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1、临床寄生虫学和寄生虫学检验 Clinical parasitologyAnd laboratory,免疫学诊断技术,分子生物学诊断技术,寄生虫感染的免疫学及分子生物学诊断技术,免疫学诊断技术,环卵沉淀试验,基本原理,常用方法,方法评价适用范围,免疫酶染色试验,染色试验,环蚴沉淀试验,间接血凝试验,间接荧光抗体试验,常规ELISA,斑点酶联免疫吸附试验,金黄色葡萄球菌A蛋白ELISA,生物素-亲和素系统ELISA,酶标记抗原对流免疫电泳,酶联免疫印迹技术,酶联免疫吸附试验,寄生虫感染的免疫学及分子生物学诊断技术,免疫学诊断技术现有的多种免疫学检测技术均已被应用于寄生虫病的临床诊断或流行病学研究。
2、本章仅介绍几种寄生虫病诊断特有的免疫检测技术,环卵沉淀试验,环卵沉淀试验(circumoval Precipitin test,COPT)由OliverGonzalez(1954)最早用于曼氏血吸虫病的诊断,获得了较好的结果,阳性率达100,假阳性率为8.3。国内亦于1958年开始应用该法诊断日本血吸虫病,取得了满意效果。目前COPT仍是国内诊断血吸虫病最常用的方法之一,基本原理:环卵沉淀试验为抗原机体反应的一种类型,属免疫沉淀反应。当成熟血吸虫卵内毛蚴的分泌、排泄物抗原经卵壳微孔透出壳外与血吸虫病患者血清中相应抗体结合后,在虫卵周围形成具有一定折光性的特异性的泡状、指状、带状或片状沉淀物,即
3、为阳性反应,环卵沉淀试验基本原理,免疫沉淀物的形成取决于虫卵内分泌、排出物透过卵壳微孔的量,以及血吸虫病人血清中特异性抗体水平。在正常人血清中,因无相应的抗体存在,故虫卵周围不出现特异性沉淀物,即为阴性,环卵沉淀试验基本原理,常规COPT需用熔化的石蜡划蜡线、密封盖片,操作步骤繁琐,不易于标准化,因此现有了许多改进方法,例如:塑料管法COPT:是应用聚乙烯塑料管(2mm)采集血样,分离血清,并在管内加入干卵孵育。该法操作简单、适于现场应用,但在大规模查病时难于达到标准化和操作规范化的要求。本法也具有很高的敏感性和特异性,环卵沉淀试验常用方法,双面胶纸条法环卵沉淀试验(DGSCOPT),是将双面
4、胶纸条制成特定的式样作COPT,省却常规法划蜡线、蜡封片等繁琐步骤,操作简单较规范,适于现场及临床使用。但该法仍需实验者临时加入虫卵，使其难于达到标准化,PVF抗原片法:以PVF膜为载体,将于卵用5棉胶液粘附剂预置其上,试验时加入待检者血清即可,操作方法极其简便易行,且抗原片便于携带、邮寄、还可保存实验结果。由固定的实验人员统一滴加虫卵,使卵数较一致,易达标准化,适于现场应用。血凝板法:将血清及干卵加入血凝板孔中省却了划蜡线的步骤。,PVF抗原片法及血凝板法环卵沉淀试验,组织内环卵沉淀反应,又称卵内沉淀反应(Intraoval precipitin reaction,IOP),是以血吸虫病鼠肝
5、组织制成的石蜡切片为抗原与受检者血清作用后,如在虫卵内、卵黄膜与毛蚴之间或在毛蚴的表面出现泡状、指状或条带状有明显折光性的沉淀物即为阳性,其敏感性和特异性同常规法COPT试验无显著性差异,是环卵沉淀反应结合酶免疫测定技术的一种改进方法,其基本原理是先在酶标反应板中进行环卵沉淀试验,洗去待检血清后加入酶标记的羊抗人IgG孵育,经洗涤后加入联苯胺底物显色。如虫卵周围及虫卵内有棕色沉淀物即为阳性,反之则为阴性。该法具有高度的敏感性,特异性可达100,平均环沉率显著高于常规COPT试验法,且总试验时间可缩短24小时出结果,酶联环卵沉淀反应(enzymelinked COPT,FLCOPT),环卵沉淀试
6、验方法评价,COPT为血吸虫病所特有的免疫学诊断方法,具有较高的敏感性(94.198.6)和特异性(1.93.6)。主要用于：作为血吸虫病的辅助诊断及病原治疗的依据,对无血吸虫病史人群和距末次治疗3年以上的血吸虫病病人,若环沉率在3或3以上者,可结合临床表现给予治疗,目前多将此治疗标准降至1的环沉率,作为血吸虫病血清流行病学调查及疫情监测的方法,在血吸虫病流行区,COPT环沉率的消长情况,能反映感染人群血清特异性抗体水平的动态变化,用以了解疫情趋势,特别在达到传播控制和传播阴转标准的监测地区,可用作监测的方法之一考核防治效果,经有效药物(吡喹酮)治疗后1年病人COPT阴转率达 27.1,治后2
7、年阴转率40以上,治后4年病人血清COPT的阴转率80以上适用范围 加吸虫病的辅助诊断、疗效考核、流行病学调查及疫情监测,环卵沉淀试验方法评价,免疫酶技术主要是利用免疫反应的高度特异性和酶促反应高效性的特点,在保持抗原抗体免疫活性和酶的催化活性的基础上,将酶标记于抗原或抗体之上,使特异性免疫反应同酶促反应相结合,从而使测定方法达到高度特异性和敏感性。免疫酶染色试验(immunoenzvmaticstaining test,IEST)是免疫酶检测技术的一种。Kamiya等(1981)最早以组织内虫卵石蜡切片为抗原作IEST试验诊断日本血吸虫病,国内首先用微丝蚴固相抗原作IEST诊断丝虫病均取得满
8、意结果,免疫酶染色试验,IEST是以寄生虫各个生活史时期(如成虫、幼虫、虫卵或原虫滋养体等)制成的切片或涂片作为固相抗原,与待测标本中相应抗体特异性结合后,再与酶(辣根过氧化物酶HRP)标记的第二抗体反应形成酶标记的免疫复合物,加入相应底物(二氨基联苯胺,DAB)后酶催化底物即出现显色反应,用光学显微镜观察即可判断结果。如无特异性抗体即不能形成酶标记免疫复合物,加入底物后,因无酶的催化作用,而不能产生颜色反应,则为阴性,免疫酶染色试验基本原理,IEST用于诊断日本血吸虫病时,以肝组织内虫卵肉芽肿切片作固相抗原的诊断效果优于成虫切片抗原,而虫卵切片抗原则以冰冻切片抗原优于石蜡切片抗原以肝组织虫卵
9、冰冻切片作IEST四次对比检测血吸虫病人的阳性符合率达 87.3-99,假阳性率1.3-5.2,仅同姜片虫病和肺吸虫病各有4的交叉反应,病人治愈后3-10年的阴转率达70.8-93.7表明该法诊断血吸虫病具有较高的敏感性、特异性和重现性,并有一定的疗效考核价值,免疫酶染色试验方法评价,以马来丝虫成虫冰冻切片作IEST检测班氏微丝蚴血症者阳性率达91.294.3,健康人假阳性率为2.64.4,且可用牛腹腔丝虫成虫切片抗原代替人丝虫作IEST亦取得相似的诊断效果以华枝睾吸虫成虫切片抗原作IEST诊断华支睾吸虫病亦具有较高的敏感性和特异性IEST用于寄生虫病的诊断具有敏感性高、特异性强、重现性及稳定
10、性好的特点,且该法抗原用量少、简便易行,抗原片置20以下可长期保存,光学显微镜观察结果,免疫酶染色试验方法评价,结果判定不必立即进行,可保存集中检查,并可保留结果以利复查。但该法所用抗原及操作方法尚需标准化。在实际应用中,冰冻切片抗原优于石蜡切片,但需注意冰冻切片在试验洗涤过程中易于脱片等问题适用范围:用于血吸虫病、丝虫病、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、肺吸虫病、旋毛虫病、弓形虫病等的实验室诊断及流行病学调查,免疫酶染色试验方法评价,染色试验,染色试验(dye test,DT)由Sabin和 Feldman(1948年)创用,为弓形虫病独特的免疫学诊断方法基本原理:新鲜活弓形虫滋养体胞质对碱性美蓝染剂
11、具有很强的亲和力,能被其染成蓝色。但当弓形虫受特异性抗体和辅助因子(accessory factor,AF)协同作用后,细胞变性。胞膜破裂、胞质外溢,虫体则不能着色。AF为正常人血清成份,其中含有补体、备解素和Mg2等,AF不耐热,故应在采血后立即分离血清进行筛选,20保存备用,将经560C30min灭活的待检血清同滋养体及辅助因子作用后加碱性美蓝染液染色后,如有50或以上虫体不着色者,即可判为阳性。可使50虫体不着色的血清稀释度即为血清阳性液度,染色试验原理,该法敏感性高、特异性强,具有早期诊断价值,一般在感染弓形虫后810天,人血清中即出现抗弓形虫膜抗原的抗体,DT试验即出现阳性反应血清阳
12、性滴度1:8判为隐性感染,1:256的为活动性感染,1:1024为急性感染DT试验除肉孢子虫外与其它寄生虫无交叉反应。但该法所用辅助因子需从健康人血清中分离,并进行筛选试验,符合要求方可使用,且效能难于一致新鲜活虫体作抗原有一定的实验室感染危险性,故限制了该法的推广及一般实验室和现场应用 适用范围:弓形虫病的辅助诊断,染色试验方法评价,基本原理环蚴沉淀试验(circumlarval precipitin test,CPT)为旋毛虫病特有的血清学试验。将分离的旋毛虫幼虫与旋毛虫病患者血清在体外共同孵育后,幼虫分泌、排泄物(即抗原)与特异性抗体结合,在幼虫体表,特别是口及肛门部出现具有折光性的团块
13、状或泡状沉淀物,即为阳性,环蚴沉淀试验,本法具有较高的敏感性和特异性,同旋毛虫病人的阳性符合率达 97.6100,特异性达100与蛔虫病、钩虫病、丝虫病、鞭虫病等无交叉反应。感染后3周或症状出现后1020天呈阳性反应由于该法活幼虫抗原材料分离较繁琐,供应及保存都有困难,且实验者有感染的危险,故限制了它的推广应用用冻干幼虫和干燥幼虫进行实验,效果满意,该法操作简单,无需特殊仪器设备,适于基层应用适用范围:用于旋毛虫病的辅助诊断,环蚴沉淀试验方法评价,间接血凝试验,间接红细胞凝集试验(indirect haema-gglutination test，IHA)简称间接血凝试验,本试验操作简便快速、器
14、材简单、具有较高的敏感性和一定的特异性。国外普遍用于流行病学调查和实验室常规检查。主要的局限性在于抗原致敏血细胞的批间差异悬殊,以致结果不稳定,重复性欠佳近年来由于抗原纯化技术和冰冻干燥技术等的发展,在致敏血细胞的制备和保存方面有了新的进展,冻干的致敏血细胞逐步向商品化方向发展,不仅方便现场使用并为血凝试验的标准化提供了条件,间接血凝试验基本原理,以人O型红细胞或绵羊红细胞为载体,经特殊处理后吸附上特异性抗原,此结合有抗原的红细胞叫做致敏红细胞,在遇到相应的抗体后发生特异性结合,致使红细胞发生交联而凝集成肉眼可见的团块,即为阳性无特异性抗体存在则红细胞不发生凝集而均匀地沉积于板底，是为阴性,将
15、特异性抗体吸附于红细胞表面,制备致敏红细胞来检测特异性抗原则称之为反向间接血凝试验(reverse indirect haemagglutination test)用已知抗原或抗体预先与待测标本作用,以中和相应的抗体或抗原,再加入相应的致敏红细胞,由于与致敏红细胞相应的抗原或抗体已被中和,无法交联以致红细胞不能发生凝集,即为阳性,此称为间接血凝抑制试验(indirect haemagglutination inhibition test),间接血凝试验基本原理,间接血凝试验方法简单,取材方便,以红细胞为载体,大小均匀,性能稳定,可用人的“O”型红细胞或绵羊红细胞,红色起到指示剂作用,便于肉眼观
16、察。肉眼判断结果,不需特殊仪器设备,且具有较高的敏感性和特异性诊断日本血吸虫病,阳性率达9298.7,非疫区正常人群的假阳性率02.5肝吸虫病检测阳性符合率达6898猪囊尾蚴病的诊断,阳性率为89.690,假阳性率1.510,间接血凝试验方法评价,对于弓形虫病的诊断与染色试验的阳性符合率为90左右;对疟疾的诊断效果不够稳定,原因之一是没有好的纯化的抗原。本法用于寄生虫病的普查过筛及流行病学调查,是一种极为简便、快速、实用的有效方法。不足之处是有发生非特异性凝集的现象,应注意鉴别和消除适用范围用于血吸虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、钩虫病、棘球蚴病、旋毛虫病、肺吸虫病、阿米巴病、疟疾的免疫学辅助诊
17、断和流行病学调查,间接血凝试验方法评价,间接荧光抗体试验,间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody test，IFA)是一种实用的免疫标记技术之一,它具有免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性基本原理 将荧光素如异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiacyanate,FITC)与抗免疫球蛋白抗体(如羊抗人IgG)结合制成荧光素标记第二抗体。当固相抗原与待测血清中的抗体特异结合后,再用该荧光素标记的第二抗体与之共同孵育,便可形成免疫荧光复合物,在荧光显微镜下可见黄绿色荧光,即为阳性。若无黄绿色荧光现象即为阴性,IFA操作简便,具有高度的特异性、敏感
18、性和重现性,可直接在细胞水平或亚细胞水平上检测、鉴定和定位抗原、抗体或免疫复合物、因而其应用极广,不仅用于疾病的免疫诊断,还用于组织细胞内特异性抗原的检查与定位,以及分子生物学研究中基因表达产物的检测和鉴定是诊断疟疾最常用的方法,敏感性高、特异性强,重现性好,抗原制备简便,全虫抗原性能稳定以裂殖体的抗原性最好,大滋养体次之,小滋养体最差。抗原片固定剂以多聚甲醛及福尔马林固定效果最好,荧光强度最大,丙酮及自然干燥次之,甲醇固定效果最差,间接荧光抗体试验方法评价,疟疾病人的阳性符合率达90以上,正常人假阳性率为l2,疟疾病人经治疗后36个月IFA检测滴度迅速下降,1年后阴转,固有疗效考核价值弓形虫
19、滋养体(速殖子)为抗原片作IFA诊断弓形虫病的效果与染色试验相似,敏感性低于ELISA和IEST法杜氏利什曼原虫前鞭毛体作抗原进行IFA检测黑热病患者血清抗体,阳性率达100,抗体滴度最低为1:320,最高可达1:5120,其它疾病和健康人的血清滴度很少超过1:20,但病人治愈后抗体的阴转率很低,治愈20年后的抗体阳性率仍高达28.9,对黑热病无疗效考核价值,间接荧光抗体试验方法评价,阿米巴肝脓肿:阳性检出率达95100,而对肠阿米巴病的检出率悬殊很大,从50到90不等,不宜作肠阿米巴病的辅助诊断血吸虫病的诊断:IFAT的敏感性与ELISA、IEST等相仿,但高于COPT法。本法的不足之处是需
20、要荧光显微镜,结果判断带有一定的主观性,且有非特异性荧光干扰,并有荧光衰减现象,结果不能久存,实验完毕必需立刻镜检适用范围:用于疟疾、弓形虫病、利什曼原虫病、卡氏肺孢子虫肺炎、蓝氏贾第鞭毛虫病、细粒棘球蚴病、丝虫病、华支睾吸虫病及血吸虫病的免疫学诊断,间接荧光抗体试验方法评价,酶联免疫吸附试验,酶联免疫吸附试验是一种免疫标记测定技术。系1971年创用，最初把抗体或抗原吸附于聚苯乙烯管壁上制成固相免疫吸附剂，用以测定抗原或抗体，为ELISA奠定了基础，后用塑料微孔板使ELISA技术迅速得到推广和应用。此项技术具有高度的敏感性和特异性，目前已广泛用于细菌学、病毒学、寄生虫学、内分泌学、免疫病理学、
21、血液学以及分子生物学和细胞生物学等领域，并已涌现出了许多改进的、派生的及综合的技术方法。,根据酶具有强大的催化活性和高度特异的特点,在不破坏酶活性和抗原抗体免疫学特性的前提下,通过化学交联或免疫学方法,将酶分子联结到抗体或抗原分子上,然后与特异性抗原或抗体反应,形成酶标记免疫复合物结合在免疫复合物上的酶在遇到其相应的底物时,催化其水解,产生氧化还原反应,生成肉眼可见的颜色变化,用微量比色计检测结果,或目视方法比较判断。由于酶降解底物的量与其呈现的色泽浓度成正比,故可间接反映被测抗原或抗体的量。因此,ELISA可以定性,还可定量检测抗原或抗体。ELISA的基本反应类型有三种,酶联免疫吸附试验常规
22、ELISA基本原理,间接法-包被抗原+待测抗体+酶标记抗球蛋白抗体,底物显色,即AgAbAb2酶+底物,检测抗体夹心法-包被单克隆抗体(McAb)+待测抗原(Ag)+特异性抗体(Ab1)+酶标抗球蛋白抗体(Ab-酶),双抗体捕获抗原检测抗原法竞争抑制法-小分子抗原或半抗原检测,将特异性抗体吸附于酶标板上,酶标记抗原与待测抗原混合后再加入反应板中孵育,经洗涤加入底物进行显色反应。待测抗原与酶标记抗原以均等的机会竞争结合固相抗体。因此,显色深浅与结合到固相抗体上的酶标记抗原量成正比,则与待测抗原的量成反比。同样,也可包被抗原,将酶标抗体与待测抗原同时加到酶标反应中,固相抗原同待测抗原竟争结合酶标抗
23、体,经洗涤后,待测抗原-酶标抗体复合物及未结合酶标抗体被洗脱。因此,酶标显色反应深浅与待测抗原的浓度成反比,酶联免疫吸附试验原理,方法评价:ELISA是免疫学试验中应用最普遍、适用范围最广的一种免疫酶标记检测技术，已广泛用于多种寄生虫感染的免疫诊断、血清流行病学调查、寄生虫病的疗效考核及防治效果的监测。检测的标本也多种多样,可以是待检者血清、积液(如胸腔积液)、脑脊液、乳汁、尿液、唾液检测内容可为抗体、抗原或免疫复合物。该检测技术已实现试剂标准化、操作规范化和自动化,适于批量样本的检测。最常用的反应类型是间接法和双抗体夹心法适用范围:该法用于血吸虫病、疟疾、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、
24、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、姜片虫病、利什曼原虫病等免疫诊断,酶联免疫吸附试验方法与适用范围,参照核酸研究中的斑点杂交法结合ELISA试验改良而成。以硝酸纤维素(NC)薄膜为载体,这种多孔膜可作为多种颗粒性抗原及可溶性抗原固相载体,在单克隆抗体鉴定中应用较多,此法敏感性很高,检测鼠免疫球蛋白可达微微克(ng)级水平基本原理:ELISA基本相似,只是以硝酸纤维素薄膜为固相载体代替酶标反应板以吸附抗原或抗体,用酶催化作用后可形成不溶性有色沉淀的底物(如DAB)代替邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)等底物。结果以能在NC膜上呈现有色斑点,而阴性对照无色者为阳性反应。本法可吸附抗原以检测特异性抗体,
25、也可吸附特异性抗体(如单克隆抗体,McAb)夹心法检测特异性抗原,斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)Hawkes,方法评价:DotELISA法是预先将抗原或抗体点涂于 NC膜上,便于保存和携带,操作简便、反应快速、肉眼判断结果、直观且可保留结果以利复查,适于现场应用。研究资料表明,该法对丝虫病、弓形虫病、疟疾等的诊断都有很高的敏感性和特异性适用范围:本法用于血吸虫病、疟疾、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、利什曼原虫病等免疫诊断,斑点酶联免疫吸附试验方法评价及适用范围,基本原理:金黄色葡萄球菌细胞壁A蛋白(SPA)能和人及多种哺乳动物的IgG的FC端结合,可以此
26、取代第二抗体制成酶标记A蛋白,用于抗体或抗原的检测。基本原理、操作及结果判定同常规ELISA法方法评价:仅以酶标SPA代替酶标第二抗体作为酶结合物,该法的突出优点是受检的IgG无动物种、属的限制,适用范围广、试剂稳定可靠,适于多种寄生虫病的实验室诊断和现场流行病学调查。适用范围:用于血吸虫病、肺吸虫病、姜片虫病、棘球蚴病、猪囊尾蚴病、疟疾、弓形虫病等的辅助诊断,金黄色葡萄球菌A蛋白ELISA(SPAELISA),基本原理:生物素(biotin)与亲和素(avidin)具有极强的亲和力且亲和素为四价分子,即一个亲和素分子可以和四个生物素分子结合,所形成的复合物非常稳定。生物素可偶联蛋白质和核酸,
27、已不影响原有的生物学活性。首先制备酶标记生物素、生物素偶联抗免疫球蛋白抗体,即生物素化第二抗体(Ab2-B),再按一定比例将亲和素和酶标生物素混合孵育,形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin-perokidase complex,ABC),使亲和素结合位点过剩,生物素-亲和素系统ELISA(ABC-ELISA),尚未饱和的结合位点与第二抗体上的生物素结合,借助第二抗体与抗原-抗体复合物桥联,从而形成Ag-Ab-(Ab2B)-ABC复合物,遇相应底物呈现颜色反应。也可包被抗体(多为单克隆抗体,McAb),加待测抗原,与生物素化抗体(针对待测抗原的多抗)再加ABC,如有特
28、异性抗原存在即可形成McAb-Ag-(Ab-B)-ABC复合物,催化底物呈现有色反应,生物素-亲和素系统ELISA(ABC-ELISA),方法评价:该法由于ABC的引入增加了免疫反应系统中酶分子的数量，提高了ELISA反应的敏感性。加上该法抗原抗体的特异性及方法的稳定性和重现性好。使该法广泛用于寄生虫病的诊断和流行病调查中。但过高的敏感性有时会出现假阳性反应适用范围:用于血吸虫病、疟疾、丝虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、棘球蚴病、猪囊尾蚴病等的辅助诊断,生物素-亲和素系统方法评价及适用范围,基本原理:酶标记抗原对流免疫电泳(enzyme-linked antigen counter-immuno
29、elec-trophoresis,ELACIE)是免疫酶技术与对流免疫电泳技术相结合的一种免疫检测方法,将酶标记抗原和待测抗体置相对应的琼脂板孔中,在电场力的作用下,两者相向运动,相遇后形成酶标抗原-抗体复合物,加入相应底物后出现颜色反应,目测判读结果,或用扫描仪记录分析结果。,酶标记抗原对流免疫电泳,酶标记抗原对流免疫电泳,该法使肉眼不能鉴别的微细沉淀线经酶促反应呈现肉眼可见的有色沉淀,提高了对流免疫电泳的敏感性评价与应用:由于该法需要一系列的电泳装置，操作尚需规范化、试剂亦需标准化，而限制了该法的应用。该技术可用于血吸虫病的辅助诊断,酶联免疫印迹(enzyme-linked immunob
30、lotting technique,ELIB)又称Western blot，是由十一烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate Polyacrylaide gel electro-phoresis，SDS-PAGE)、蛋白质转移电泳及酶联免疫吸附试验(ELISA)结合而成的一种酶标免疫检测技术。它既具有SDS-PAGE对蛋白质的高分辨力,又具有免疫酶检测技术的高度敏感性和抗原抗体反应的高特异性,酶联免疫印迹技术,将可溶性抗原蛋白经SDS-PAGE按抗原蛋白分子大小分离出若干条带,再将蛋白分子电转印至硝酸纤维素(NC)膜上,印有抗原分子的NC膜切成条状,置反应槽中
31、,加待测血清及酶标抗体结合物等,即按Dot-ELISA试验方法进行抗原蛋白分子是一种典型的两性电解质,在不同的PH值溶液中带有不同的电荷,而SDS则可消除蛋白分子的天然电荷,使它们都带上相同的负电荷,并在加热及巯基乙醇等的作用下变成线性蛋白分子;聚丙烯酰胺凝胶则起到分子筛作用,在电场力的作用下,蛋白分子向阳极泳动继而按分子量大小依次排列,酶联免疫印迹技术基本原理,方法评价:ELIB是一种达分子水平的免疫检测技术,用于分析和纯化寄生虫抗原,鉴定其生物学和免疫学特性,还可用于寄生虫病的免疫诊断和预防,通过检查患者血清抗体或抗原谱的特征及其动态变化达到诊断疾病和监测流行趋势的目的,也可寻找特异的蛋白
32、分子作疫苗抗原进行免疫预防。该法敏感性高、特异性强,根据反应条带的不同可区分寄生虫感染期,酶联免疫印迹技术方法评价,日本血吸虫感染早期(26周)的血清同成虫抗原的17kDa38kDa蛋白抗原呈现阳性反应,慢性血吸虫病人血清抗体同成虫抗原中53kDa64kDa蛋白抗原呈现阳性反应等用血吸虫成虫31/32kDa蛋白抗原诊断血吸虫病同粪检阳性的符合率高达100,与其它寄生虫病无交叉反应,对经治疗的病人血清阴转迅速,酶联免疫印迹技术方法评价,但该法操作繁琐,不利于现场及一般实验室应用;如能将寄生虫特异性诊断抗原经SDS-PAGE及电转印技术预置于NC膜上或制成ELIB诊断试剂盒批量供应现场,则可大大提
33、高ELIB的应用范围和价值适用范围:血吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、丝虫病、肠外阿米巴病、疟疾、弓形虫病等的免疫诊断。,酶联免疫印迹技术方法评价适用范围,免疫学常用的方法,荧 光 显 微 镜,免疫酶染色试验,分子生物学诊断技术,分子生物学诊断技术,聚合酶链反应,基本PCR技术,反转录PCR,锚式PCR,差异显示PCR,免疫PCR,PCR-ELISA,生物芯片技术,基因芯片,蛋白质芯片,缩微芯片,生物芯片技术的发展,分子生物学诊断技术,聚合酶链反应聚合酶链反应(polmperase chain reaction,PCR)是分子生物学技术中发展最快、普及最迅速、应用最广泛的新技术之一。自二十世纪80
34、年代中期问世以来,以其强大的生命力,在生命科学领域掀起了一场巨大变革,这项技术已深入到生命科学领域的各个学科之中,从生物基因的克隆、修饰、cDNA文库的构建,遗传病、传染病、寄生虫病的诊断,到法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病调查等,无不应用PCR技术而且不断衍生出新的技术方法反转录-PCR(RT-PCR),是以mRNA为模板检测特异性mRNA或获得其cDNA克隆的方法,分子生物学诊断技术,锚式PCR(anchored PCR)是已知mRNA部分序列时对mRNA进行分析的方法差异显示PCR(differential dsplay PCR,DDPCR),可用以鉴定和显示不同条件下相同组织
35、细胞基因表达的差异免疫PCR是将PCR的扩增技术用于免疫学检测之中PCRELISA则是用免疫学检测技术检测PCR产物等,分子生物学诊断技术,基本PCR技术,基本原理:PCR是体外DNA的大量复制合成反应。PCR同生物体细胞内DNA的复制合成反应一样,只是 DNA聚合酶代之以耐热 DNA聚合酶(通常为Taq DNA聚合酶),以DNA为模板。其基本要素包括DNA模板,即靶DNA分子,可为染色体DNA，亦可为克隆的质粒DNA;可为单链或双链DNA分子;可是线性,亦可是环状DNA分子寡聚DNA引物,与模板DNA链3端序列互补的小片段单链DNA,通常在30个碱基对以内,耐热DNA聚合酶,通常为耐热的Ta
36、q DNA聚合酶,在高温下(72)能催化DNA合成,并在加热到940C时不会变性四种单核苷酸(dNTPs)即dATP、dGTP、dCTP、dTTP,以供给DNA合成的原料反应缓冲液,提供DNA合成反应所需的无机离子及合适的PH等;在反应体系中加入上述模板、引物、DNA聚合酶、dNTPS并提供适宜的PH值、无机离子的情况下,用加热94(变性)、冷却55(退火)、保温72(延伸)循环往复的变温方法使DNA得以无限扩增复制,基本PCR技术,方法评价:PCR反应是以指数方式进行扩增目的DNA序列的,经2530个循环后,扩增倍数可达原来的106,是极敏感和特异的检测技术,在100ng染色体DNA中足以检
37、出单一拷贝的基因。即使有极微量的DNA污染都有可能造成假阳性,因此反应体系必须绝对清洁,杜绝DNA污染。所用器皿、器材等最好是一次性的。影响PCR结果的另一主要原因是MgCl2浓度,不同的引物模板系统,所需MgCl2的最适浓度不同,必须进行预实验来确定,基本PCR技术方法评价,一般最适MgCl2浓度为1.5mmol/L、3.0mmol/L或4.5tmmol/L,热循环温度也是影响 PCR能否成功的关键。最适引物的设计及模板的纯度及量对反应结果也有重要影响PCR技术是寄生虫病特别是原虫病病原检测最敏感和最特异的分子生物学检测技术诊断方法,基本PCR技术方法评价,如对疟原虫的检测敏感度可达每21全
38、血中有1个原虫虫体,显著高于镜检法。PCR阳性表明被检者机体内有寄生虫病原体存在,但其为隐性感染者、带虫者或现症病人,应根据其临床表现来判断适用范围:用于疟疾、卡氏肺孢子虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、阿米巴病、锥虫病、蓝氏贾第鞭毛虫病、细粒棘球绦虫病等的实验诊断,基本PCR技术方法评价适用范围,反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)是为检测生物组织某一基因在某种生理、病理或药物作用下的表达情况而设计的。过去常用的方法是将提取的mRNA做滤膜打点杂交或Northern Blot试验,由于mRNA含量极低,这种方法获得成功的机率很低。而RTPCR是先将mR
39、NA逆转录成cDNA,再进行PCR扩增,大大提高了其检测的敏感性,反转录PCR,反转录PCR基本原理,以mRNA为模板在反转录酶(如禽骨髓瘤病毒,AMV反转录酶)作用下,用一特异性引物首先合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下,用一对特异性引物进行PCR扩增反应。RT-PCR的关键是RNA的反转录。模板可以是总RNA、胞浆RNA或Poly(A)+RNA,但不能混有DNA及蛋白质,尤其不能被RNA酶污染,因此标本必需经无RNA酶的DNA酶处理,评价与应用:该法是检测生物一定生长发育时期、疾病的某一病理时期或药物治疗后特定基因的表达情况,借以观察某基因对生物、发育,疾病病理过程的影
40、响,以及药物治疗对某基因表达的影响及其治疗效果等。如用RT-PCR检测血吸虫病肉芽肿细胞TGF-1mRNA的表达,以了解血吸虫虫卵肉芽肿纤维化的病理状况等,反转录PCR评价与应用,锚式PCR(anchored PCR)是在得到某一蛋白质纯品,并已获得其 N端部分氨基酸序列资料,或已了解部分mRNA序列资料,欲克隆该蛋白或该mRNA的基因,所采用的PCR技术基本原理:以具Poly(A)+尾的mRNA为模板,用一非特异性寡聚胸腺嘧啶核苷酸oligo dT20引物和两个根据已知部分序列的mRNA设计的特异性引物,所进行的PCR反应分析技术。两个特异性引物,可紧密相邻或部分重复,一个用于原始扩增,另一
41、个用于再扩增,锚式PCR,锚式PCR是分析及克隆已知部分N端氨基酸序列蛋白或部分碱基序列mRNA的全长DNA基因序列的有效方法。它不需要有确切的或完全的蛋白氨基酸序列,或DNA序列资料去设计适宜而特异的PCR引物,也不依赖cDNA文库。由于在进行 PCR反应时,需要一个非特异性引物-oligo dT20,故它只适用于含Poly(A)+尾的mRNA,而对不含Poly(A)+尾的(如组蛋白)mRNA就不适用,锚式PCR评价与应用,差异显示 PCR(differential dsplay PCR,DWPCR)又称差异显示反转录 PCR(DDRTPCR),是用于分析鉴定不同组织细胞或在不同条件下同一来
42、源组织细胞基因表达差异的有效技术。过去应用的是mRNA递减杂交法,不仅需要大量RNA费时费力,而且只能克隆表达丰度很高的mRNA对应的基因。差异显示PCR结合了PCR的大量扩增功能以及聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力,为克隆差异表达基因提供了有效方法,差异显示PCR,基本原理:主要依赖于RTP-CR技术,以需要比较的组织或细胞的mRNA为模板,用一套锚定的oligo(dT)12MN引物和一个随机的十聚寡核苷酸引物反转录并扩增mRNA的3末端。由于所有mRNA都有Poly(A)尾,在Poly(A)前面的第一位碱基(A除外)有3种可能,即G、C或T，第二位的碱基有4种可能,即G、C、T或A,这2个碱基
43、共有12种组合,差异显示PCR基本原理,因此,人工合成的oligo(dT)12MN引物亦应有12种与之相对应,通常该引物为12个胸腺嘧啶核苷后面加两个随机碱基,M可为G、A或C,N可以是G、A、T或C。以引物3端最后一个碱基分组,共分四组,如NG组包括:5TTTTTTTTTTTTGG35TTTTTTTTTTTTAG35TTTTTTTTTTTTCG3,差异显示PCR基本原理,分别以上述四组oligo（dT）12为引物作反转录制得CDNA，然后以此CDNA作模板，同样的oligo dT引物和一个随机十聚寡核苷酸引物及放射标记的单核苷酸进行PCRPCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,找出差异显示的
44、DNA条带,回收后再进行PCR扩增,扩增后的DNA片段可用作探针进行Northern blot分析和cDNA文库的筛选,差异显示PCR基本原理,方法评价:DDPCR检测涵盖面广,几乎可检测细胞表达的所有基因,可同时比较多种细胞类型,并同时显示所有差异表达基因及基因表达的上调和下调。是目前差异显示mRNA最有效和最快捷的方法。由于要对所有被表达基因进行反转录和扩增,必须12种3端oligo(dT)12MN引物与20-30条5端随机引物组合。这就需要进行240次以上的PCR反应,配对组织细胞越多,进行PCR的次数就越多,检测全部 mRNA的工作量就非常繁重,差异显示PCR方法评价,但经实验研究发现
45、,3端引物oligo T12MN的特异性取决于N碱基,而与M碱基种类无关。进一步研究发现,MN至少有一个为G的引物,比至少有一个为C的引物更优越,但当N为A或T时的扩增效果最差。因而将3端引物兼并成H-T11G、H-T11-A和H-T11-C3种,这就大大简化了实验步骤,提高了PCR效率,差异显示PCR方法评价,适用范围:DDPCR在生物医学各个领域中得到了广泛应用。主要用于生物个体生长发育过程中寻找新基因、病理性基因、癌变基因、微生物、寄生虫的抗药基因(如恶性疟原虫抗药基因的寻找)、药物敏感基因、致病基因以及有效核酸疫苗基因等,差异显示PCR适用范围,免疫PCR(immune PCR)是用P
46、CR技术检测免疫学反应。是抗原抗体的特异性免疫反应结合PCR技术的高度敏感性而进行的一种检测技术基本原理:用已知的DNA片段代替酶、荧光素或同位素作为标记物标记特异性抗体分子,通常为抗体-亲和素-DNA复合物。其标记方法是,将制备的生物素(biotin)标记抗体与链亲和素(streptavidn)结合,由于一个链亲和素分子可以同四个生物素分子结合,免疫PCR,因此再加入生物素标记的DNA片段后,即可形成抗体-生物素-链亲和素-生物素-DNA复合物，简写为抗体-亲和素-DNA复合物。按常规ELISA方法,用包被缓冲液稀释待测抗原包板,经洗涤后加抗体-亲和素-DNA复合物,再经彻底清洗后加入PCR
47、反应体系,按常规PCR反应进行扩增反应,产物经凝胶电泳分析、鉴定特异性条带,免疫PCR基本原理,如有相应的特异性抗原存在,即可形成抗原-抗体-亲和素-DNA复合物,由于有特异性DNA片段的存在,随后的PCR反应即能产生特异性的DNA产物,就可检测出特异性的条带。表明待测抗原阳性。如无特异条带出现,则表明无待测抗原,是为阴性,免疫PCR基本原理,免疫PCR具有高度的敏感性,可以检测到常规免疫学方法无法检测到的样品。应用免疫PCR可在单细胞内检测到抗原,定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原量,在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。但抗体和标记DNA的任何非特异性结合均会导致本底非
48、特异反应。因而在加入抗体DNA标记复合物后必须尽可能地将未结合的DNA标记物洗掉,还必须防止DNA的污染。目前,该项技术尚未用于寄生虫病的诊断,免疫PCR评价与应用,免疫PCR是用PCR技术检测免疫学反应,而PCRELISA则是用免疫学技术检测PCR反应产物,比常规PCR反应电泳检测结果更简便、省时,并可处理大量标本,便于自动化，且避免了有毒致癌物溴乙锭的污染及紫外线的损伤，较免疫PCR更方便,PCRELISA,PCRELISA基本原理,基本原理:以待测标本DNA为模板,用生物素(biotin)标记的特异性引物进行PCR扩增反应,将带生物素标记的PCR产物与酶标反应孔中包被的链亲和素(stre
49、Ptavidin)结合,用地高辛标记的探针与PCR产物杂交,再加入酶标记的抗地高辛抗体,然后加底物显色,酶标检测仪判读结果,还有一种省却探针的PCR-ELISA试验,其原理是,用生物素标记的引物和荧光素标记的引物进行PCR反应,产物 DNA分子中既有生物素分子又带荧光素分子,将该产物同酶标反应板中包被的链亲和素结合,再加酶标记的抗荧光素抗体,洗涤后加酶底物显色,同上判读结果。此法减少了探针杂交过程,减化了实验步骤,PCRELISA基本原理,方法评价:由于PCR是以指数方式扩增靶DNA有极微量的DNA存在即可出现阳性结果.因此PCR试验具有极高的敏感性,又由PCR是以碱基配对原则进行扩增反应的,
50、要求高度特异性的引物引导PCR反应,因此该技术又具有高度的特异性;但影响PCR结果的因素也很多,应避免DNA污染,容器、吸管、反应管、移液吸头必需经高压灭菌,且是一次性的,方能保证结果的真实性,PCRELISA方法评价,适用范围用于疟疾、卡氏肺孢子虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、阿米巴病、锥虫病、蓝氏贾第鞭毛虫病、细粒棘球蚴病等的实验诊断,PCRELISA适用范围,生物芯片技术,芯片(Chip)是20世纪50年代发展起来的应用于电子计算机技术的大规模晶体管集成电路,具有微型化和大规模处理、交换信息的能力,是计算机技术的关键与核心。而生物芯片(biochip)技术是近十年随着人类基因组计划(hum
