《第七八九章酶.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第七八九章酶.ppt（193页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。
1、第七章 酶通论,酶的概念,酶的分类与命名,酶的化学本质,酶作用的专一性,酶的制备与酶活力的测定,提要,一、酶的概念,酶是生物细胞产生的、具有催化能力的蛋白质。,定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。,酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。,2.专一性：酶对底物和催化的反应都具有严格的选择性。,3.酶易失活性：对环境条件极为敏感。,4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。浓度；活性,酶作为生物催化剂的特点：,1.高效性：通常要高出
2、非生物催化剂催化活性的1061013倍。,1mol过氧化氢酶 5106molH2O21mol离子铁 610-4molH2O2,二、酶的化学本质,（一）大多数酶是蛋白质,(1)酶是蛋白质:1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。(2)核酶的发现：19811982年，Thomas R.Cech实验发现有催化活性的天然RNARibozyme。L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。1955年，发现DNA的催化活性。(3)抗体酶（abzyme）：1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz
3、运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalytic antibody）。,ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）1980以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是蛋白质。80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学Sidney Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。ribozyme种类：自我剪接ribozyme 自我剪切ribozyme 催化分子间反应ribozyme,抗体酶 abzyme(antibody enzyme)又称催化性抗体（catalytic a
4、ntibody）是一种具有催化功能的抗体分子。过渡态理论：酶与底物在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。抗体与抗原是基态结合。,（二）酶的辅因子,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）=酶蛋白+辅因子,辅因子,辅酶,：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,：与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。,金属激活剂,：金属离子作为辅助因子。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,酶的辅因子 酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催
5、化过程。(1)传递电子体：如 卟啉铁、铁硫簇；(2)传递氢（递氢体）：如 FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)传递酰基体：如 C0A、TPP、硫辛酸；(4)传递一碳基团：如 四氢叶酸；(5)传递磷酸基：如 ATP，GTP；(6)其它作用：转氨基，如 VB6；传递CO2，如 生物素。,（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物,1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。牛胰RNase 124aa 单链 鸡卵清溶菌酶 129aa 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链 单体酶种类较少，一般多催化水解反应。,2.寡聚酶(oligomeric en
6、zyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。A.含相同亚基的寡聚酶 苹果酸脱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基。B.含不同亚基的寡聚酶 琥珀酸脱氢酶（牛心），2个亚基。寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。,丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。,碱性,3.多酶复合物(multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。大肠杆菌丙酮酸
7、脱氢酶复合体由三种酶组成：丙酮酸脱氢酶（E1）以二聚体存在296000二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000二氢硫辛酸脱氢酶（E3）以二聚体存在256000 12个E1 二聚体 2496000 24个E2 单体 2470000 6个E3 二聚体 1256000 总分子量：560万,4.多酶融合体 一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。例如：天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I融合体（双头酶）该酶是四聚体4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。,三、酶的分类与命名,1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee,EC）根据
8、酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,1.氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。,AH2+B（O2）,A+BH2（H2O2，H2O）,（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。,AH2+B,A+BH2（需辅酶或辅酶）,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,AH2+O2,A+H2O2（需FAD或FMN）,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,2AH2+O2,2A+2H2O,（3）过氧化物酶,ROO+H2O2,RO+H2O+O2,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,（顺，顺-已二烯二酸）,RH+O2+还原型辅助因子,ROH+H2O+氧化型辅助因子,（又称羟化酶）,
9、2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。,AX+B,A+BX,根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。,3.水解酶类：催化加水分解作用。,AB+H2O,AOH+BH,4.裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,CC键,+CO2,CO键,+H2O,CN键,+NH3,5.异构酶：催化 各种异构体之间的互变。,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。,6.合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。,酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。,系统名：包括所有底物的名称和反应类型。,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,乳酸：NA
10、D+氧化还原酶,系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。,习惯命名法:根据其催化底物来命名,蛋白酶、淀粉酶；根据所催化反应的性质来命名,水解酶、转氨酶;结合上述两个原则来命名,琥珀酸脱氢酶；有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点,胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。,乳酸：NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异。SOD：EC1.15.1.1，只有一个名称和编号 2O2-+2H+H2O2+O2 三类不同的SOD：CuZn-SOD 真核生物细胞质中 Mn-SOD 真核生物线粒体中 Fe-SOD同是Cu
11、Zn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。,四、酶作用的专一性,酶作用的专一性,结构专一性,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,绝对专一性：只能作用于某一底物。,2NH3+CO2,五、酶的分离提纯及活力测定,（一）酶的分离提纯,（二）酶的量度,二、酶的量度 用酶的活力单位表示1.酶活力与酶促反应速度 酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少 量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间,研究酶促反应速度，以酶促反应的
12、初速度为准。,2.酶的活力单位（U）标准单位：在特定条件下，1分钟内转化1mol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25，pH及底物浓度采用最适条件。实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。,酶活力单位酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示，单位为mol/min等。酶活力单位的基本定义为：规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位（activity unit）或又称酶单位（enzyme unit）。国际单位：一般用活力单位U（Unit）表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每
13、分钟催化生成1mol产物所需要的酶量为一个酶活力单位,一个“Katal”单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1 Kat=6107U，1U=16067n Kat以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1mol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2mol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。习惯单位：在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观，规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如：-淀粉酶活力单
14、位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g酪氨酸所需的酶量。DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1g纯化的DNA所需的酶量。,限制性核酸内切酶的3种定义：用粘度法测活性：30，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。转化率法：5分钟使1g供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个
15、酶单位。凝胶电泳法测活：37，1小时，使1gDNA完全水解的酶量为1个酶单位。,淀粉酶两种定义：A：1g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme 量。B：lml 2%可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。,3.酶的比活力 Specific activity 每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。酶的比活力是分析酶的纯度的重要指标。,一个酶的分离纯化分为4 步：步骤 1 2 3 4 总活力（U）6 4 3 2 总蛋白质（mg）20 10 5 2 比活力（U/mg）6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化
16、倍数：酶的回收率：100%,一个酶的分离纯化分为4 步：步骤 1 2 3 4 总活力（U）6 4 3 2 总蛋白质（mg）20 10 5 2 比活力（U/mg）6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数：酶的回收率：100%,4.酶的转换数和催化周期 每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数称为转换数Kcat，。P244 表44某些酶的最大转换数 每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。,例题：,某无细胞的粗提液，每ml含2
17、0 mg 蛋白质。在0.5ml的标准总反应体积中，含有10 l 这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成30ng的产物。求：用下述单位表示反应速度v:nmol/ml/min,nmol/L/min,mol/L/min,mol/L/min 若10 l该提取液，在1 ml总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？酶制剂的比活力是多少？,解：,V=30/0.5=60 nmol/ml/min=60 10 3 nmol/L/min=60 mol/L/min=6 10-5 mol/L/minV=30/1=30 nmol/ml/min=3 10-5 mol/L/min反应
18、液酶活性浓度=60 nmol/ml/min=0.06mol/ml/min=0.06单位/ml 0.5 ml的反应液内含0.03单位酶，即10 l(0.01 ml)提取液含0.03单位酶，所以：提取液酶活性浓度=0.03/0.01=3单位/ml酶比活=3/20=0.05单位/mg蛋白,酶的制备与活力的测定,酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。,酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml）,在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1mol/min,在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为
19、产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s,1kat=6107IU,工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。,优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量由丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。,酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。,方法：1.根据溶解度不同（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）；2.根据酶与杂蛋白分子大小的差别（凝胶过滤法、超离心法）；3.根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）；4.根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚
20、焦层析法）；5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别（选择性变性法）；6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用（亲和层析法）。,酶的纯度：比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）,酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法,酶的保存：1.低温（04，-20）；2.高浓度较稳定；3.加入稳定剂；4.固定化。,酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。,包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法：使酶通过共价键连接
21、于适当的不溶于水的载体上。,交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。,第八章酶促反应动力学,酶促反应的速度和影响酶促 反应速度的因素,一、酶反应速度的测量,用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。,二、酶浓度对酶作用的影响,在有足够底物和其他条件不变的情况下：v=k E,三、底物浓度对酶作用的影响,1.底物浓度对酶反应速度的影响,一级反应 v=k S,零级反应 v=k E,在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的
22、酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象：,当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。,当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。,2.米氏方程式（Michaelis-Menten equation）,k1,k2,k3,（kmS，v=kS；km S，v=Vmax）,米氏方程的推导：,3.米氏常数的意义及测定,v=Vmax/2，则：km=S,意义：,（1）km是酶的一个基本的特征
23、常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。,（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。,（3）当k2k3时，km的大小可以表示酶与底物的亲和性。,km=（k2+k3)/k1,Km k2/k1,km可以看作ES的解离常数ks：,当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。,（4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。,从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，则,90%V=100%VS/(km+S),即 S=9km,在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。,（
24、5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶（1.710-5）,丙酮酸脱氢酶（1.310-3）,丙酮酸脱羧酶（1.010-3）,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。,米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与S的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的S即为km（近似值）。,通常用Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）,（y=ax+b）,斜率=km/Vmax,1/Vmax,-1/km,四、pH对酶作用的影响,pH,五、温度对酶作用的影响,两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快
25、；2.温度升高，热变性速度加快。,最适温度,六、激活剂对酶作用的影响,凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。（activator)。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；,这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。,抑制剂对酶反应的影响有些物质
26、能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor)。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,七、抑制剂对酶作用的影响,使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂（I）。(一）抑制作用类型,1.不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。,+IEI,ESH+ICH2COOH ESCH2CO
27、OH+HI,不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。,抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。,E,v,1,2,3,1.反应体系中不加I。,2.反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。,3.反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。,I,I,竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。,特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位,+IEI,ki=EI/EI,V/2,km,2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。,km,无 I,有 I,3）竞争性抑制
28、剂的结构与底物结构十分相似。,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+I/Ki)倍，且Km值随I的增高而增大；在E固定时，当S Km(1+I/Ki),Km(1+I/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。,竞争性抑制作用的速度方程：,竞争性抑制作用的LineweaverBurk图：,非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。,无 I,V
29、/2,km,有 I,(),非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。,反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。,km,km,有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+I/Ki)倍，且都随I的增高而降低。,反竞争性抑制：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下
30、降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制作用的速度方程：,反竞争性抑制作用的LineweaverBurk图：,失活作用：抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性。研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：A.药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药 B.对生物体的代谢途径进行人为调控，代谢控制发酵。C.研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。,（二）一些重要的抑制剂,1.非专一性不可逆抑制剂A.酰化剂 二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药。与酶活性中心Ser的OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。作用机理：强烈地抑制与中枢
31、神经系统有关的乙酰胆 碱酯酶。,解磷定 对有机磷农药抑制作用的研究，已知道一些肟类或羟肟酸化合物能将有机磷化合物从酶 分子上取代下来，使已被有机磷农药抑制的胆碱酯酶有显著的活力恢复作用，这些化合物称为有机磷农药解毒剂或叫胆碱酯酶复能剂，例如解磷定（碘化醛肟吡啶）和氯磷定（氯化醛肟吡啶）都是当前抢救有机磷农药中毒病人较好的解毒药物。,B.有机汞、有机砷化合物 许多有机汞、有机砷化合物，可与酶的巯基作用。路易斯毒气 解毒剂：二巯基丙醇,C.氰化物 与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。,D.重金属 Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。E.还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖
32、醇等巯基试剂还原酶的二硫键F.烷化剂 使-SH烷化G.亲电试剂 四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。,类型：,非专一性不可逆抑制剂,2.专一性不可逆抑制剂 此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。A.胰凝乳蛋白酶的最佳底物：对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯 抑制剂：对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化。,B.自杀性底物 与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应。潜伏反应基团（latent reactive group）被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。,例：炔类化合物是以FMN、FAD为
33、辅基的单胺氧化酶的不可逆抑制剂。单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺）。由于迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，因而抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，降低血压的作用，是治疗高血压的良药。专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的专一性逆制剂，在医疗方面起到很大作用。,例：以FMN或FAD为辅酶的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂迫降灵,Kcat型不可逆抑制剂特点 与底物结构类似，但分子中还有潜伏的反应基团。当它与底物结合后，其潜伏的反应基团被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，使酶遭受抑制。此类抑制剂亦称酶的自杀性底物。,3、可逆抑制剂抗代谢物：许多和酶的底物在结
34、构上类似的化合物，往往具有抗菌抗癌的作用，如磺胺药、磺胺药中的对氨基苯磺胺，它的结构与对氨基苯磺酸十分相似，是对氨基苯甲酸的竞争性抑制剂，而对氨基苯甲酸是叶酸的一部分，叶酸是催化一碳化合物转移的（如甲酸、甲醛）、磺胺药物代替了对氨基苯甲酸以后，就失去了转移一碳化合物的功能、细菌生长繁殖就受到影响。,例：磺胺类药物及其作用机理对氨基苯磺酰胺或其衍生物对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶活性,蝶呤对氨基苯甲酸Glu,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸,四氢叶酸,嘌呤核苷酸,一碳单位,一碳单位,磺胺类药物,磺胺类药物的抗菌机理：,磺胺药通式：对氨基苯甲酸：又如：丙二酸、苹果酸、草酰乙酸等与琥珀酸
35、脱氢酶的底物很相似，都可以与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酸，从而影响到琥珀酸的脱氢反应，如果反应中增加底物琥珀酸浓度，就可把与琥珀酸结合的酶取代出来，解除或减轻抑制作用，从而保证琥珀酸脱氢酶的正常进行。,1、毒害金属酶的抑制剂：氰化物，硫化物和一氧化碳等能和金属形成较为稳定的络合物，因而使金属的酶活性受到 抑制，例如：细胞色素氧化酶中的Fe2+易被氰化物、硫化物和一氧化碳结合，使酶失活，阻抑细胞的呼吸。,另一种表述：,2、巯基酶的抑制剂：很多酶分子中的巯基是表现其功能所必须的基团，当巯基发生改变酶活力就丧失，这类酶就称为疏基酶，例如脲酶、3-磷酸甘油醛脱 氢酶、蛋白酶、-淀粉酶等都属巯基酶。巯基酶的抑
36、制剂有：过氧化氢、碘化物、砷化物、有机汞等。如对氯汞苯甲酸可以与疏基作用这类酶抑制剂可因加入过量的巯基化合物，如半胱aa或还原型谷胱甘肽（G-SH）而解除。解毒作用。,3、重金属盐毒物：重金属盐的Ag+、Cu2+、Hg 2+Pb2+Fe3+等在高浓度时能作为蛋白质沉淀剂而使酶变性失活。可用EDTA Cys、焦磷酸盐等解毒。,4、有机磷农药：主要含-OH酶的抑制剂，如二异丙基氟磷酸，农药中的敌百虫、滴滴畏、乐果等，它们能高度地抑制酯酶类的活力。对有机磷农药抑制作用的研究，已知道一些肟类 或羟肟酸化合物能将有机磷化合物从酶 分子上取代下来，使已被有机磷农药抑制的胆碱酯酶有显著的活力恢复作用，这些化
37、合物称为有机磷农药解毒剂或叫胆碱酯酶复能剂，例如解磷定（碘化醛肟吡啶）和氯磷定（氯化醛肟吡啶）都是当前抢救有机磷农药中毒病人较好的解毒药物。,第九章 酶作用的机制及调节,一、酶的活性部位,（一）酶活性部位的特征1、只占酶分子的一小部分（1%-2%）；2、是一个三维实体；3、酶和底物分子的识别过程是诱导契合；4、位于酶分子表面的裂缝内；5、通过次级键与底物结合；6、具有柔性和运动性。,酶结构与功能特点蛋白质的结构特点：一级、二级、三级、四级结构 根据结构不同酶可分为：单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成。寡聚酶：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成
38、的复合体。,与催化作用相关的结构特点(1)活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）。,结合部位(Binding site)：酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,催化部位(Catalytic site):酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。,调控部位(Regulatory site):酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用,胰凝乳蛋白酶的活性中心,活性中心重要基团:H
39、is57,Asp102,Ser195,为Tyr 248为Arg 145为Glu 270为底物,(2)必须基团：酶表现催化活性不可缺少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。,亲核性基团,酸碱性基团,诱导嵌合学说,“锁钥学说”（Fischer，1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。,诱导嵌合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，
40、使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。,酶的结构与功能的关系,活性部位和必需基团,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,二、判断和研究活性中心的主要方法（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法,三、酶催化作用的机理,（一）酶的催化作用与分子活化能,化学反应自由能方程式G=H-TS,（G是总自由能的变化，H 是总热能的变化，S
41、是熵的变化）,当G0，反应不能自发进行。当G0，反应能自发进行。,活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。,促使化学反应进行的途径：用加热或光照给反应体系提供能量。使用催化剂降低反应活化能。,酶催化作用的本质：就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。,（二）酶催化作用的中间产（络合）物学说,在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。中间产物存在的证据：1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化
42、物酶与过氧化氢结合）。,1、中间产物学说,2.酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）(1)锁钥假说(lock and key hypothesis)：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样(2)诱导契合假说（inducedfit hypothesis):该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,（三）使酶具有高催化效率的因素,酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。,邻近定向效应：酶与底物结合成中间产物过
43、程中，底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。,邻近效应与定向效应对反应速度的影响：使底物浓度在活性中心附近很高酶对底物分子的电子轨道具有导向作用 酶使分子间反应转变成分子内反应 邻近效应和定向效应对底物起固定作用,酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。底物扭曲、变形，利于形成ES复合物。底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。,2.“张力”与“形变”：酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。,3.酸碱催化：,酸-碱催化可分为狭
44、义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。,蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基。,广义酸基团 广义碱基团（质子供体）（质子受体）,影响酸碱催化反应速度的两个因素：酸碱强度（pK），组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快，半寿期小于10-10秒,4.共价催化：酶通过与底物形成
45、反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,Lewis的酸碱电子理论：酸是可以接受电子对的物质，而碱则是可以提供电子对的物质，前者是亲电物质，后者是亲核物质。共价催化又称亲核或亲电子催化。实际上也是酸碱催化。,Ser-OH,Cys-SH,His-咪唑基,亲核物质,亲电物质,5.微环境的影响,酶的活动中心由于微环境的影响，存在高浓度的酸和高浓度的碱，可以有多种催化方式的环境有利于反应的进行。疏水
46、环境 介电常数低，可加强极性基团间的反应。电荷环境 在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子,（四）酶与反应的过渡态互补,酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。,（五）抗体酶（abzyme）,即是抗体又具有催化功能的蛋白质，是具有催化活性的抗体。,五、多酶体系与酶活性的调节控制,（一）多酶体系（二）酶活性的调节控制和调节酶 1、别构效应的调控 2、可逆共价修饰的调控（共价调节酶）3、酶原的激活 4、专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制,（一）多酶体系,1、多酶体系及其分类多酶体系：在完整细胞内的某一
47、代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。可溶性的（分散性的）结构化的（多酶复合体）在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）,2、多酶体系的自我调节,（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着全部反应序列的总速度。（2）反馈抑制与底物激活 催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活,（二）酶活性的调节控制,非共价调节酶的变构调节共价调节：不可逆共价调节 酶原的激活可逆共价调节 酶的共价修饰,1、别构效应的调控别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子
48、的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。,同位效应（同种效应）：别构蛋白与一种配基的结合对于和后续同种配基结合能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应，也可能指别构部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰。异位效应（异种效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。,（正）协同效应：一种配基的结合促进后续配基的结合，S型结合曲线。负协同效应：一种配基的结合抑制后续配基的结合。正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物
49、。,(1)天冬氨酸转氨甲酰酶Aspartate transcarbamoylase(ATCase),ATCase 的别构效应（ATP是激活剂而 CTP是抑制剂）,ATCase的动力学曲线,CTP和 ATP对ATCase调节的生物学意义,ATP的激活作用，提供复制的能量，导致DNA需求的嘧啶核苷酸的合成；CTP的反馈抑制，则保证嘧啶核苷酸充足时，不需要该途径继续合成N-氨甲酰天冬氨酸及其后续中间物。,（2）ATCase由催化亚基和调节亚基构成,P-羟汞苯甲酸对ATCase的修饰作用：失去调节活性但催化活性不变。ATCase 是由两组 催化亚基(catalytic subunit,CCC)以及三组
50、 调节亚基(regulatory subunits,RR)组成；每组催化亚基由三条蛋白质组成(C,34 kD)，每组调节亚基由两条蛋白质组成(R,17 kD)：2(CCC)3(RR)C6R6,ATCase的亚基组成,（3）ATCase的三维结构三个调节二聚体在一个赤道面上，一个催化三聚体在赤道面上边，另一个催化三聚体在赤道下边。有一个大的居中洞穴。,E.coli的ATCase的亚基排列,A、三重对称轴的俯视 B、垂直观,ATCase半分子（C3R3)的结构,半分子中的单位，彼此旋转120度。每一个在外周的链上有2个结构域，外面的是CTP结合部位，里面的是与相同三聚体中的催化链相互作用的部位。具
