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1、农业行业标准犬冷冻精液生产技术规程(征求意见稿)编制说明一、工作简况，包括任务来源、制定背景、起草过程等。(一)任务来源及制定背景犬作为伴侣动物，在科研、消防、公安、军事领域以及公共安全领域发挥着独特的作用。公犬的种质资源的开发利用集中体现在精液的合理利用与保存。母犬发情周期长，一年发情12次，且发情时间较为集中，多为春秋两季。因而，公犬一年中绝大部分处于闲置状态，大量精液白白浪费，造成种质资源极大的浪费。于此同时，由于母犬发情时间较为集中，公犬配种频率一般为一周12次，频率过高会对公犬的繁殖能力造成损伤，因而，一个繁殖周期内，公犬的效率极为低下，存在大量的精液浪费。且，一个繁殖周期内，优秀公
2、犬与可以繁衍的后代数量也极为有限，延长了育种周期，进而大大延长了育种改良进程。自然状态下，公犬低效率的种用价值促使犬的冷冻精液行业的蓬勃发展。近年来，低温储藏精液和冷冻精液等技术在欧美发达国家逐渐趋于成熟。大量专门从事犬人工辅助生殖的服务公司和个体兽医诊所孕育而生，这些机构开展的业务包括犬精液采集与检测、精液冷冻和储藏、输精等服务。规模较大的公司还进行冷冻精液的跨国进出口业务，服务内容和使用器械都呈现专业化、标准化和科学化的特点。随着养犬行业的蓬勃发展，我国犬精液冷冻与人工授精等工作也得到了发展，对优秀种犬的繁育需求也在急剧增加。现有的犬冷冻精液生产较为粗放，存在着不同程度的操作不规范，要求、
3、标准不统一，评价不规范等问题，极大的影响了犬精液冷冻精液的保存效果，以及犬人工授精的成功率。为了提高犬的种用价值，缩短育种进程，提高品种培育改良进程，充分发挥优秀种公犬的作用，亟需制定全国统一规范的犬冷冻精液生产技术规程,以推进犬业的健康有序发展。制定犬冷冻精液生产技术规程不仅填补了我国这一领域的空白，在国际上也处于领先地位。为此，2022年12月，公安部南昌警犬基地完成了推荐性行业标准项目建议书、标准制定文本等书面材料。联合北京小动物诊疗行业协会、农业部牛冷冻精液质量监督检验中心、公安部昆明警犬基地等向全国伴侣动物（宠物）标准化技术委员会提出标准立项申报。2023年3月，农业农村部农产品质量
4、安全监管司关于下达2023年农业国家标准和行业标准制修订项目计划的通知（农质标函202351号）批复立项，由公安部警犬基地承担犬冷冻精液生产技术规程（项目编号：14231100）标准的制定工作，标准技术归口单位为全国伴侣动物（宠物）标准技术化委员会（SACTC541）o（二）起草过程1、起草人员本标准由公安部南昌警犬基地负责牵头，成立了标准修订小组，对项目全过程进行了分工，明确各自任务和职责，以确保项目的顺利实施。公安部南昌警犬基地、中国畜牧兽医学会犬学分会、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）、公安部昆明警犬基地、北京市小动物诊疗行业协会等单位为参与起草单位。本行业相关的政府管理部门
5、、质量检验机构、生产企业、推广部门、教学科研院校通过技术上的合作、互补。形成一定的优势，不仅有利于标准修订的完成，而且能够共同推动标准的实施和推广。表1标准制定人员及其分工序号姓名工作单位职称承担任务1余盼公安部南昌警犬基地助理研究员负责标准起草的组织和统稿2叶俊华中国畜牧兽医学会犬学分研究员项目技术研究与推广3吴衍公安部南昌警犬基地研究员项目技术研究与推广4熊前公安部南昌警犬基地研究员技术研究5李川武公安部南昌警犬基地研究员项目组织协调6李莲农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）副教授技术研究7王振云农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）高级兽医师技术研究8李杰公安部昆明警犬基地
6、副研究员技术研究9王春亮公安部南昌警犬基地助理研究员技术研究10肖远鹏公安部南昌警犬基地研究实习员技术研究11项茹雪北京小动物诊疗行业协会助理兽医师标准起草12杨雪芹北京小动物诊疗行业协会助理兽医师标准起草13潘芋芋北京小动物诊疗行业协会助理工程师标准起草2 .起草阶段公安部南昌警犬基地组织的标准修订调研在项目启动前就已开展，主要是针对目前行业形势发展的需求，现行标准执行过程可能存在的问题、需要修订的依据及可行性。调研范围主要是政府管理部门、冻精生产企业、用户、产品质量检验机构、大学、科研院所等，同时查阅、搜集相关的技术资料。2023年03月2023年5月，获批立项后，根据任务要求，标准起草牵
7、头单位公安部南昌警犬基地于2023年4月15日成立了标准编制工作起草小组，成员包括牵头单位和各参与单位的技术骨干。制订了本标准制定的工作计划、编写大纲，明确了任务分工及各阶段进度时间。2023年5月，标准修订小组派员参加农业农村部农产品质量安全中心在成都举办的农业农村标准研制技术培训班学习，认真学习农业农村行业标准审查与管理、标准文件起草、规范和规程编写规则、标准立项申请及报批复核常见问题等课程，对标准报批全流程进行学习；2023年05月2023年10月，针对GB/T1.1-2020.GB/T20001.6-2017GB/T20001.4-2015、GB/T20001.1-2001给出的规则，
8、对标准文件结构、要素及文字的描述，进行规范性修改，形成了犬冷冻精液生产技术规程（征求意见稿）标准文本及其编制说明。3 .征求意见阶段4 .审查阶段（未经审查的不写本部分）5 .报批阶段（未报批的不写本部分）二、标准编制原则、主要内容及其确定依据（一）编制原则1、规范性原则标准的编写工作严格按照GB/TG1-2020、GB/T20001.6-2017GB/T20001.4-2015、GB/T20001.1-2001给出的规则，对标准文件结构、要素及文字的描述，进行规范性修改。6 、统一性、可操作性原则统一性统一性是本标准编写及表达方式的最基本的要求。强调的是内部的统一：标准结构的统一（标准中的部
9、分、章、条、段、图、表、附录的排列顺序）、文体的统一（类似的条款由类似措辞来表达，相同的条款由相同的措辞表达）和术语的统一（每个选用的术语尽可能只有惟一的含义）。可操作性即标准中规定的履行程序的行为指示清晰、明确、具体、容易操作或履行。只要执行标准中规定的行为指示，并且遵守阶段/步骤之间的转换条件或程序最终结束条件，就可以顺利地履行完成标准中确立的程序。（二）主要内容及其确定依据1 .范围本文件规定了犬的冷冻精液生产技术规程的采精、检查、稀释、冷冻、包装、贮存和运输。本文件适用于犬的冷冻精液生产。依据：“范围”中的表达形式依据GB/T20001.06对规程标准的主要技术内容做出提要示的说明，指
10、明标准中所针对的具体程序名称，阐明规定了程序中哪些具体阶段/步骤的行为指示（如操作指示、管理指示等）以及转换条件和结束条件，指出所描述的追溯/证实方法。2 .规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于木文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GA/T2000.233-2018警用犬种代码GB/T5458-2012液氮生物容器GB/T30396-2013牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输1.术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1采精semencollection用徒手或人工模拟工具，获取公犬精液的方法。依据
11、：犬繁育技术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术，第二节人工授精技术，“借助器械或徒手操作，以人工的方法收集公犬的精液二犬和猫的繁殖调控第五章犬的人工授精技术，第一节采精技术，第二款采精方法,“犬最常用的采精方法是手指按摩法二NY/T3186-2018中3.2采精的定义：“使用采精器以获得公羊精液的操作方法二NYT12342018中3.2采精的定义：”用人工模拟且具有自然交配感的工具，以获得公牛精液的方法二3.2精子密度Spermconcentration每单位体积精液中的精子数目，单位亿个/mL。来源：GB/T25172-2020,NY/T3186-2018,NY/T1234/2018依据：动物
12、繁殖学第四章雄性生殖生理第四节精液组成与理化性质第二款精液的理化特性“精子密度，又称精子浓度，是指每毫升精液中所含的精子数二犬繁殖技术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术第二节人工授精技术，“精子密度，也成精子浓度，指精液的单位容积（通常是1亳升）内所含有的精子数目JGB/T25172-2010中，3.4精子密度的定义“每单位体积精液中的精子数目。单位1（）8个mLoNY/T1234-2018中，3.4精子密度定义“每单位体积精液中的精子数目。单位亿个/mL”。NY/T3186-2018中，3.3精子密度定义“每单位体积精液中的精子数目。单位亿个/mL”。3.3精子活力Semenmotility3
13、7下呈前向运动精子数占总精子数的百分率。依据：动物繁殖学第四章雄性生殖生理第三节精子形态结构与活力第二款精子活力“精子活力（motility）是指精液中呈直线运动的精子所占百分比，涉及精子生存、运动、运动和代谢的能力，易受多种内源和外源因素的影响而发生变化”。GB/T25172-2010中，3.3精子活力的定义“37C下呈直线前进运动的精子占总精子数的百分率二GBT41432024中，3.3精子活力的定义“在37环境下呈前向运动精子数占总精子数的百分率”。3.4冷冻精液frozensemen经特殊方法处理的精液超低温冷冻后再液氮中（T96C）长期保存的精液。来源：GB4143-2024,定义3
14、.5依据：GB4143-2024中3.5冷冻精液的定义“经特殊方法处理的精液超低温冷冻后再液氮中（-196）长期保存”。NY/T3796-2020中3.5冷冻精液定义“经特殊方法处理的精液超低温冷冻后在液氮中长期保存”。3.5细管straw一端封闭另一端开口，用于分装精液的聚乙烯复合材料的塑料。管体要求厚薄均匀一致，在常温至超低温(-196)环境下不变形、不破裂。来源:GB/T30396-2013,定义3.5,NY/T1234-2018依据：GB/T30396-2013中3.5“贮精管goblet,一端封闭另一端开口的柱形贮存细管冷冻精液的器材。管体要求厚薄均匀一致,在常温至超低温(-196C
15、)环境下不变形、不破裂。”NY/T3796-2020中3.6“贮精管goblet,一端封闭另一端开口的柱形贮存细管冷冻精液的器材。管体要求厚薄均匀一致,在常温至超低温(-196C)环境下不变形、不破裂。”NY/T1234-2018中3.5,“细管，用于分装精液的聚乙烯复合材料的塑料管二动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第二节精液稀释与保存技术，冷冻精液的分装和剂型“细管型，由聚氯乙烯复合塑料制成。管长125133mm,含0.18和0.4mL两种剂型。”2.采精4.1公犬种公犬体质健康，具有种用价值。依据：GB20557-2006中4.1“种公羊应具有种用价值，体质健康，无遗传疾病，不允许有已
16、发布的动物防疫法中所明确的二类疫病中的任何一种疾病二GB/T25172-2010中4.1”公猪应健康且达到种用要求”。成年公猪宜每周采精二次至三次，青年公猪宜每周一次至二次J动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术第四节人工授精技术第三款方法与操作步骤“只有保持公畜的良好繁殖体况，才能保证产生优质精液。如公畜营养不良、过于肥胖、管理不良，都会影响精液的品质和性欲的维持二4.2采精室采精场所应保持安静，地面防滑，且保持清洁卫生。依据：动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第四节人工授精技术，第三款方法与操作步骤“1.采精前的准备(1)采精场采精要有固定的场地和环境，以利于公畜建立巩固的条件反射；同时要确
17、保人畜安全和防止精液污染。采精场地应宽敞、平坦、清洁、安静”。“采精场所还应配备喷洒消毒和紫外线照射的装置”。犬人工授精技术第七章犬人工授精技术，第二款“采精应在良好的环境中进行，以利于公犬形成稳定的性条件反射，又能避免精液不受污染。因此，要求室外采精场地应宽敞、平坦、安静。清洁、避风；室内采精场地应宽敞明亮、地面平坦二GB/T25172-2010中“4.2采精室应设置采精区和安全区。采精区设置假台猪，地面防滑，并保持清洁、安静二NY/T3186-2018”5.1采精环境采精室因保持安静，地面清洁、防滑，保持舒适的温度，光线良好”。NY/T1234-2018“6.1采精场所应保持安静，地面防滑
18、并保持清洁卫生，有护栏等安全保护措施4.3采精前准备4.3.1采精员应着洁净工作衣、帽，戴次性塑料手套。4.3.2集精杯、载玻片、盖玻片、精液处理器皿和稀释液应预热至37C。4. 3.3显微镜载物台恒温板应预热至37C。精子密度仪使用前应预热。依据：犬人工授精技术第七章犬人工授精技术，第三款“集精器可选择漏斗与15mL离心管组合，或者50mL的玻璃烧杯，在采精前与精液接触的器皿都要在干燥箱中37C预热，以确保精液与器皿温度差不高于2C”。GB/T25172-2010“4.3.采精前准备4.1.1 采精员应着接近工作衣、帽，穿长胶鞋。4.1.2 集精杯（内置无毒塑料袋并覆盖四层纱布或一层精液过滤
19、纸）、载波片、盖玻片、精液处理器皿和稀释液应预热至37Co4.1.3 显微镜载物台上恒温板应预热至37。精子密度仪使用前应提前预热二NY/T1234-2018“6.5采精器用75%的酒精棉球擦拭消毒，无消毒剂残留后注入38左右温水约500mL,并用消毒纱布将采精器口包裹好，放置于44C46C的恒温箱内。采精前将采精器从恒温箱中去除，集精管可套一个装有35温水的平底塑料瓶，套上保护套，从活塞孔打气使采精器口呈三角形状，内胎的前2/3均匀涂擦适量润滑剂。青年公牛用光面内胎的采精器，成年公牛可用纹状面内胎的采精器。采精时，采精器内温度控制在38C40之间，根据季节和不同牛，温度可做适当调整，最高不得
20、超过43C。”“7.1凡是接触精液的器皿均应放在32C35C恒温箱中，稀释液放在32C35C恒温水浴箱中备用。盛装稀释精液的稀释管，应做明显标记。4. 4采精步骤4.4 .1清洁体表，擦干水渍。阴毛过长时应适度修剪。包皮确需冲洗的，冲洗干净30min后才可进行采精操作。依据：GB/T25172-20104.4.1剪去包皮部长毛，清洁体表，擦干水渍。4.4.2挤尽包皮积液，先用0.1%高锦酸钾溶液清洗腹部和包皮，再用温水清洗后擦干”。NY/T3186-2018“5.3采精公羊定期剪短包皮周围的长毛，采精前清洗公羊包皮”。NY/T1234-2018”6.3种公牛体表应清洁卫生，刷刨外阴，阴毛过长时
21、应适度修剪。包皮确需冲洗的，冲洗干净30min后才可进行采精操作二4.5 .2手握法采精时，应一只手戴无毒乳胶手套，按摩公犬包皮部，待阴茎开始勃起时，把包皮往上揩至露出阴茎球，握住阴茎球后端，同时给阴茎适当的按压，当阴茎充分勃起后犬开始射精。待射出透明的第一部分水样液体后，另一只手持集精杯置于阴茎下方，收集第二部分乳白色精液。依据：动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第四节人工授精技术，第三款方法与操作步骤”犬的按摩采精。操作时右手戴上乳胶手套，轻缓地握住阴茎的龟头球部分，左手拿住集精杯位于犬的左侧准备收集精液。给予龟头适当的压力并作前后按摩，当阴茎充分勃起、经30s左右即开始射精。射精过程持
22、续13min。采精时，阴茎不得接触器械,否则会抑制射精。犬为分段射精，可在射精间隙更换集精杯。犬的射精量在215mL,分三段射出，第一部分是尿道球腺分泌的水样液体，无精子；第二部分；是来自睾丸的富含精子的部分，呈白色；最后一部分是前列腺分泌物，量最多，不含精子犬繁育技术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术，第二节人工授精技术中“（四）采精一般采用手握按摩采精法。在用母犬或母犬阴道分泌物诱导成功后，采精员级用手（戴胶皮手套）握住公犬阴茎，将阴茎拉向侧面，同事给阴茎球体适当的压力，并做前后按摩，当阴茎充分勃起后经30秒左右即开始射精，射精过程持续35秒。采精时注意不使用阴茎接触器械，否则会抑制射精。公
23、犬射出的精液一般氛围三段，第一部分为尿道小腺体分泌的水样液体，为稀薄的水样液体，无精子；第二部分是来自睾丸的富含精子的部分，呈乳白色；最后部门是前列腺分泌物，量最多，不含精子“即采精员一手戴上灭菌乳胶手套，一手握集精杯，蹲在龚全一册，清洗、消毒公犬包皮及其周围部分后，手指进我阴茎并呈节奏性施加压力，数秒后，公犬阴茎开始膨大，尤其是球体膨大部，采精员继续对阴茎球体进行节奏型按摩5秒左右，公犬便产生抽动、射精等性行为J4.5采精频率成年公犬每周采精两次到三次，可根据品种和个体差异酌情调整。依据：动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第四节人工授精技术，第三款方法与操作步骤“犬可隔日采精一次J犬繁育技
24、术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术，第二节人工授精技术中“对犬增加采精频率，会影响精液品质，若连续一日采精2次，从第四次开始精液量减少一半，活精子数明显降低。采精频率增加时，pH值没有变化。随着采精频率的增加，第一段精液量呈增加的趋势，第二段精液在间隔24小时采精时减少最明显。因此，公犬人工采精应间隔48小时以上GB/T25172-20104.5采精频率成年公猪每周采精两次到三次，青年公猪每周采精一次到两次二NY/T3186-2018“5.6.4成年公羊每周采精两次，每次可连续采精两回（间隔20min-30min）,可根据品种和个体差异酌情调整二NY/T1234-20186.8公牛每周一般采精
25、2次，视年龄、身体状况增减次数，每次可连续采精2回（间隔时间30min以上），采精充分（集精管内泡沫丰富，精液量大且稠密）的公牛不宜连续采精2回4.6清洁打扫采精结束后，及时清扫冲洗干净场地。依据：NY/T1234-2018“6.9采精结束后应及时清扫冲洗干净场地”。3.精液检查5.1 精液处理室应设精液检查、稀释和分装区，温度宜控制在22C25,不应太阳光直射。依据：GBZT25172-2010”应设精液检查、稀释和分装区，温度宜控制在2225,不应太阳光直射或紫外灯照射”。5. 2外观可采用目测法对精液外观进行检查。主要观察精液的色泽、气味及是否有脓性分泌物、毛发等异物。正常情况下，精液为
26、乳白色或者微黄，略有腥味。依据：动物繁殖学第四章雄性生殖生理，第四节精液组成与理化性质，第二款精液的理化特性“外观犬精液的浓精部分为乳白色，而前精和后精部分为清亮的液体，含精子数量少，甚至无精子犬人工授精技术第七章犬人工授精技术，第二节犬精液品质检查，第一款精液的一般性状：“（二）精液颜色正常精液的颜色一般为乳白色或白色，精子密度越高，乳白色越浓，透明度越低犬繁殖技术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术，第二节人工授精技术，第二款精液品质检查“色泽、气味：正常公犬精液的颜色为乳白色和灰白色，稍有腥味二GB/T25172-2010表1外观，呈乳白色，均匀一致”。NY/T12342018主要观察精液的
27、色泽、气味及是否有脓性分泌物或血液等异物。正常情况下，精液微乳白色或微黄，略有腥味。6. 3采精量直接读取集精管上刻度（精度不小于0.1mL）。依据：GB/T25172-2010a5,3.2采用称重法计算采精量（Ig相当于ImL）”。NY/T3186-2018“6.221测量通过刻度管上的刻度值测量精液的量值（mL）”。NY/T1234-2018a7.3.2目测直接读取集精管上刻度（精确到0.1mL）”。7. 4精子密度采用精子密度仪或可见光分光光度计法测定。应定期用血细胞计数板法校正。依据：GB“25172-2010”采用精子密度仪或可见光分光光度计法测定。应定期用血细胞计数板法校正二NY/
28、T3186-2018“623密度比色法进行密度测定，单位1（）8个每毫升NY/T1234-2018“7.4精子密度测定使用精子密度测定仪器进行测定二8. 5精子活力取约5L10L精液至于在玻片上,加盖盖玻片，在37C恒温装置的相差显微镜下用200倍400倍评定活力。每样片观察3个视野，计算平均值。活力用百分率表示，例如80%或0.8。依据：犬人工授精技术第七章犬人工授精技术，第二节犬精液品质检查，第一款精液的一般性状：“取5L精液置于预热后的载玻片上，加盖玻片，立即在37载物台上用200倍400倍相差显微镜观察活力，也可通过电视显微装置观察活力。每样片观察3个视野，进行全面评定:GB/T251
29、72-20105.3.3精子活力取中层精液15uL25uL,在200倍400倍显微镜下检查。每份精液取样两次，每个样观察三个视野，计算平均值NY/T1234-20187.5精子活力测定取精液和稀释精液5UL10UL,加盖盖玻片或者血盖片后，在37C恒温装置的相差显微镜上评定活力，用百分率或相应数值标识，例如80%或0.8”。9. 6精液评价外观正常，密度大于等于hl。8个/mL,活力大于等于65%的精液可进行后续处理。依据：NYfT3186-20186.3精液评价外观正常、密度大于等于61()8个/mL、活力大于等于65%的精液进行后续处理:NY/T1234-2018“外观正常、密度大于等于6
30、X1()8个/证、活力大于等于65%、畸形率小于等于15%的精液进行后续处理，可加入一定量的复合抗生素二犬和猫的繁殖调控第五章犬的人工输精技术，第二节精液评价技术，第一款精液质量的评价“犬射物中的总精子数为3义1。4万2oi()4万，但品种之间存在差别很大，而且精子的产量也取决于睾丸的大小犬和猫的繁殖调控第五章犬的人工输精技术，第二节精液评价技术，第二款精子活力“精子的活力通常用呈直线运动的精子所占的百分比表示，正常公犬其敬业样品的精子活力一般为70%90%,但在性静止较长时间后，活力可能会下降。生育力正常的公犬，其精子活力一般至少应达到70%,但形态正常的总精子数及呈直线前进运动的总精子数与
31、生育力的关系可能比单个百分比的关系更为密切4.精液稀释、平衡和标识1.1 稀释量根据精液的采精量、密度、活力等确定精液稀释液量。稀释液配方见附录B。依据：NYT3186-20186.4.1稀释量稀释液的任何添加量均应保证每一剂量中解冻后所含前进运动精子数为0.3亿个以上NY/T1234-2018u7.7.1稀释液量确定根据精液的密度、活力、采精量等确定应加稀释液量”。动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第二节精液稀释与保存技术，第一款精液稀释“精液进行适当的稀释可以提高精子存活率；但如果稀释倍数超过一定限度，精子的存活率就会随着稀释倍数的提高而逐渐下降1.2 一步稀释、平衡法等温稀释液缓慢加入
32、精液，摇匀后，可选以下任何一种进行平衡：方法一:先灌装后平衡。将稀释后的精液,在20C25C下进行封装,封装后的细管放入35C的低温柜中平衡L5h4ho方法二：先平衡后灌装。将稀释后的精液放入含有32C34C水的容器中，放入3C5C的低温柜内降温平衡1.5h4ho在低温柜中进行细管封装。空细管提前降温至395C。依据：GB20557-2006“C.3.1一次稀释法将需加的稀释液一次加完”。NY/T3186-2018u6.4.2一步稀释、平衡法等温稀释液缓慢加入精液，至稀释总量（精液量和稀释液量）的一半，摇匀。在32C34C水浴中暂存IOmin后加稀释液至稀释总量，可选下列方法中任何一种进行平衡
33、及封装。方法一：IOminB,在20C25C下进行封装，封装后的细管精液放入不透明的容器内，将容器放入35的低温柜中平衡1.5h2h0方法二：将加完稀释液后的精液放入含有32C34C水的容器中，放入后送3C5C低温柜内降温平衡，2h后往容器中加冰块促使其快速将至平衡温度，40min后在低温柜中进行细管封装。空细管亦应降至35”。NY/T1234-2018“7.7.2一种稀释液法取一个盛有30mL稀释液经34水浴预先加温的稀释瓶，对精液进行稀释并混匀，在34C水浴中暂存IOmin后加稀释液至最终稀释量。再按如下方法之一操作：a）先灌装后平衡。放置Iomin后，即可在20以下常温实验室操作台上进行
34、精液的灌装、封口就和标识。灌装后的细管放入不透明的塑料盒内，每盒以盛放300支为宜。把塑料盒放入3C5C低温柜中平衡3h5h,评定活力。b）先平衡后灌装。加完稀释液后，用水杯盛适量的34C水，把稀释瓶放入后送3C5C低温柜内降温平衡。2h后，水杯中加冰块，促使其快速降温至3C5C（细管亦应降至3C5C）,评定活力。在低温柜中进行细管灌装、封口和标识。6. 3两步稀释、平衡法将精液放入一定容器的3234水浴中，用等温的的第一液缓慢加入精液中，至稀释总量的一半，摇匀，并尽快放至3C5C的低温柜中降温，第二液同时放至3C5的低温柜中。水浴降温下平衡L5h2.5h,加入等温笫二液至稀释总量。完成稀释后
35、可继续平衡40Inin,并于低温柜中进行封装。依据：GB20557-2006“C.3.2两次稀释法将所加稀释液分两次添加，首先加入不含甘油的一液，加至稀释总量的一般，降温、平衡后再加足含有甘油的二液。添加与精液等温的稀释液时，应缓缓加入二NY/T3186-20186.4.3两步稀释、平衡法将等温的第一液缓慢加入精液中，至稀释总量的一半，摇匀，将稀释精液放入一定容器的32C34C水浴中，并尽快放至35的低温柜中降温，第二液同时放至3C5C的低温柜中。水浴降温下平衡1.5h后，可在水浴中加入适量冰块加快降温速度，0.5h1h后，加入等温的第二液至稀释总量。完成稀释后继续平衡40min于低温柜中进行
36、封装二NY/T1234-2018“7.7.3两种稀释液法把精液倒入34预先加温的稀释瓶中，用5mL34C的第一液加入集精管，摇晃数下；然后倒入稀释瓶中，剩余的第一液缓慢加地加入稀释瓶中，摇匀，评定活力。第一液量的计算公式见式（2）o用水杯盛适量的34水，把稀释瓶放入后送3C5C的低温柜内降温平衡。与此同时，把第二液一并放入低温柜。2h后，水杯中加冰块，促使其快速降温至35C时加入第二液。第二液的计算见式（3）0加入第二液摇匀后再平衡0.5h以上，评定活力。在低温柜中进行细管灌装、封口和标识J动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术第二节精液稀释与保存技术第一款精液稀释“冷冻精液剂型不同，所采用的的稀
37、释液配方、稀释倍数和次数也不尽相同。一般采用一次或二次稀释法，也有采用三次稀释法。（1）一次稀释法常用颗粒精液，是按照精液稀释的要求，将含有甘油抗冻剂的稀释液按一定比例一次加入精液内。（2）二次稀释法首先采出的精液在等温条件下，用不含甘油的I液作第一次稀释。稀释后的精液，经4060min缓慢降温至45C,再加入等温含廿油的II液。加入量通常为第一次稀释后的精液量。H液的加入可以是一次性加入，也可以分34次缓慢滴入。这样在25下，经第二次稀释的精液中，含有的甘油量可保持为H液的一半，不因为稀释比例变化而使精液中最终含甘油浓度发生改变。”“稀释精液的平衡精液用含有甘油的稀释液稀释后，需在45C下静
38、置一段时间，使甘油充分渗透进精子内，已达到抗冻保护作用，称为平衡。平衡时间通肠胃24h为宜。精子经低温平衡后壳增强其奶冻能力，减轻在冷冻过程中冰晶化对精子的损害。”犬繁殖技术大全第一篇犬的生殖生理与繁殖技术，第二节人工授精技术，第五款精液冷冻“（四）精液稀释稀释方法有两种：一次稀释法，按照精液稀释的要求，将含有廿油的稀释液按一定比例依次加入精液内。二次稀释法：为了减少甘油对精子的有害作用，在第1次稀释时，不加甘油。即精液在等温条件下用不含甘油的稀释液做第1次稀释，稀释后的精液经1小时缓慢降温至45,在25下再用含有甘油的稀释液做第2次稀释。”“（五）降温和平衡降温：稀释后精液必须由室温经12小
39、时缓慢降温到35,然后在此温度下进行平衡。平衡：精液用含有甘油的稀释液稀释后，在35C环境下放置一段时间，使甘油充分渗透入精子体内，产生抗冻保护作用。甘油稀释液对精液作用时间称为平衡过程。通常的平衡时间以24小时为宜二6.4标识细管标识可采用喷墨打印机、激光打印机以及标签贴纸等方式进行标记。细管上所印字迹应清晰易认，信息齐全。标识内容参见附录A。依据：NY/T3186-2018“6.5标识冷冻精液细管上应有明确标识，所印字迹应清晰易认,具体标识方法见附录C”。NY/T1234-2018细管上所印字迹应清晰易认，信息齐全二7.精液冷冻7.1 上架封装后的细管精液上架码放时应注意细管摆放的方向，把
40、棉塞封口端靠近操作者，封装口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置。不同犬的细管精液，要分开码放，两只犬精液之间隔开一些距离，或者用标记物做好识别工作。依据：NY/T3186-2018“7.1码架平衡、封装后的细管精液上架码放时应注意细管摆放方向，把棉塞封口端靠近操作者，封口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置，两只羊之间的细管要隔开一些距离，以免混淆二NY/T1234-20188.1上架灌装、封口、标识后的细管上架码放时，应注意细管摆放的方向，棉塞端口段靠近操作者，超声波封口端远离操作者。放入程控冷冻仪时亦应如此7. 2冷冻7. 2.1程控冷冻法使用时首先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，冷冻
41、仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4,将已排满待冻细管的架子迅速放入冷冻仪，盖严盖子，运行设定好的冷冻程序。依据：NY/T3186-20187.2.1程控冷冻法冷冻仪与低温平衡柜应尽量靠近，设置好最佳冷冻程序，严格按照冷冻仪的操作程序执行二NY/T1234-2018“8.2冷冻采用程控冷冻仪冷冻精液。程控冷冻仪与低温平衡柜应尽量靠近，设置好最佳冷冻程序。严格按照程控冷冻仪的操作程序进行冷冻二7. 2.2自制冷冻箱法用自制的冷冻箱冷冻细管时，冷冻箱的深度应在50Cln以上。冷冻的温度一般控制在T40C左右，初冻温度调节至-120C左右，冷冻时温度回升的最高值不得高于-90,整个冷
42、冻过程控制在8min之内。细管熏蒸后，投入液氮。依据：NY/T3186-2018“7.2.2自制冷冻箱法冷冻箱的深度应在50Cm以上，能保证箱内温度控制在-80-120,细管熏蒸8min后投入液氮。”动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术第二节精液稀释与保存技术第二款精液保存“（2）液氮熏蒸法以液氮为冷源，通过调节距液氮面的距离和时间掌握降温速度。”“制备细管冷冻精液时，将细管放在距离液氮面一定距离的铜纱网上，停留5min左右，等精液冻结后，移入液氮中储存二7. 3冷冻精液质量检查预先把水浴箱水温加热至38C40,用镜子取一支后的细管冷冻精液迅速浸泡入38C40水中并晃动，待溶解后立即取出，用吸水
43、纸或纱布擦干水珠，在用细管剪剪去封口端，将精液吹入一小试管内，取解冻精液进行活力检查，操作方法见5.5,检查合格的冷冻精液作为合格品妥善保存。依据：动物繁殖学第十二章繁殖机能调控技术，第二节精液稀释与保存技术，第二款精液保存，冷冻精液的解冻“解冻温度和方法以及解冻也的成分都会直接影响解冻后的精子活力。解冻过程应像冷冻过程一样，必须迅速精子的冰晶化温度区，才不会损害精子。”“细管冷冻精液可直接将其投入40的温水中，待融化一半时，立即取出备用。”NY/T3186-2018“8.3.2精子活力大于等于30%”。NY/T1234-2018“9冻精活力检查冷冻后的精液可在任一时间进行解冻。节董事，一头牛
44、取2支冻精迅速浸泡入37水中并晃动。待细管内冻精溶解后取出，擦干水珠，减去细管的超声波封口端，用专用推针把精液挤入一小试管内。取解冻精液进行活力检查，操作方法见7.5.检查合格的冻精作为初检合格品妥善储存二犬和猫的繁殖调控第五章犬的人工输精技术，第二节精液评价技术“在犬，尚不清楚获得最佳受胎率的最少正常精子数。如果阴道输入新鲜精液，则至少需要200义1()6前进精子，获得的受胎率才与自然配种相当；如果在子宫中输入冷冻解冻精液，则至少需要150X1()62ooXio6呈直线前进运动的精子，。8. 精液包装和贮存8.1 冷冻精液收集冷冻完成后，冷冻精液按犬名做好标识，细管的封口端在上，棉塞封口端在
45、下，迅速浸泡在液氮中。依据：GBZT30396-2013“4.2.1细管冷冻精液包装应在-140C一下的环境中进行，每支贮精管最多装25支。包装后的细管冷冻精液其棉塞端应朝向贮精管的底部，不得倒置。”NY/T3186-2018“7.3精液收集冷冻完成后，冷冻精液按照羊号做好标识，投入低温容器液氮中保存二NY/T1234-2018tt8.3收集冷冻完成后，打开程序冷冻仪盖子，冻精按牛号投入盛满液氮的不同提筒或专用的塑料杯中，细管的超声波封口端在上并迅速浸泡在液氮中”。8 .2冷冻精液贮存贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458-2012规定，专人负责及时补充液氮，冷冻精液应浸在液氮中。应经常检查
46、液氮罐的状况，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其他液氮罐内保存。在由一个容器转移至另一个容器时，间隔时间不得超过3s。依据：GB20557-20068.4贮存贮存冻精的低温容器应符合GB5458规定；专人负责及时补充液氮，冻精应浸在液氮中；妹纸公羊的冻精单独贮存；贮存东京的容器每年清洗、消毒应不少于一次并更换新鲜液氮；取放冻精时，冻精离开液氮的时间不得超过10s”。GB/T30396-2013“7.3要求细管冷冻精液应浸没于液氮生物容器的液氮中。冷冻精液由一个液氮生物容器转移到另一液氮生物容器时，在液氮生物容器外停留时间不得超过3s0取存冷冻精液后要及时盖好生物容器塞”。NY/T379
47、6-2020“9.3储存马和驴冷冻精液应储存于装有液氮的容器。在由一个容器转移至另一个容器时，间隔时间不得超过3s”。9 .冷冻精液运输9.1 在液氮生物容器罐体外明显位置标上“向上”“小心轻放”等储运图示标志。9.2 液氮生物容器应轻装轻卸，不得轻卸、横倒、碰撞和强烈振动，确保冷冻精液始终浸泡在液氮中O9.3 冻精运输过程中要有专人负责,移动液氮生物容器应提握液氮生物容器手柄,抬起罐体后移动。依据：GB/T30396-2013“8.1在液氮生物容器01体外明显位置标上“向上”“小心轻放”等储运图示标志。8.2液氮生物容器应轻装轻卸，不得轻卸、横倒、碰撞和强烈振动，确保冷冻精液始终浸泡在液氮中。8.3有专人负责，移动液氮生物容器应提握液氮生物容器手柄抬起罐体后移动。”GB205572006”冻精运输过程中应有专人负责,贮存容易不得横
