋巴细胞：TIL和LAK等,预防接种的禁忌症：1、免疫功能缺陷2、高热，严重心脏病，肝肾病，甲亢等3、妊娠期及月经期4、湿疹及其他严重皮肤病。,本章小结,1、掌握凝集反应和沉淀反应的概念2、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称3、掌握人工主动免疫和人工被动免疫的概念4、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的 应用,思考题,1.你认为抗原-抗体发生结合的分子基础是什么？2.你认为哪些因素可能影响抗原-抗体反应？哪些情况下我们可以肉眼见到抗原-抗体反应？3.抗原-抗体反应结合稳定吗？是共价结合，还是非共价结合？抗原-抗体的反应一定是专一的吗？4.基于抗原抗体反应的检测有什么用途？,
