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1、ICS65.020.30CCSB44实验动物学会团体标准T/CALASxxx-202x实验动物绿脓杆菌RPA检测方法1.aboratoryanimal-RPAforexaminationofPseudomonasaeruginosa（征求意见稿）202x-xx-xx 发布202x-xx-xx实施中国实验动物学会发布,Z.,刖百本规范由国家病原微生物资源平台建设项目提出。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本标准附录为资料性附录。本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物
2、标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：吉林大学、南方医科大学、中国医学科学院医学实验动物研究所、中国食品药品检定研究院。本文件主要起草人：高飞、朱玉峰、袁宝、张西臣、张楠、向志光、苏磊、付瑞。实验动物绿脓杆菌RPA检测方法1范围本文件规定了实验动物绿脓杆菌RPA的检测方法。本文件适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔绿脓杆菌的检测；实验动物怀疑本病发生:实验动物接种物：实验动物环境和动物源性生物制品中绿脓杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有
3、的修改单)适用于本文件。GB14926.422001实验动物细菌学检测标本采集SN/T3223动物传染病PCR检测技术确认规范3术语和定义及缩略语以下术语、定义及缩略语适用于本文件。3.1 术语和定义3.1.1 实验动物Laboratoryanimal专门培育供实验用的动物,主要指作为医学、药学、生物学、兽医学等的科研、教学、医疗、鉴定、诊断、生物制品制造等需要为目的而驯养、繁殖、育成的动物。3.1.2 重组酶聚合酶扩增Recombinasepolymeraseamplification,RPA在恒温3742C条件下，模拟体内核酸复制机制，由各种蛋白酶参与，帮助DNA聚合酶复制DNA,以实现D
4、NA的等温扩增，反应产物以指数级增长，整个反应一般在20-3Omin内获得可以检测水平的产物。3.1.3 绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa又称铜绿假单胞菌，本菌是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，呈对或短链状排列，在普通培养基上可以生存,并能产生水溶性色素，如绿脓素与带荧光的水溶性荧光素。3.2缩略语DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)PBS磷酸盐缓冲液(PhOSPhatebufferedsaline)Ct值荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(cyclethreshold)4原理RPA反应时引物
5、与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链DNA进行定位，完成定位后发生链交换形成D-环状结构,使DNA结合蛋白与单链DNA链绑定。随后DNA聚合酶识别复合物中重组酶解离引物后暴露的3端，进行片段扩增，形成两条新的双链DNA,如此循环从而完成对目的片段的扩增。反应结束后回收DNA,用琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。5主要试剂和器材5.1 试剂除特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。5.1.1 DNA提取试剂：细菌DNA提取试剂盒或其他等效产品。5.1.2 TwistAmpBasicRTKit检测试齐IJ盒。5.1.3 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.02molL,pH7.2),配
6、制方法见附录A。5.1.4 DEPC去离子水。5.1.5 琼脂糖。5.1.6 50TAE电泳缓冲液，配制方法见附录A。5.1.7 DNA相对分子质量标准：1002000bp(MarkerDL2000bp)。5.1.8 溟化乙锭(EB)：IOmgZmL,配制方法见附录A,或其他等效产品。5.1.9 1.5%琼脂糖凝胶，配方见附录A。5.1.10 NAC液体培养基。5.1.11 NAC琼脂培养基。5. 2器材5.1.1 恒温水浴锅。5.1.2 电泳仪。5.1.3 凝胶成像系统。5.1.4 台式低温高速离心机(4,12000rmin)。5.1.5 涡轮振荡器。5.1.6 电子天平,感量0.01go5
7、.1.7 高压蒸汽灭菌器。5.1.8 冰箱，-20、-80。5.1.9 生物安全柜。5.1.10 超净工作台。5.1.11 电动匀浆器5.1.12 移液器(200Ll000L20L-200L2L-20L0.5L-10L)。5.1.13 微量移液器(0.12.5L,l-10L,10-200L,100l000L)。5.1.14 无菌离心管(1.5mL,2mL,5mL,15mL),无菌吸头(10L,200L,ImD。5.1.15 聚乙烯薄膜袋：90mmX150mm自封袋，使用前先用紫外灭菌20min05.1.16 采样工具：剪刀、镜子和无菌棉拭子等。6检测方法6.1 生物安全措施实验操作及处理按照G
8、BZT14926.422001实验动物细菌学检测标本采集的规定实施。6.2样品及样品处理采样过程中样品不得交叉污染，采样和样品前处理过程中需要佩戴一次性手套。6.2.1 病灶组织在麻醉或动物安乐死后，通过无菌操作采集动物的病灶组织2.0g置于5mL无菌离心管，力口入4mL无菌PBS,使用电动匀浆器充分匀浆l2min,12000r/min离心Iomin,取上清液移入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。6.2.2 肛拭子、粪便、分泌物或盲肠内容物采集肛拭子、粪便、分泌物或动物安乐死后采集盲肠内容物，取肛拭子或2.0g待检样品置于5mL无菌离心管，加入4mL无菌PBS,使用电动匀浆器充分匀浆l2mi
9、n,12000r/min离心IOmin,取上清液移入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。6.2.3 绿脓杆菌的分离培养物经选择性培养基培养的固体菌落或液体培养物，或待鉴定的纯化培养物，取适量样本装入1.5mL无菌离心管中，编号备用。6.2.4 实验动物环境6.2.4.1 实验动物饲料、垫料和饮用水取适量的实验动物饲料、垫料分别置于聚乙烯薄膜袋中，加入适量的无菌PBS,使饲料和垫料全部浸泡在PBS液体中。密封浸泡510min后充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，静置30min,取上清液移入到另一支5mL无菌离心管中，编号备用。取适量实验动物的饮用水直接转移到5mL无菌离心管中，编号备用。6
10、.2.4.2 实验动物设施设备用无菌棉拭子采拭实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入15mL无菌离心管，加入适量无菌PBS,浸泡5IOmin后充分混匀，取出棉拭子后将离心管静置30min,将上清移入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。6.3样品的存放将采集或处理的样品放在28C条件下保存W24h；如果要长期保存需要放置在20条件下，并且避免反复冻融W3次。6. 4样品DNA提取利用商品化的细菌DNA提取试剂盒进行样本DNA的提取,提取方法按照选用试剂盒配套的说明书进行。测定样本DNA浓度后进入下一步骤或放入-80C保存备用。7. 5RPA扩增7.1.1 绿脓杆菌引物绿脓杆菌引物序
11、列见表Io表1引物序列引物序列（53，）片段大小PEA-RPA-FTgctgcactactccatggtc23IbpPEA-RPA-RCgtggatgaacaccttgatg7.1.2 RPA扩增反应体系RPA扩增反应体系见表2。反应液的配制在冰上进行操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以绿脓杆菌DNA作为阳性对照、以不含有绿脓杆菌的其它细菌DNA作为阴性对照、以不加入DNA模板而用DEPC水代替模板作为空白对照。表2RPA扩增反应体系试剂剂量Rehydrationbuffer29.5L样品DNA2.0LPEA-RPA-F2.4LPEA-RPA-R2.4LDEPC水11.2
12、LMgAc2.5L总体系50.0L7.1.3 反应温度将反应体系置于3740C水浴锅中。7.1.4 反应时间反应时间为25min30min,7.1.5 电泳观察将适量50XTAE稀释成IXTAE溶液，配制成含有漠化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶。用移液器取IOL的RPA产物加入1.5%琼脂糖凝胶的梳孔中，其它孔中分别加入等量的空白对照、阴性对照、阳性对照物，并以MarkerDL200ObP作为参照进行电泳检测。电压根据实际电泳槽长度确定，一般控制在35V/Cm,当看到指示染料移动到凝胶边缘时关闭电源结束电泳。将凝胶放入凝胶成像系统进行拍照记录电泳结果。7结果判定7.1 质控标准7.1.1 阳性对照阳
13、性对照出现目的扩增条带，扩增序列见附录B。7.1.2 阴性对照阴性对照无目的扩增条带。7.1.3 空白对照空白对照无目的扩增条带。7.1.4 有效原则如过阳性对照、阴性对照、空白对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。8. 2结果描述与判定8.1.1 阳性结果当阳性对照与检测样品同时出现目的条带，且阴性对照和空白对照未出现条带时，判为核酸阳性。8.1.2 阴性结果当阳性对照出现目的条带，检测样品、阴性对照和空白对照均未出现条带时，判为核酸阴性。7. 3序列测定必要时，可取待检样品扩增出的阳性RPA产物进行核酸序列测定，序列结果与已公开发表的绿脓杆菌特异性片段序列进行比对。序列同源性在90
14、%以上，可判定待检样品绿脓杆菌核酸阳性；否则判定绿脓杆菌核酸阴性。附录A(规范性附录)溶液的配制A.10.02molLPH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.1.1A液0.2molL磷酸二氢钠溶液：称量磷酸二氢钠(NaH2PO4H2O)27.6g,加入适量去离子水溶解，最后定容至IoOOmL。A.1.2B液0.2molL磷酸氢二钠溶液：称量磷酸氢二钠NaH2PO47H253.6g(或Na2HPO412H2O71.6g或Na2HPO42H2O35.6g),先加入适量去离子水溶解，最后定容至IoOOmL。A.1.30.02molLPH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制取A液14mL、B液36mL
15、,加氯化钠(NaCL)8.5g,加80OmL无菌去离子水溶解稀释，用HCL调节PH至7.2,最后定容至IoOOmL,经121C高压灭菌15min,冷却备用。A.250TAE电泳缓冲液A.2.10.5molL乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液(PH8.0)取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?H2O)18.61g,用80mL无菌去离子水进行溶解，再用5molL氢氧化钠溶液将PH调至为8.0,最后用无菌去离子水定容至IoOmL,经121高压灭菌15min,冷却备用。A.2.250XTAE电泳缓冲液配制取羟基甲基氨基甲烷(TriS)242g,冰乙酸57.1mL,0.5molLPH8.0的EDTA溶液IO
16、omL混合，用无菌去离子水定容至IOoOmL,经121C高压灭菌15min,冷却备用。用时要先用无菌去离子水稀释至1再进行使用。A.3澳化乙锭(EB)溶液(10mgmL)取溟化乙锭20mL,溶解于20mL无菌去离子水中。A.41.5%琼脂糖凝胶（含05ugmL演化乙锭）的配制取琼脂糖1.5g,加入到100mL的IXTAE电泳缓冲液中，混合后加热至琼脂糖完全溶解,待溶液冷却至5055C时，加入溟化乙锭溶液5L,轻轻晃动混匀，避免产生气泡，先将梳子置入电泳槽中，然后将琼脂糖溶液倒入电泳板上，待凝固后取下梳子备用。附录B（规范性附录）引物扩增序列GenBank:KO1397.1（945-1175）TgctgcactactccatggtcctggagggcggcaacgacgcgctcaagctggccatcgaCaacgccctcagcatcaccagcgacggcctgaccatccgcctcgaaggcggcgtcgagccgaAcaagccggtgcgctacagctacacgcgccaggcgcgcggcagttggtcgctgaactggctgGtaccgatcggccacgagaagccctcgaacatcaaggtgttcatccacg
