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1、2023幽门螺杆菌毒力因子基因型和儿童胃十二指肠疾病的关系摘要目的探讨幽门螺杆菌(Hp)毒力因子基因型与儿童胃十二指肠疾病、胃黏膜病理学改变程度的关系。方法回顾性队列研究。研究时间为2020年5至10月，研究对象为2012年4月至2014年12月因消化道不适症状就诊于浙江大学医学院附属儿童医院，胃镜检杳确诊为胃十二指肠疾病、胃黏膜Hp培养阳性的68例患儿的冻存菌株。复苏Hp菌株提取DNA后进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，确定细胞毒素相关蛋白A(CagA)、空泡细胞毒素A(VaCA)(s1a、Slbs2,m1m2)、外膜炎性蛋白A(OiPA)、血型抗原结合黏附素(babA2)、十二指肠溃疡促进因
2、子A(dupA)基因的检出率，对OiPA基因进行测序，判定基因状态。根据胃镜诊断结果、胃黏膜病理结果进行分组，分析各毒力因子基因型的检出率在不同组患儿之间的差异，组间比较采用*检验或FiSher确切概率法。结果完成基因测定的68株HP菌株来自68例Hp感染的胃十二指肠疾病患儿，根据胃镜诊断结果分为浅表性胃炎47例和消化性溃疡21例。根据胃黏膜病理炎症程度分为轻度8例和中重度60例，按胃黏膜病理炎症活动性分为活动性组61例和无活动性组7例I)cagA、vacA、vacAs1/m2、功能性oipA、babA2和dupA6种毒力因子基因的检出率分另!为100%(68/68)、100%(68/68)、
3、94%(64/68)、99%(67/68)、82%(56/68)、71%(48/68);6种毒力因子基因在浅表性胃炎组检出率分别为100%(47/47)、100%(47/47)、96%(45/47)、98%(46/47)、81%(38/47)、70%(33/47),在消化性溃疡组分另U为100%(21/21)、100%(21/21)、90%(19/21)、100%(21/21)、86%(18/21)、71%(15/21),各基因型检出率在两组患儿间差异均无统计学意义(均P005)；6种毒力因子基因在胃黏膜炎症程度轻度组分别为8/8、8/8、8/8、7/8、7/8、5/8,在胃黏膜炎症程度中重度
4、组分别为100%(60/60)、100%(60/60)、93%(56/60)、100%(60/60)、82%(49/60)、72%(43/60),各基因型检出率在两组患儿间差异均无统计学意义(均Qo.05);6种毒力因子基因在胃黏膜炎症活动性组分别为100%(61/61)、100%(61/61)、93%(57/61)、98%(60/61)、82%(50/61)、72%(44/61),在无活动性组分别为7/7、7/7、7/7、7/7、6/7、4/7,各基因型检出率在两组患儿间差异均无统计学意义(均QO.05)。4种或5种毒力因子基因阳性组合检出率在不同组患儿之间的差异均无统计学意义(均QO.05
5、)。结论cagA、vacAxVaCASI/m2、功能性OiPA、babA2、dupA基因与儿童浅表性胃炎和消化性溃疡及胃黏膜病理炎症程度和活动性的关系均不明显；cagA、vacA、oipAsbabA2、dupA的不同基因组合对于预测儿童Hp感染的临床结局没有显著作用。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种感染胃、十二指肠的常见病原体，全球感染率50%以上。HP可能引起胃炎、消化性溃疡、胃癌和黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等各种消化道疾病。Hp感染后的临床表现是细菌毒力、宿主胃黏膜、环境因素相互作用的结果。研究较多的HP毒力因子有细胞毒素相关蛋白Ncytotoxin-assoc
6、iatedproteinA,cagAX空泡细胞毒素A(vacuolatingcytotoinA,vacA)、十二指肠溃疡促进因子A(duodenalulcerpromotingproteinA,dupA)、外膜炎性蛋白A(outerinflammatoryproteinA,oipA)、血型抗原结合黏附素(bloodgroupantigenbindingadhesin,babA)等。cagA蛋白通过IV型分泌系统的菌毛结构注入宿主细胞，通过多种机制参与胃癌的发生。vacA蛋白产生空泡毒素，导致宿主细胞空泡形成和组织损伤，vacA基因中有2个主要可变区域，即信号(三)区域(s1a、Slb和s2)和
7、中间(m)区域(ml和m2)。dupA蛋白可增加十二指肠溃疡的风险，但其致病作用尚存争议Jdowu等的研究未发现dupA蛋白与消化性溃疡疾病之间存在关系。OiPA蛋白是一种参与黏附的外膜蛋白，OiPA基因的功能状态似乎与胃病的发展有关。babA蛋白是一种外膜黏附蛋白，在细菌附着中起着至关重要的作用,babA基因有3个等位基因babA1、babA2和babB),但只有babA2基因是胃上皮和宿主细胞上Lewis-b血型抗原结合活性的活性基因。HP毒力因子与胃十二指肠疾病的关系仍有争议，且有关研究多集中在成人，本研究分析HP毒力因子基因型和儿童胃十二指肠疾病、胃黏膜病理学改变程度的关系。对象和方法
8、一、对象回顾性队列研究。研究时间为2020年5至10月，研究对象为2012年4月至2014年12月因腹痛、腹胀、纳差、恶心、呕吐、胸闷、消化道出血等消化道不适症状就诊于浙江大学医学院附属儿童医院68例患儿。取其胃黏膜HP培养阳性后-80。（:保存的HP菌株。入选标准：（1）就诊时胃镜检查确诊胃十二指肠疾病、胃黏膜送检病理且胃黏膜Hp培养阳性，保存Hp菌株成功复苏；（2）有完整的临床资料。排除标准：（1）检查前4周内服用过抗菌药物、例、剂和质子泵抑制剂等对Hp检测结果有影响的药物的患儿。（2）严重心、肝、肾功能损伤者。本研究经过浙江大学医学院附属儿童医院医学伦理委员会批准（2020-IRB-14
9、9）,并豁免知情同意。二、方法1胃黏膜病理学改变程度诊断标准：参照慢性胃炎及上皮性肿瘤胃黏膜活检病理诊断共识判断炎症程度及活动性：（1）炎症程度分3级：轻度为炎症细胞浸润较轻，多限于黏膜的浅表1/3,其他改变均不明显；中度为病变程度介于轻、重之间，炎症细胞累及黏膜全层的浅表1/32/3;重度为黏膜上皮变性明显，且有坏死、胃小凹扩张、变长变深、可伴肠腺化生，炎症细胞浸润较重，超过黏膜2/3以上，可见固有膜内淋巴滤泡形成。（2）炎症活动性：固有膜见中性粒细胞浸润为活动性，否则为无活动性。167(JHJttno.AttWGrHI，叩4信m*到1序列c项毋例秋ATGAaAAMicrrT:TT“havr
10、rcrcnmr11mcMrr7M3+1onWATGAAAAAGCTCTCTrAcTAMjlKrnTrlnTnTnG(XJntATGCrGAAMlINtIATGAtKCCC11T3：TAVT仃；TnTTtT，；TnTlXXrruACGCTGMH1119ATGAAAAAUtamTTAcrAUJcrCrnTraTnTnGCCTCCAaxTCAAMlmIA1AAAAAACCCnmAGCTcTeTTmVrC(1111;GcnXACGLTGAA3*14HlIATGAAAA4A“工：CnTrAEEE；TCrrnW；TrrTM“g：AUiCH.4A2*l*l*lIHlIlAMicrrrrAtlUTiLP;iw
11、TLrn;rrrr.(;ijiicac31111;*a2*lllIHliAIX.AAAA(XITC1X：TTAcTAV.TCTCrnUrcrumT11.I4JMICAC(i-T(.AA3+24Nl3ATaA11T:TTAcTAV：T：TGTn711:TumT11;TCTU；A(；(“TGAI外工MIATGA4AAAAGCTCTinTQCTAMJl11l11LIE11T11TMXrT:A*：TGA*MaHHtIAZ；*AAAAMt11VI,CA：UnjrnVJxJ：；TnN乂；CnAACCcIX；AA3+2N*IATGAAANM冗CnTMolnTEGT13口CT(X；TnTMXrnKAajcTG
12、AA2+3n2ATIiAAAAA1J(11TLTV11TCC11TirTIiTTTTXT11:A11：T.AA2*2+14Wl2ATGAAAAAACCCrrrlAC1111TT11W11:TenX11T11G;Cn：CA(XcTBAA2*2*2N*IAIN；*AAAAMirrcixm(X1TCT111111：.T(711；：H：(：l.11l；A6mIaim.am3ruurcjvv.(,iTrn,X.11-.*-(.11.AA4*2IN*IA1M.AAAAXrn：1X：1T4CH：IrTlACEXT，.TX.T11T(.M7111CCKTLAA51mI注mia为外餐晚件at白a；Fvl线&市h
13、4四口“电植式的序卦2实验方法：（1）对冻存菌株成功复苏后提取DNA:使用DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），经过裂解、结合、洗涤、洗脱等步骤，提取菌株DNA,将提取的菌株DNA上清液标本置于-80冰箱保存备用。（2）对菌株DNA标本进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳，判定是否存在cagA、vacA（s1axSlbs2,m1m2）、OiPA、babA2、dupA基因。（3）基因测序：送测序公司（派森诺生物）测序，测序仪器为ABI3730测序仪，对OiPA基因进行测序，测定5信号肽中的CT二核昔酸重复数，以确定基因状态（Orl或。ff）,OipA基因由影响阅读框的5信号肽中的CT二核昔酸重复数
14、通过滑动链错配系统调节OiPA蛋白的表达,滑动链错配系统代表了一种以核昔酸插入或缺失为特征的现象，负责OiPA基因的相位变化，当功能性蛋白质表达时,基因状态被指定为on,而非功能性蛋白质的表达时，基因状态被指定为。ff，3分组和分析：根据胃镜诊断结果将患儿分为浅表性胃炎组和消化性溃疡组，根据胃黏膜病理炎症程度分为轻度组和中重度组，根据胃黏膜病理炎症活动性分为活动性组和无活动性组，分析各毒力因子基因型的检出率在不同组患儿之间的差异。三、统计学处理应用SPSS26.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以元5表示，计数资料以例（%）表示，组间比较采用*检验或Fisher确切概率法，以双侧
15、P0.05为差异有统计学意义。结果一、一般资料68例Hp感染的胃十二指肠疾病患儿培养出68株HP菌株，68例患儿中男52例、女16例，诊断年龄（9.42.9）岁。根据胃镜诊断结果，分为浅表性胃炎组47例、消化性溃疡组21例。根据胃黏膜病理结果，按炎症程度分为轻度8例、中重度60例；按炎症活动性分为活动性61例、无活动性7例。二、HP毒力因子基因型检出情况1.Hp各毒力因子基因型的PCR电泳结果：cagA、vacAxOiPA、babA2和dupA基因型的检出率分别为100%(68/68)、100%(68/68)、100%(68/68)、82%(56/68)、71%(48/68)。VacA分型如下
16、:s1a100%(68/68)、m294%(64/68),故vacA基因优势亚型为vacAs1m2,未检测到VaCASIb、S2、m12毒力因子OiPA基因的测序结果：OiPA基因检出率为100%,其中67例(99%i67/68)OipA基因为功能性，见表1。功能性OipA基因共鉴定出9种CT二核昔酸重复模式：3+1、2+1+1+1、3+2、2+3、2+2+1、2+2+2、6、4+2、5+2,其中3+1个CT重复的模式最常见(61%,41/67)。如在序列的5信号肽功能片段出现早期终止密码子(TAA/TGA/TAG)意味着基因-蛋白质翻译的功能过程被关闭，另1例患儿OiPA基因5信号肽功能片段
17、出现早期终止密码子TAA,判定为非功能性OiPA,基因测序如下：AtgaaaaaaacccttttactaactctctttttctcgctctggctccaCgctgaaaggaatggatgttatttaggtttaatttttgcttaa0三、HP毒力因子基因型在不同组患儿的检出率1儿童胃十二指肠疾病Hp毒力因子基因型的分布：毒力因子基因cagAxvacAvvacAs1m2x功能性OiPA、babA2和dupA在浅表性胃炎组及消化性溃疡组的检出率见表2,各毒力因子基因检出率在两组患儿差异均无统计学意义(均40.05)。68例患儿中31例患儿检出4种HP毒力因子基因阳性组合，36例患儿检出
18、5种HP毒力因子基因阳性组合，另1例患儿检出3种Hp毒力因子基因阳性组合。4种、5种毒力因子基因阳性组合检出率在浅表性胃炎组分别为48%(22/46)、52%(24/46),在消化性溃疡组分别为43%(9/21)、57%(12/21),4种或5种毒力因子基因阳性组合检出率在浅表性胃炎和消化性溃疡的差异无统计学意义(=0.14,P=O.705)。表2不网一卜二指腼欣病川患儿妣门螺杆菌各磁力因f柒因型的检出物例(/)撤副例败r“A%artarAlm2a+-*-on碗+-+-浅衣件胃炎组4747(100)047(100O45(96)2(446(98)1(2388l)9(19)33018(86)3(1
19、4)I5(7l6(29Mift-0.01Pfft-0.S821.0000.7420.919性tc*eA为IlIKthtlfl大量r|A:QrA为空泡编胞奇索A.im2J其等位Et*h0.05),见表3、4o4种或5种毒力因子基因阳性组合检出率在胃黏膜病理学改变(炎症程度、活动性)的差异均无统计学意义(均e005),见表5。3不同0粘膜病理炎症附度组忠儿峨号杆Pl因f眩因型的检出率例坦别例数4,必“M*arA*lm2IIMhA2iup*-+-+=mffWttffiHK0mQ昌07I7I53中不度岁6060(100)0MMlOO)056(93)4(7)60(100)049，做-1.0000.118
20、1.00.685注:，MA为帆制#*相关最门AcmA为曰泡阳。*A.Wm2是凡等位IK人;i，A为外拱炎性褪门A:hdA2为血乜捕蛛冷禁附*:小A为I.指瞒滞瘠住进因干Ak为未遇打缆计学分析.氽均为Fz*r面1h率法:例故少干20的不计算仃分比*4不同胃黏股利理活动性组忠儿由门螺H的各掾川Tf丛因型的检出审,例(%)组刑例敢!SgAorAa*lm2ZpAIMlbA2山中A-+-+-(MilET+-活动性组6161(100)O61(100)057(93)4(7)6M9l1(2)5X82)ll(8)44(72)17(JO)无活动性祖77O707O7O6143值1.000IIXN)1.0000.41
21、1注:CMA方出1#(雄泰HlJtafllAK炉；，：池敏胞#*A.n2EJItGKiM”叩A力外膜SHiai门A5ubA2力llH抗峨结介黏m*；1.PA*卜.48MRaH8ia典干斯-为未、行Suf学分析.余均为FMhr9切n率法:n敢少F20的不计算百分It5不同胃黏膜病理学改变程度患儿幽门螺杆菌各毒力因子星因阳性组合的检出率例(%)1棒因子基因-N-;.阳性组介轻度中重度有无(8例)(59(60例)(7例)4种526(44)27(45)45种333(5633(55)3P值0.4560.696注：去除I例仅检出3种毒力因子基因阳性组合的浅衣性胄炎患儿;例数少于20的不计算百分比讨论儿童感
22、染HP后大多数没有症状，儿童期HP感染与胃炎、消化性溃疡有关。HP感染患儿内镜下可呈现结节性胃炎的改变。有研究报道儿童巨大消化性溃疡与HP的感染关系密切。与成人不同，儿童感染后引起胃十二指肠溃疡并不常见，5%的HP感染患儿可合并消化性溃疡，通常在感染后不久发生，因此其发病机制很可能较少依赖于环境因素,而菌株毒力因子的作用更重要。本组患儿均感染了CagA基因阳性菌株，这与其他亚洲国家和中国成人的研究类似，与江西地区儿童研究结果一致，然而西方国家的cagA基因阳性株接近60%o本研究显示CagA基因阳性率与儿童不同胃十二指肠疾病、胃黏膜病理学改变程度无明显关系。本组患儿均感染了VaCA基因阳性菌株
23、，VaCA基因优势亚型组合为s1m2(94%),但与不同胃十二指肠疾病无明显关系，这一结果与中国成人的研究和江西地区儿童研究结果类似，与胃黏膜炎症程度和活动性亦无明显关系。babA、OiPA基因均属于外膜蛋白家族基因，本研究显示，患儿Hp毒力因子babA2,OipA基因的阳性率分别为82%、100%,功能性QipA基因的阳性率为99%,67例功能性OiPA基因序列中，共发现了9种不同的CT重复模式，最常见的CT模式为3+1,与中国一项成人的研究相似。本研究显示babA2、功能性OiPA基因的阳性率与儿童胃十二指肠疾病、胃黏膜炎症程度和活动性关系不大。dupA蛋白首次被认为是Hp特异性疾病的标志
24、物，可诱导十二指肠溃疡并抑制胃癌，但尚存争议。在不同的地理区域dupA基因的检出率不同，如南非为85%,比利时为44%,美国为70%,结果显示dupA基因与十二指肠溃疡关系不大。本研究71%的患儿感染了dupA基因阳性菌株，研究显示dupA基因的阳性率与儿童胃十二指肠疾病、胃黏膜炎症程度和活动性亦无明显的关系。Hp是已知基因多样性最高的细菌种类之一。毒力因子与胃十二指肠疾病之间的关系存在争议。本研究也存在一定的局限性：(1)保存的菌株标本来源于2012年4月至2014年12月，共68例，数量相对较少.(2)仅研究有限的cagA,vacA(s1a、s1bs2,m1m2)、oipA、babA2、dupA基因型，尚未研究其他毒力因子基因型和儿童胃十二指肠疾病的相关性。(3)本研究为单中心研究，需后续的大样本多中心研究进一步验证。基因与儿童浅表性胃炎和消化性溃疡及胃黏膜炎症程度和活动性均无明显的关系；cagA、vacA、oipAxbabA2xdupA的不同基因组合对于预测儿童Hp感染的临床结局没有明显作用。
