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1、分子病理检测在神经肿瘤治疗中的应用,一、什么是分子病理二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗三、分子病理检测常用技术四、介绍两种分子病理检测在脑胶质瘤治疗中的应用1、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子甲基化的检测2、染色体1p/19q 杂合性缺失的检测,一、什么是分子病理,分子病理是近些年在传统组织病理学的基础上结合了分子生物学及分子遗传学的研究成果,并采用相关的分子生物学技术逐渐发展完善起来的交叉学科。,一、什么是分子病理,研究内容：病理学包括运用分子和遗传学方法对肿瘤进行诊断和分类；设计和验证对
2、治疗反应和病情发展的预测性生物标记物，不同的基因构成造成的对肿瘤的个人易感性，依此了解肿瘤细胞的转移侵袭性及对抗化疗和放疗的可能性等信息，为临床医生提供有价值的资料，从而做到有针对性的个体化综合治疗；还有测试环境因素和生活方式对肿瘤发生的影响。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,肿瘤的发生和发展是多因素参与的、多步骤的过程。关键调控基因的突变导致了基因表达的失衡从而引起相关蛋白水平改变，最终导致肿瘤的发生。在致癌基因主导的情况下，细胞恶性增殖，阻止了正常细胞的分化和凋亡，最终导致肿瘤的发生。而抑癌基因编码的蛋白对细胞的负性调控作用则大大降低，最终导致肿瘤的发生。,二、分子病理检测与神经系统肿
3、瘤治疗,神经系统分子病理研究热点:分子病理学检测找到与神经肿瘤治疗、预后相关的因子，探索致癌基因与抑癌基因在放疗和化疗药物作用下的反应，为临床肿瘤治疗提供指导，实现个体化治疗。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,表皮生长因子受体(EGFR)目前研究最多的靶点，许多神经肿瘤出现EGFR基因扩增，在1/3 的脑胶质母细胞瘤中EGFR表达增加。研究表明表皮生长因子和EGFR与癌细胞的增殖、分化、侵袭性生长密切相关。对于那些EGFR基因扩增的患者可以均可给与针对EGFR的分子靶向治疗的药物来影响影响癌细胞的信号传递系统，从而抑制癌细胞的增殖、分化、侵袭性生长。可明显提高患者的生存质量并改善患者的症状
4、。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,针对的EGFR的分子靶向治疗的药物可分为两类，均取得不错的治疗效果。一类是酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，与细胞内酪氨酸激酶结合并其功能抑制，TKI已于2003年在美国上市，2005年在我国上市；另一类是人工合成的单克隆抗体(MAb)，可与EGFR的细胞外结合区域结合，从而阻断配体与EGFR的结合与活化，MAb已于2004年在美国上市。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,p53突变 星形细胞瘤弥漫浸润性生长，手术很难做到全部切除，术后容易复发，肿瘤的恶性程度可能升级。分子病理研究表明，这类患者的预后并不完
5、全相同。关键基因是位于17染色体短臂p53发生突变。年轻的胶质瘤患者，p53发生突变，对放疗与化疗相对敏感，相对存活期长；而伴随EGFR过度表达的胶质母细胞瘤的老年患者，对放疗与化疗反应差存活期短。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,ki-67 是一种细胞增殖核抗原，目前较为肯定的核增殖标志。分子病理检测，ki-67表达阳性，说明胶质瘤处于S期（DNA复制期）细胞较多，这类患者不宜于直接术后放疗，而应先选择对S期细胞敏感的化疗药物，杀灭S期细胞后，再进行放疗。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,血管内皮生长因子受体 肿瘤的生长依赖肿瘤血管供应营养。阻断血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略。随着
6、人们对肿瘤血管形成机制的了解，针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的抗血管生成治疗策略，已成为目前肿瘤治疗的热点研究领域，许多抑血管生成剂已进入临床试验。PTK/ZK是口服的VEGFR（vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）酪氨酸激酶抑制剂，有抗肿瘤活性。,整合素（integrins）参与介导细胞与细胞外基质的粘附、细胞迁移、侵袭及新生血管形成。国内外研究表明整合素3在人脑胶质瘤有明显表达，且随着胶质瘤病理级别升高表达 水平随之明显升高。Vander 等发现某些血管生成抑制剂对能抑制内皮细胞形成管道，而对VM管状结构无影响。提示VM和新
7、生血管生成有不同的机制。VM 的肿瘤治疗措施自然也成了人们倍感兴趣的领域。利用分子生物学检测找到这些VM 血管生成机制将会提供有效的肿瘤治疗手段。,无血管内皮细胞被覆的、由细胞外基质界限的管腔，称为血管生成拟态（VM）。,二、分子病理检测与神经系统肿瘤治疗,从以上与神经肿瘤治疗相关的基因和分子来看，找到影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成、侵袭和转移的药物相关基因和相关分子，针对这些特异的基因和分子特点采取个体化治疗对治疗神经系统肿瘤有很大优势。,小结：,三、分子病理检测常用技术,基因缺失和扩增的检测：基因缺失主要表现是DNA序列的丢失，基因扩增主要表现为基因拷贝数的增加。应用普遍的为组织细胞原
8、位核酸分子杂交，包括原位杂交、荧光原位杂交、对比基因组杂交。近年荧光原位杂交在肿瘤分子诊断中有重要的应用。,三、分子病理检测常用技术,基因过表达产物的检测：蛋白质的检测最常用的方法为免疫组化技术，新一代测定方法为流式细胞仪法，更新的影像细胞测试法则可应用特定波长的光密度进行积分，进行特定蛋白质的定量分析。,三、分子病理检测常用技术,基因突变检测：1985年以前，主要应用Southern杂交，可筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式，对于不能用该法检测的突变，也可用序列测定分析，但复杂费时。目前大部分基因突变检测技术都是以PCR为基础，已达20余种，比较成熟的技术包括PCR-SSCP法、杂合
9、双链分析法、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、DNA芯片技术、比较基因组杂交法和DNA序列分析等。,四、介绍两种分子病理检测在脑胶质瘤治疗中的应用,成人中最常见的脑肿瘤是恶性胶质瘤，即使在积极地外科手术和放射治疗后，死亡率平均一年。但临床上也发现同一种恶性胶质肿瘤有着两种或者多种截然不同化疗敏感度和预后。为找到原因许多学者进行大量研究。目前明确，患者两种肿瘤基因的改变是造成恶性脑胶质瘤临床治疗预后差异的主要原因：MGMT启动子甲基化 染色体1p/19q杂合性缺失,四、介绍两种分子病理检测在脑胶质瘤治疗中的应用,甲基化特异性PCR法检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6
10、-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子甲基化的检测。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH)检测染色体1p/19q 杂合性缺失。,MGMT启动子甲基化,MGMT是一种从细菌到哺乳类动物机体中都存在的独特的DNA修复蛋白，MGMT能够修复被化疗药物烷基化的鸟嘌呤，增加了肿瘤细胞对这些药物的耐药性。许多研究资料已经证实，MGMT在胶质瘤组织中表达增多明显减弱亚硝基脲类抗肿瘤药物的治疗效果。,MGMT启动子甲基化,Hegi等研究表明：对脑胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化的患者采用放疗
11、联合替莫唑胺化疗，其生存期明显变长。MGMT基因启动子甲基化状态与肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性密切相关，脑胶质瘤组织中MGMT基因启动子甲基化的患者临床预后较好。,MGMT启动子甲基化,通过检测脑胶质瘤MGMT基因启动子甲基化状况，推测脑胶质瘤对烷化剂类化疗药的敏感性，为在分子水平制定肿瘤化疗的个体方案提供了一定的参考。这成为判断脑胶质瘤患者预后和预测肿瘤对烷化剂化疗耐药性的标志分子。,MGMT启动子甲基化,检测基因甲基化的经典方法：甲基化特异性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为
12、尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应（PCR）扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，如果处理后甲基化DNA 链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化。,注意:控制DNA量（DNA量过多假阳性；DNA量过少假阴性）,甲基化特异性PCR操作步骤：,PCR仪,MGMT启动子甲基化,1、只能进行终点检测。2、扩增产物需要跑胶和手工收集数据和后期处理。3、实验在一个开放的系统完成，可变因素和人为因素增加。4、灵敏度很低。这种方法只能粗略定量甲基化的程度，对于临床诊断的意义比较低，检侧重现性差，目前很少用于临床检测。,问题,MGMT启动子甲基化,
13、目前推荐的方法是高分辨率熔点曲线分析法（HRM,High-Resolution Melting Analysis）：自Wojdacz TK 等人2006年多次报道用来诊断MGMT甲基化以来，HRM是公认的快速、准确、相对低成本检测DNA甲基化的方法，已成为目前推荐使用的诊断DNA甲基化的方法。它是一种闭管方法，不需要跑胶和手工收集数据，PCR 反应产物无需离开反应管即可直接进行检测,减少了外界污染的机会，增加了结果的可靠性。,HRM法原理,对于甲基化较多的PCR产物，GC含量高，Tm值较高,甲基化的胞嘧啶（C）,未甲基化的胞嘧啶（C）,注意:控制DNA量（DNA量过多假阳性；DNA量过少假阴性
14、）,甲基化特异性HRM操作步骤:,对于甲基化较多的PCR产物，GC含量高，Tm值较高,MGMT启动子甲基化,HRM方法需一台实时荧光PCR仪1、试剂相对便宜，相比于传统的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量灵活（最多一次筛查384个样本，最少几个样本）;2、并且准确率大大提升。可以检测出样本DNA 中微量甲基化的部分(甲基化DNA 仅占0.1%1%);3、另外该方法检测所需时间短,现在在2 到3 小时之内拿到数据已经成为可能;,小结：,检测染色体1p/19q缺失,少枝胶质细胞瘤(Oligodendroglioma，OG)显示特异性的基因改变，可以与其他类型胶质瘤区别，对于诊断、治疗以及判断预后都
15、有很重要的意义，是脑肿瘤中第一个应用分子病理诊断指导治疗的肿瘤。最常见的基因改变是19号染色体长臂（19q)的杂合子缺失，发生率为5080，其次是1号染色体短臂(1p)的杂合子缺失，发生率为4092。,检测染色体1p/19q缺失,1998年，Caimcross等报道了1p/l9q杂合性缺失具有较长的生存期。44例间变性少枝胶质细胞瘤，存在染色体1p/19q杂合性缺失的皆对PCV（甲基苄肼、环亚硝脲、长春新碱）方案敏感。50患者平均生存期为10年，而无1p/19q LOH者平均生存期仅为2年。,检测染色体1p/19q缺失,随后许多学者的研究都为利用少枝胶质细胞瘤分子遗传学特征来评价放化疗的疗效提
16、供了有价值的信息。1p/19q杂合性缺失预后较好，对PCV化疗 敏感。1p单独缺失少见常预示需要放疗与化疗相结合。认为19q缺失可以认为预示肿瘤向好的方向发展。运用荧光原位杂交（FISH）检测技术检测肿瘤1p和/或19q等位基因的单独或联合缺失对少枝胶质细胞瘤的诊断、治疗和预后的判断有积极意义。,检测染色体1p/19q缺失,FISH：荧光原位杂交（Florescence In-situ Hybridization FISH）是用荧光素标记而进行检测的特异性原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计算，最终通过荧光信号的颜色和数目的异常与否，达到疾病诊断的目的。可在石蜡白片上进行而且分辨率较
17、高。,检测染色体1p/19q缺失,注：检测方法1分别使用两组探针：1)1p36/1q21：1p36标记为红色，1q21标记为绿色；2)19q13/19p13：19q13标记为红色，19p13标记为绿色。2经重复实验，随机计数细胞数量（200个左右），统计红绿荧光信号比值（Ratio）。,图1 1p36/1q21,图2 19q13/19p13,分子诊断技术是肿瘤分子病理研究具有划时代意义的检测手段，目前，神经分子病理在有些较大的神经肿瘤治疗中心，已在广泛应用，并作为传统组织病理诊断的重要补充。肿瘤细胞是一种异常细胞，这种异常细胞在基因水平上的改变使其表达发生紊乱，同一类肿瘤的生物学行为的个体差异较大，在制定综合治疗方案与判断预后标准方面存在很多困难。,总结,在这里，需要我们共同努力，坚持分子病理以常规的HE染色为基础，配合染色体和基因检测，加强神经肿瘤的分子病理研究，促进其与临床紧密结合，希望依据分子病理检测采取个体化综合治疗方案，以提高神经肿瘤疗效。,
