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1、第二章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定,第一节 概述,蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重要的成分。它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆类可达45-55，其次是花、叶、茎和根。作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组织输送，在接近成熟时期，茎叶中的氮向贮存器官输送，合成的蛋白质集中于种子中。,各种农产品中蛋白质的含量水平（%）,蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产品品质和营养价值的重要指标。测定植物各部分中蛋白质的含量，对其品质鉴定、品种选育、改善作物生育条件和调节作物体内新陈代谢和提高蛋
2、白质含量等有重要意义。对产品加工方式及其产品质量有影响。在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。,为什么要测定蛋白质？,氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸两种。“第一、第二限制氨基酸”的赖氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人类和动物自身无法合成，须从食物中直接吸收。氨基酸的含量是衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。,为什么要测定氨基酸？,蛋白质的分析方法很多，可分为两类：(1)利用蛋白质的共性，即含氮量；(2)利用蛋白质中特定氨基酸
3、残基、酸(碱)性基团和芳香基团测定蛋白质含量。最常用的方法是开氏（凯氏）法测定含氮量。粗蛋白质：开氏法测定结果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质”纯蛋白质：开氏法测定中，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。,第二节 蛋白质的测定,籽粒中粗蛋白质的测定同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法)同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法),蛋白质测定方法介绍,一、籽粒中粗蛋白质的测定,H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（开氏法）方法原理：植物中的蛋白质含量基本上是不变的。可用开氏法消煮定氮，再将测得的含氮值乘以蛋白质
4、换算系数，即得粗蛋白质含量。换算系数：平均6.25蛋白质平均含氮16%，不同植物籽粒换算系数见P286表14-2。,注意问题,籽粒样品在开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的。因此，蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态氮化合物，然后用开氏分解测定总氮量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。,开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔(J.Kjeldahl)于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。设备简单易得，结果可靠，为一般实验室所采用。至今尚无别的方法能与其比拟或将其取代。因此国
5、际谷物化学协会(ICC)和美国分析化学家协会(AOAC)以及我国都把开氏法作为标准的分析方法。,开氏法介绍,开氏法是测定全氮量的经典方法，是丹麦人开道尔于1883年用来研究蛋白质变化的，后来被用于测定各种形态的有机氮。开氏定氮法：(Kjeldahl determination)：在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液（硼酸）吸收，再以标准酸滴定，即可计算出样品中的氮量。,开氏法介绍,有机氮,铵盐,NH3,NH4+,开氏法也有缺点，主要是操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高。近年已出现几种以开氏法原理为基础的
6、全自动或半自动的开氏定氮仪。瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的KjelFOSS自动蛋白质分析仪等。,开氏法介绍,二、仪器设备,消煮炉或电炉消煮管(或开氏瓶)100mL或50mL半微量定氮装置半微量滴定管,三、试剂,20 gL-1H3BO3指示剂溶液：称取H3BO3(分析纯)20g溶于1L水中。每升H3BO3溶液加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂20mL，并用稀酸或稀碱调节至紫红色(pH=4.5)。0.01 molL-1(1/2H2SO4)或0.02 molL
7、-1HCl标准溶液。其他试剂同第四章(土壤全氮的测定)。,(1)样品的消煮 称取烘干样品(过0.25mm筛)0.3000 0.5000g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮管中，加入混合催化剂1.8g，加几滴水湿润后，加5mL浓H2SO4，小心轻摇后(最好加塞放置过夜)，盖上小漏斗，将消煮管放置在消煮炉上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加热约10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损地转入100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置澄清。,四、操作步骤,（2）氮的测定 用移液管吸取澄清待测液5.00或10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作
8、空白试验和核对试验。,见教材P46,四、操作步骤,凯氏定氮仪,半自动,氮含量换算成蛋白质的系数，一般采用6.25，这是由蛋白质平均含氮16%为根据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有差异，故由氮换算为蛋白质的系数也稍有不同，P286。以定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要用水杨酸固定硝态氮化合物，用开氏分解测定总氮量;同时用其他方法测定硝态氮的含量，再从总氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。,注意问题,本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂碱
9、性硫酸铜、碱性醋酸铅、200gL-1 250gL-1单宁或100gL-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。,注意问题,方法原理 蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=23的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质-染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。,二、同类种子中蛋白质的测定
10、(染料结合-DBC法),主要仪器试剂操作步骤结果计算参见教材P286,二、同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法),该法是间接测定种子中蛋白质的方法。方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批同类样品的筛选工作。不适用随意混合物的样品的测定。如在筛选同种作物种子的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。,注意问题,方法原理 蛋白质的肽键结构，具有类似于双缩脲的反应基团。在碱性条件下能与Cu2+生成紫红色可溶性络合物，蛋白质含肽键多时反应呈紫色，反之肽键少时，反应呈红色。这种颜色反应称为双缩脲反应(或称缩二脲反应)。实验证明，蛋白质溶液
11、浓度在1-15mg之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比关系。故可用此反应进行蛋白质的测定。,三、同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法),样品处理与测定 参见教材P289。,三、同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法),适用于大批品种筛选、育种等工作中的蛋白质测定。一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室温20-25，须于120190min内比色；40为15-70 min显色稳定；而在60连续
12、振荡条件下显色，则反应时间缩短为5min。,注意问题,第三节 氨基酸的测定,氨基酸分析方法包括测定氨基酸的总含量及测定全氨基酸中每种氨基酸的含量两个方面。测定氨基酸总量的方法与蛋白质分析有密切的关系。许多测定蛋白质含氮含量的方法如开氏定氮法及各种比色法均可用于测定氨基酸的总含量。测定氨基酸总含量的方法还有甲醛滴定法，方法简单，快速，广泛应用于实际工作中。,全氨基酸：色谱法测定。薄层层析色谱法：60年代发展起来的分析方法，操作简便，设备简单、层析速度快、灵敏度高，广泛应用于分离和测定氨基酸。气相色谱法：气相色谱法具有分析速度快、灵敏度高的特点，仪器的成本也比氨基酸自动分析仪低。尤其是在分析氨基酸
13、的对映异构物及超微量(ng)样品中气相色谱有特殊的作用。氨基酸自动分析仪：应用最广泛的分析氨基酸的专用仪器。该仪器的基本原理仍然是离子交换柱层析。,第三节 氨基酸的测定,一、全氨基酸和游离氨基酸的分析 氨基酸分析仪法,方法原理 氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相(缓冲溶液)推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时(磺酸型Na+柱)，氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的pH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开，流出色谱柱的氨基酸再与茚三酮在100下反应生成紫色物质茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色（570nm）后的氨基酸由光度计检测。,氨基酸自动
14、分析仪,(1)全氨基酸试样的制备（盐酸水解）。(2)胱氨酸及色氨酸的水解（盐酸分解过程中破坏，需另行制备）。(3)植物性产品中游离氨基酸试样的制备。(4)上机测定。,操作步骤,二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 染料结合法-DBL法,赖氨酸是一种必须的氨基酸。缺乏赖氨酸，人与动物不仅不能正常发育，还会引起某些疾病。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的氨基酸，被称为第一限制氨基酸。对人体的作用：1提高智力、促进生长、增强体质。2增进食欲、改善营养不良状况。3改善失眠，提高记忆力。4帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。5帮助钙的吸收，治疗防止骨质疏松症 6降低血中甘油三酯的水平，预防心脑血管疾
15、病的产生。,赖氨酸在谷物贮存、加工过程中，又很不稳定，易于脱去氨基、被氧化或是发生变质而破坏，变成营养上的“无效”。测定方法：2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2,4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法(CNPY法)等。这类方法操作手续繁长费时，还需要某些特殊的试剂，不适用于成批样品的分析。染料结合法-DBL法：国内外应用较广泛的、简便易行。,二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 染料结合法-DBL法,原理：染料结合法可用于测定样品中蛋白质的碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。如果先将样品用丙酸酐处理，丙酸酐便将赖氨酸的-NH2的酰基掩蔽，使其失去和染料结合的能力。然
16、后分别测定酰化前后的染料结合量DBC值：酰化前的测定值为赖氨酸+组氨酸+精氨酸。而酰化后只是组氨酸+精氨酸，以上两项测定结果的差值，就可计算之赖氨酸的含量。,二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 染料结合法-DBL法,样品处理：称取已粉碎过60目筛酰化和不酰化样品各两份，重量见下表。分别加3035mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的试管中，标明为A、B管(酰化样品)和C、D管(不酰化样品)。同时应另称样品测定水分含量。,色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人与动物的新陈代谢中起着重要的作用，某些代谢产物对人类的大脑功能及生长发育影响很大，公认为“第二限制性氨基酸”。预防糙皮病：已经发现人类缺乏色氨酸会患糙皮病（
17、皮炎），常食玉米会发生。调节情绪：色氨酸是脑部化学物质5-羟色胺的重要前体，能帮助调节情绪。改善睡眠：色氨酸生成的5-羟色胺，能改变睡眠持续时间。,三、谷物和饲料中色氨酸的测定 乙醛酸法,在我们所吃的食物中，每100克食物色氨酸含量较高的有：海蟹（含801毫克）豆腐皮（含715毫克）肉松（含710毫克）生西瓜子（含631毫克）黄豆（含485毫克）黑芝麻（含402毫克）全脂奶粉（含372毫克）生葵花子（含365毫克）。,三、谷物和饲料中色氨酸的测定 乙醛酸法,目前提出的测定方法很多，归结起来有三类：一是找出一种理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一样，且用离子交换色谱进行测定；二是暴露具有反应
18、活性的吲哚环，然后与某些试剂反应生成带色化合物，进行比色测定；三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，对色氨酸进行分光光度或荧光测定。其中乙醛酸法具有简单、快速的特点。,三、谷物和饲料中色氨酸的测定 乙醛酸法,方法原理,谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在浓硫酸存在的情况下，Fe3+可将乙酸氧化为乙醛酸，2mol色氨酸能与1mol乙醛酸缩合，产生hopkins-cole反应，生成红紫色的化合物，其红紫色的强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比，其最大的吸收峰在545nm，进行比色测定。,三、谷物和饲料中色氨酸的测定 乙醛酸法,Fe3+混合显色剂,主要仪器试剂操作步骤结果计算注意事项 见教材P298,三、谷物和饲料中色氨酸的测定 乙醛酸法,思考题,1.什么是粗蛋白质？如何测得纯蛋白质的含量？2.主要农作物的蛋白质换算系数是多少，为什么不同作物的籽粒其蛋白质换算系数会有差异？3.含硝态氮高的样品，如何测定其蛋白质含量？4.为什么染料结合法、双缩脲法能用于测定蛋白质含量？其方法原理，适用范围是什么？为什么它们都不能直接测得蛋白质的含量？5.氨基酸含量测定有哪些方法？,
