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1、第二十三章 免疫自动化仪器分析,本章学习要点：,掌握：自动化免疫比浊分析原理及类型，化学发 光自动化免疫分析原理及类型，荧光免疫 自动化分析原理及类型，各类型分析特点。熟悉：分析试剂中不同标记物的作用原理及类型，抗原过量检测设计原理。了解：自动化分析的发展历史、基本原理、临床 应用范围。,第二十三章 免疫自动化仪器分析,手工操作,分析自动化,免疫学的发展,分析自动化,临床化学特殊化学析灵敏度精密度速度快微量和超微量,计算机技术材料科学进步生物学技术,第二十三章 免疫自动化仪器分析,免疫学测定（IA）利用抗原和抗体特异性结合反应的特点，检测样本中微量物质的方法,各个领域,免疫球蛋白及其片 补体、
2、细胞因子、体黏附分子及其配体,病原体抗原或体、多种凝血因子、酶和 同工酶、激素及多肽,肿瘤标志物、药物及毒品等,高精度,高效率,免疫分析的基本技术新技术的应用,第二十三章 免疫自动化仪器分析,手段更先进,方法更可靠,灵敏度达到ng或pg心肌标志物、内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物维生素及治疗药物,更快更准确,酶免疫分析生物素-亲和素技术荧光免疫分析化学发光技术,自动免疫分析仪的结构特点：,第二十三章 免疫自动化仪器分析,主机部分,发射光源系统,信号检测系统,稀释加样清洗,样处理系统品,计算机系统,信息处理及数字转换,信息储存分析报告系统,报告打印,SYNCHRON CX PROSeries
3、SYNCHRON LX,LX20 PROSeries,IntegratedSystemSolutions,YNCHRON LXi 725SCOULTER LH 755,InstrumentSolutions,基于系统的自动化,SYNCHRON CX PROSeriesSYNCHRON LX,LX20 PROSeries,IntegratedSystemSolutions,YNCHRON LXi 725SCOULTER LH 755,InstrumentSolutions,基于系统的自动化,临床实验室 自动化,设计思路五点技术指标,第二十三章 免疫自动化仪器分析,检测用抗体必须具有高特异性和高亲
4、和力,通常采用磁性微球作为固相载体，增加反应面积,放大反应信号,最常使用生物素-亲和素包被、酶-发光底物、酶-荧光底物、元素-化学发光、元素-荧光系统,保证对微量样本、小分子多肽或蛋白敏感、准确,结合计算机软件系统自动处理分析信号及数据转换,人工智能化的设计，自动检测及校对功能,免疫检测的基础抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析免疫比浊分析技术发展,第一节 自动化免疫比浊法,核心基础,两个阶段,测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊,测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊,免疫比浊法分类,第一节 自动化免疫比浊法,当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱,透
5、射比浊法:在光源的光路方向（00）测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。,散射比浊法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。,一、散射免疫比浊分析原理散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合，形成一定大小的复合物粒子，当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸收或折射，发生偏转，其偏转的角度与发射光的波长和复合物颗粒大小和多少有关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。,第一节 自动化免疫比浊法,影响散射信号的因素：如入射光的波长、偏振、微粒大小、浓度、质量、以及检测点的距离。,
6、第一节 自动化免疫比浊法,（一）散射颗粒与散射光 Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，与散射 光的夹角呈正比，与波长呈反比。在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减少入射光的波 长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。,如果颗粒直径比入射光的波长小的多 则散射光的分布比较均匀 如果颗粒直径接近入射光的波，则散射光的分布呈明显不均匀,称为Rayleigh散射,称为 Mile散射,第一节 自动化免疫比浊法,（二）反应物含量与散射浊度,Heidelberger曲线：即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体反应时
7、间增加而曲线上升。,当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量，使散射响应值迅速下降,因此，在采用散射比浊测定时，一定要保证抗体过量。,第一节 自动化免疫比浊法,二、定时散射比浊分析（一）基本原理,是将沉淀反应与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反 应几秒钟后开始测定峰值信号”。目的是排除抗原抗体反应的不稳定性，降低检测误差。采用抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。,时间检测分两个,在预反应时段，加小量样本与抗原抗体反应，测定第一次散射光信号值,加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号,信号峰值计算机处理转换为样品浓度,第一节 自动化免疫比浊法,二、定时散射比浊分析（二）抗原
8、过量检测,抗体过量 在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与 抗体的结合。对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。,采用两项保证措施：,第一节 自动化免疫比浊法,三、速率散射比浊分析（一）基本原理,是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰 值的高
9、低，即代表所 测抗原的量。,第一节 自动化免疫比浊法,三、速率散射比浊分析（一）基本原理（二）抗原过量检测 设计原理,速率峰值一般在25秒时出现。在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗 原抗体复合物的形成，以减少反应时间。速率法的优点：是快 速、不需要减去样本 和试剂本底读数，校 正结果也较稳定。,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析（一）基本原理,当光源的光路（角度与正前方夹角为00时），通 过一定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复 合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。,检测器,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,光,透射光,
10、散射比浊、透射比浊光路图,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析（一）基本原理 是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变。测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待测物中Ig含量可通过标准曲线计算得出。待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。反应在PEG的作用下，加速复合物的形成。,第一节 自动化免疫比浊法,四、免疫透射比浊分析（二）实验要求,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)溶液中形成的复合物分子要足够多 控制
11、抗原抗体反应的温度和时间 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标 准曲线，,第一节 自动化免疫比浊法,五、免疫比浊分析的注意事项,（一）校准程序 保证仪器处于正常的工作状态（二）定标及质控程序 保证使用的试剂可靠性，从而检测结果的准确性（三）自动控制系统 自动稀释功能，从而获得准确的光散射信号 仪器均具有自动监测或报警功能，可减少劳动强度,第一节 自动化免疫比浊法,免疫比浊分析的临床应用,检范围测,如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、；补体C3、C4；血浆蛋
12、白AAT、TRF、A1M、CER、HPT、PAB、ALB；炎性反应蛋白 SAA、CRP；载脂蛋白 APO、ABI；尿蛋白系列小分子治疗药物,检范围测,血浆、体液中特种蛋白,第二节 化学发光自动免疫分析,一、化学发光分析的原理 在常温下，一些特定的化学反应产生的能量使其产物或中间态分子激发，形成电子激发态分子；当其衰退至基态时，所释放出的化学能量以可见光的形式发射，这种现象称为化学发光(CL)。能产生CL反应的物质称为化学发光剂或化学发光底物。,发光物标记,元素标记,酶标记,根据标记物分为三大类,特点,化学发光反应与免疫反应结合，即具有免疫反应的特异性，又兼有发光反应的高敏感性。,总称CLIA,
13、第二节 化学发光自动免疫分析,一、化学发光分析的原理 化学发光物质大多数属氧化反应；该反应能提供足够的能量使其产物分子或中间体分子上升至电子激发态；发光物质的理化特性能满足分析设计的要求。,化学发光反应,气相反应体系,液相反应体系,固相反应体系,化学能转化为电子激发态能，使中间体变成电子激发态,即反应生成中间体,激发分子辐射迁回到基态,第二节 化学发光自动免疫分析,二、化学发光分析中的标记物及类型,两种分类法,两类,酶参与的CL反应非酶参与的CL反应,三类,直接参与发光反应的标记物以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物以能量传递参与氧化反应的非酶标记物,（一）直接参与发光反应的标记物 这类
14、化学发光物其结构是有一能产生发光的特殊基团，直接参 与发光反应。其特点没有本底发光；并可检测微量浓度样本。最常用的标记物吖啶酯类，不需要催化剂的参与，在过氧化氢的 稀碱溶液中即能发光。发光波长430nm。,第二节 化学发光自动免疫分析,二、化学发光分析中的标记物及类型,（二）以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物 这类酶标记物作为能量传递的介质直接参与催化发光反应。其酶催化 反应后发光效率的强弱与样本的含量呈正比。常用的酶标记物有两种：,辣根过氧化酶（HRP）在碱性条件下，HRP标记抗体与样本中的抗原结合成抗原-抗体复 合物后，在HRP和H202的作用下，使底物鲁米诺发光，发光的强度取 决
15、于形成的抗原-抗体酶标记物复合物量。碱性磷酸酶（ALP）用ALP标记抗体，当形成的抗原-抗体ALP标记物复合物后，ALP催 化底物AMPPD，迅速水解脱去磷酸根，生成不稳定的中介APMD，此 生成与分解，就产生持续稳定的发光。,第二节 化学发光自动免疫分析,二、化学发光分析中的标记物及类型,（三）以能量传递参与氧化反应的非酶标记物 这类标记是用一种化学发光剂取代酶标记物标记抗体，不直接 参与化学发光反应，只作为发光反应的催化剂或能量传递过程中的 中间体。通过检测发光物在激发态与基态的活动所产生的光子的量 反映样本中被测物的浓度。上述三类化学发光反应的动力学反应，发光剂从高能量级的激发态，回到低
16、能量 级的稳定态。发光所释放的能量，由超敏 感光电流倍增管接受发光信号，检测发光 强度，并进行自动控制。,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,化学发光免疫分析（CLIA），标记物为吖啶酯类 化学发光酶免疫分析（CLEIA），反应中使用辣根过氧酶（HRP）标记Ag和Ab，在反应终点再加入鲁米诺，产生发 光反应 微粒子化学发光免疫分析（ELIA），反应中使用碱性磷酸 酶（ALP）标记Ag和Ab，其作用于发光底物，使其由激 发态回到基态而产生发光反应。电化学发光免疫分析（ECLIA），采用三联吡啶NHS酯在 电极表面发生氧化还原反应产生发光。,发光免疫分析类型,第二节 化学发光自
17、动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（一）化学发光免疫分析（CLIA）标记物为吖啶酯类、不需催化剂参与、在H202稀碱溶液 中即能发光。,磁性微粒子抗体,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（二）化学发光酶免疫分析（CLEIA）反应中使用辣根过氧酶（HRP）标记Ag和Ab，在反应终点 再加入鲁米诺-过氧化氢，产生发光反应。测定发光强度信号可分析被测物的含量。,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（三）微粒子化学发光免疫分析（ELIA）以顺磁性微粒作为固相载体包被抗体，当加入标本形成第一 次抗原抗体反应后,由于磁力的作用，很快与非特异性物质分开,再加入碱
18、性磷酸 酶（ALP）标记的第二抗体，形成磁珠包被抗 原-抗体-酶标记复合物，洗去未结合的抗体，加入ALP的发光低 物AMPPD，在ALP的催化下迅速脱去磷酸基团，生成不稳定的 中间体AMPD，中间体分解过程即由激发态回到基态时，可以 产生稳定的持续发光反应。发射光所释放的光量子被光量子阅读 器记录，经计算机处理系统将其转换为待测物的浓度。该法重复性好，检测水平可达 pg/ml。,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（三）微粒子化学发光免疫分析（ELIA）,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（四）电化学化学发光免疫分析（ECLIA）反应包括化学发光和电化
19、学 两个过程：,生物素抗体-抗原-三联吡啶钌标记抗体-亲和素微粒,生物素-亲和素微粒双抗体夹心复合物,第一步,亲和素-顺磁性微粒,第二节 化学发光自动免疫分析,三、化学发光分析中的类型,（四）电化学化学发光免疫分析（ECLIA）,第二步,强还原剂,强氧化剂,第二节 化学发光自动免疫分析,四、在临床免疫检测中的应用,计算机技术,自动化分析仪器,免疫反应发光技术,智能化程度高敏感度高特异性好灵活、快速易于质量管理,检测项目：内分泌激素类、肿瘤标志物类、心机标志物类、病毒标志物类、治疗药物浓度、骨代谢、贫血类,+,第三节 荧光免疫自动化分析,免疫荧光技术原理,荧光物质标记已知的抗体或抗原,结合,抗原
20、-抗体复合物,荧光信号检测器,计算机处理,打印报告,荧光是由荧光物质吸收光能，而后释放能量，并发出一种较长波长的光。当一束光投射到荧光物质上，其电子被激发到较高的能量水平。而后被激发的物质释放出光子而回到初始状态。在这个过程中丢失一部分能量，而释放的光子比激发光的波长更长。先后两者波长之差是荧光物质的特征，称为“Stokes”改变。,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是在免疫荧光分析的基础上，即以抗原-抗体反应与荧光物质的发光和时间分辨技术结合，发展起来的一种新型的分析技术。时间分辨采用镧系稀土元素铕（Eu3+）、钐（Sm3+）等鳌合物被激
21、活后产生的特异荧光寿命比普通荧光长34个数量级，待短寿命的非特异性荧光衰退后再测定长寿命的荧光信号。优点：由于排除了非特异性荧光的干扰，因此最大限度地提高了测定方法的敏感度，最小检出值达10-16mol/L、分析速度快、有效使用期长、无放射性污染、应用范围广等。,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（一）TRFIA分析原理 排除非特异性荧光（即本底荧光）普通荧光素 血清蛋白发射荧光波长 一般为110ns 荧光寿命短 胆红素发射荧光波长 最长不超过20ns,短激发波长280 nm，发射波长320350nm,短激发波长280 nm，发射波长320350nm,镧系元素铕等鳌合物是具
22、有三价离子的“特殊荧光基团”1（对苯偶氮）EDTA 异硫氰酸苯基 EDTA 异硫氰酸苯甲基 DTTA,这类鳌合物可同时与稀土离子和抗原或抗体连接,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（一）TRFIA分析原理 利用具有双功能基团的鳌合剂，容易与抗体分子以共轭双键结合制成标记物(稀土离子-鳌合剂-抗体)。包被在固相载体上的抗体-结合待测抗原与标记物上的抗体结合，形成双抗体夹心复合物。稀土元素鳌合物在紫外光（340nm）激发下，不仅发射出高强度的荧光（613nm)，而且衰变时间也较长(10 s1ms)。利用延缓测量时间，待检测物中非特异性荧光自然发生全部衰变后（完全排除非特异本底荧
23、光的干扰）。再经时间分辨荧光信号接受器接受其信号强度，经计算机系统换算，定量出待测物浓度。,双抗体夹心法,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（一）TRFIA分析原理,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（二）时间分辨信号原理 激发光光谱（340nm）发射带宽 发射光光谱（613nm）发射带窄 两种光谱 Stokes位移大,普通物质荧光光谱,290nm,第三节 荧光免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（二）时间分辨信号原理 激发光光谱半衰期短（110s)发射光光谱半衰期长（101000 s)两种光谱不发生重叠,普通物质荧光光谱,铕730s,第三节 荧光
24、免疫自动化分析,一、时间分辨荧光免疫测定,（三）解离增强原理 反应在PH23 Eu3+从抗原抗体复合物上全部解离下来，再与荧光增强液中的-二酮体鳌合剂和协同剂在Triton X100存在的条件下，形成新的强荧光鳌合物。在紫外光激发下新鳌合物荧光信号可增强百万倍。该技术被称为解离增强镧系元素荧光免疫。其定量检测的灵敏度为10-16mol/L。,脉冲氙灯,第三节 荧光免疫自动化分析,二、荧光偏振免疫测定（FPIA）,是利用荧光物质在溶液中经单一波长（485 nm、蓝光）照射后，可吸收光能并发射出另一单一平面（波长为525nm）的偏振荧光，其荧光强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。主要用于小分子药物定
25、量测定。,利用荧光分子的三个特征,光量子 吸收光与发散的时间差 发射光与激发光的波长差异,第三节 荧光免疫自动化分析,二、荧光偏振免疫测定（FPIA）,检测采用均相竞争法 原理：荧光素标记已知抗原(Ag)与标本中的待测抗原(Ag)共同竞争相应抗体，形成。标记抗原-抗体复合物分子量大，旋转速度比游离标记抗原慢，通过发射光振器测量荧光偏振光强度，偏振光强度与药物浓度呈反比关系，根据测定反应系统的偏振光大小，经计算机处理从标准曲线上可精确地得知样品中待测药物的相应含量。FPIA法的优点是对反应样品无需进行分离、提取；样品用量少；短时间内可测定多数样品。缺点是检测的灵敏度比TRFIA分析法低；不适宜分
26、析大分子物质；此外，仪器和试剂均从国外进口，较昂贵不宜普及。,标记抗原-抗体复合物待测抗原-抗体复合物游离标记抗原,第三节 荧光免疫自动化分析,三、荧光酶免疫测定,荧光酶免疫分析 是以碱性磷酸酶为标记用酶，以反应管中的纤维为固相载体，4-甲基伞型酮磷酸盐为酶反应荧光基质，在酶的催化下分解，脱去磷酸基团生成4-甲基伞型酮，在（360nm）激发光照射下，发出（448nm）荧光，经FEIA检测系统及计算机处理可定量测定待测物的浓度。该法灵敏度高；可用于各种抗原抗体的检测，应用范围广。该仪器和试剂均从国外进口，价格较昂贵不宜普及。,第三节 荧光免疫自动化分析,二、荧光酶免疫测定,第三节 荧光免疫自动化分析,四、在临床免疫检测中的应用,TRFIA特异性高、敏感性强、无污染，尤其是DELFIA检测技术应 用范围极宽。不足之处是反应要在固相载体上进行，需集中 做，不能随机做急诊。FPIA敏感性低，易受干扰。是目前临床治疗药物监测中开发项目 最全、最常采用的方法。FEIA是较成熟的自动化分析手段，目前国内临床实验室较普及。,
