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1、基于网络药理学探讨川尊嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的保护机制川茸嗪CtetramethyIpyrazine)是从传统中草药川茸中分离得到的化合物，具有血管生成和血管保护作用以及抗炎、抗氧化等功能，临床上被长期用于治疗心脑血管疾病和炎症性疾病。近来发现川茸嗪可以改善AP引起的胰腺和肠道损伤，通过抑制NF-B的活化，阻断炎症因子释放和增加细胞凋亡来减轻AP的严重程度，具有治疗AP的潜能，但确切机制尚未明确。本研究借助于网络药理学筛选出川萼嗪治疗,急巾生坏死1生胰月泉炎(acutenecrotizingpancreatitis,ANP)的靶点，进行功能富集分析和通路富集分析，探讨川葛嗪治疗ANP
2、的核心靶点及其潜在的分子机制，并进一步在ANP大鼠模型上进行初步验证，以期为川茸嗪的基础研究和临床应用提供新的思路。材料与方法一、川茸嗪作用靶点的获取利用中药系统药理学分析平台(TraditionaIChineseMedicineSystemsPharmaco1.ogyDatabaseandAna1.ysisPIatform,TCMSP),以a2,3,5,6-tetramethyIpyrazinev为关键词检索川茸嗪的作用靶点，下载其mo1.2格式并上传到PharmMapper网站。靶点种类设定为HumanProteinTargetsOnIy(v2010,2241)o利用UniPrOt数据库对
3、获得的靶点进行筛选，物种限定为homosapiens”。二、ANP相关靶点的获取通过人类疾病信息相关数据库CTD(ComparativeToxicogenomicsDatabase)、DisGeNETGeneCards(TheHumanGeneDatabase)OMIM(OnIineMendeIianInheritanceinMan),以pancreatitis,acutenecrotizing”为检索词对ANP相关基因进行检索筛查并整合，剔除重复项，获得ANP相关的候选靶点。三、川茸嗪和ANP交集靶点蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选将川茸嗪的作用靶点与ANP的候选靶点上传至在线韦恩图，
4、得到川茸嗪和ANP的交集基因。将交集基因导入STRING(SearchTooIforRetrievaIofInteractionGenes)数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用(proteinproteininteractionnetworks,PP1.)网络，将构建的PP1.网络导入Cytoscape3.7.2软件，应用NetworkAnaIyzer插件进一步分析、调整后作图，并利用CytoHUbba插件筛选PP1.的关键靶点。四、功能富集分析利用R语言(4.0.3)CIUSterPrOfiIer包(3.16.1)进行基因本体(geneonto1.ogy,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百
5、科全书(KyotoEncyc1.opediaofGenesandGenomes,KEGG）通路富集分析。参数选择PVaIUeCI1.tOff=O.05,PAdjUStMethOd=BH”，qvaIueCutoff=0.05oGO功能富集分析包括3个不同的水平：生物学过程，细胞组成和分子功能，根据P值从小到大选择前10位。五、川茸嗪与ANP关键靶点分子对接将已知的关键靶点与川茸嗪进行分子对接，得到对接亲和力，反映其稳定性。从蛋白质结构数据库（ProteinDataBank,PDB）下载核心蛋白分子结构，从TCMSP下载川茸嗪的结构,将蛋白和川茸嗪结构导入PyMoI2.5.2和AutoDockTo
6、o1.s1.5.6软件进行分子对接及可视化处理。六、实验动物及分组30只250350g相同遗传背景的SPF级雄性SD大鼠均购自上海斯拉克公司，动物合格证号为SCXK（沪）20170005,按照数字表法随机分为对照组、ANP组和川茸嗪治疗组（川茸嗪组），每组10只。采用胰胆管逆行注射4%牛磺胆酸钠1m1./kg的方法建立ANP大鼠模型。川茸嗪组在制模后5min内经腹腔注射川茸嗪注射液10m1.kgo注射用盐酸川茸嗪购自平光制药股份有限公司，溶于IOOm1.0.9%生理盐水，药物浓度为0.6%。对照组仅经尾静脉注射等容积PBSo七、胰腺组织病理学检查及关键靶点蛋白表达检测大鼠于制模后12h处死，取
7、胰腺组织，常规固定，石蜡包埋，切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察胰腺组织的病理学改变。应用免疫组织化学染色检测胰腺组织表皮生长因子受体(epiderma1.growthfactorreceptor,EGFR)、胱天蛋白酶3(caspase3,CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activatedproteinkinase1,MAPK1)、B细胞淋巴瘤样蛋白1(B-CeI1.IymPhOn1.a-2-Iikeprotein1,BC1.21.1Bc-X1.)蛋白的表达。抗EGFR抗体(ab52894)、CASP3抗体(ab184787)、MAPK1抗体(ab109282)和BC1
8、.21.1抗体(ab32370)均购自英国ABCAM公司，二抗(PV-6001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Image-PrOPIus6.0图像分析系统获取染色结果的光密度值。八、血清生物化学指标检测大鼠处死前眼眶取血，2000r/min离心(离心半径9.856Cm)收集血清，一8(TC保存。采用E1.1.SA法检测血清白介素-6(inter1.eukin-6,I1.-6)和肿瘤坏死因子-Q(tumornecrosisfactor-,TNF-a)水平。I1.-6、TNF-CI试剂盒均购自上海江莱生物公司，按试剂盒说明书操作。九、统计学处理应用SPSS26.0软件进行统计学分析。正态分布的
9、计量资料以xs表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用1.SD和SNK检验。P0.05为差异有统计学意义。结果一、川茸嗪和ANP的相关靶点通过TCMSP、PharmMapper数据库最终得到川茸嗪的潜在靶点共142个，将靶点名称上传到UniPrOt数据库，校正靶点名称并剔除重复基因，最终得到137个靶点。从CTD、DisGeNET.GeneCardS和OM1.M数据库分别筛选出ANP相关基因24575、62、1876和150个，合计26663个；剔除其中关联得分较小的基因，分别筛选出202、62、234和69个相关度得分较高的基因，经合并剔除重复基因后得到513个高分靶点。二、川茸嗪和
10、ANP交集靶点基因及PP1.网络构建将川茸嗪潜在靶点信息与ANP高分靶点信息取交集，选择同时存在于川茸嗪潜在靶点信息与ANP高分靶点信息中的靶点基因，得到川茸嗪中与ANP发病机制相关的25个作用靶点基因(图1)。通过STRING数据库构建了川茸嗪和ANP交集的25个作用靶点的PP1.网络，发现其中5个关键靶点有相互作用，分别为白蛋白(A1.B)、EGFR.CASP3、MAPK1和BC1.21.1,节点度(degree)值分别为21、18、16、15、14。图1川芳嗪与急性坏死性胰腺炎的共同靶点三、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析对25个共同靶点基因进行Go功能分析，结果显示，生物学过程主
11、要涉及生殖结构发育(G0:0048608)、生殖系统发育(G0：0061458)、对抗生素的反应(G0:0046677)、细胞对化学应激的反应(G0：0062197)和对活性氧的反应(GO:OoOO302)等；细胞组成主要为囊泡腔(G0：0031983)、膜筏(G0:0045121)、膜微区(G0:0098857)、分泌颗粒腔(G0：0034774)和细胞质囊泡腔(G0：0060205)等靶蛋白；分子功能主要包括SH2域结合(G0：0042169)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO:OOO4713)、磷酸酪氨酸残基结合(G0:OoOI784)、蛋白酶结合(G0：0002020)和核受体活性(G0:00
12、04879)等。对25个共同靶点基因行KEGG通路富集分析，结果显示，与ANP的发展和治疗相关的通路主要包括RaS信号通路(hsaO4O14)、PI3KTkt信号通路(hsa04151)、柄类药物耐药(hsa01524)、磷脂酶D信号通路(hsa04072)和EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(hsa01521),以及慢性粒细胞白血病、膀胱癌和黑色素瘤等肿瘤信号通路。四、川茸嗪与ANP关键靶点分子对接运用AutoDockTooIs以半柔性对接方法将川茸嗪与上述关键靶点进行分子对接，得到川茸嗪与A1.B、EGFR.CASP3、MAPK1.和BC1.21.1的结合能分别为一506、-4.03.-3.74
13、.3.82、4.33kca1./mo1.,平均结合能为一420kca1./moIo它们之间分子对接的详细模式见图2o图2川芍嘎与白蛋白(2A)、表皮生长因子受体(2B)、胱大蛋白懵3(2C),丝裂原活化蛋白激的1.(2D)、B细胞淋巴喃样蛋白1(2E)的分子对接模式图五、各组大鼠胰腺组织病理学改变对照组大鼠无腹水，胰腺形态正常，镜下见胰腺小叶结构完整。ANP组大鼠腹腔内有大量血性腹水，胰腺、肠系膜周围可见散在的钙化斑，胰腺肿胀、周围渗出明显，并可见出血坏死灶；镜下见胰腺腺体结构较紊乱，小叶间隙明显增大，腺泡、血管周围以及腺体间隙均可见中性粒细胞浸润。川茸嗪组大鼠腹腔内少量腹水，胰腺轻中度肿胀伴
14、周围少量渗出，镜下见胰腺小叶间隙略微增大，散在中性粒细胞浸润（图3）o图3口照出（3A）.急性坏死性胰腺炎组（3B）、川斗嗓组（3。大限胰朦组织病埋学改变以木格-伊红染色2）六、各组大鼠胰腺组织EGFR、CASP3、MAPK1.和BC1.21.1蛋白表达水平对照组胰腺组织EGFR、CASP3、MAPK1.表达量分别为0.110.03、0.200.03.0.160.03；ANP组分别为0.310.04、0.430.05.0.330.08;；1.|茸嗪组分另IJ为0.240.05.0.34士0.06、0.200.05oANP组较对照组显著升高，川萼嗪组较ANP组显著降低（P值均V0.01）;对照组
15、、ANP组和川茸嗪组胰腺组织BC1.21.1表达量分别为0.190.05、0.280.06和0.430.20,ANP组较对照组显著升高，川茸嗪组又较ANP组显著升高（P值均V0.05,图4）o图4对黑组.急性坏死性胰腺炎组J1.号噬田快称S1.黑表皮生K囚子受体:4A4（：，.沈天蚤白脑3YD-4F）.丝裂原活化蛋白激削I（4G4）.B福胞淋巴螭样蛋白（4J4IJ的蛋白表达（免疫坦炽化学染色20）七、各组大鼠血清I1.-6和TNF-a水平ANP组大鼠血清I1.-6和TNF-水平均较对照组显著增高，而川茸嗪组血清I1.-6和TNF-Q水平均较ANP组显著降低，差异均有统计学意义（表2）o表23组
16、大鼠血清中HW和TNFy水平（pgm1.js）组别只数11.-6TNF对照组IO7.545.3!17.9610.90ANP组1()62.671.1.74aH4.6723.57a川芍嗪组1019.117.73b51.5423.38b产值67.42535.530产值0.001O.(X)1注：114为自介素6；T、Fa为肿瘤坏死因子-a;A、P为急性坏死性腹腺炎。与对照组比较；与组比较讨论气不通是AP的基本病机,通里攻下应贯穿治疗的始终，在疏肝解郁、清热化湿、通腑泻热、祛瘀通腑、回阳救逆的基本治疗原则下，可采用中药口服、灌肠、外敷和针刺等内外治法相结合的多途径治疗方案。川茸嗪是从传统中草药川茸中分离
17、得到的化合物。本研究共获得25个川茸嗪治疗ANP的靶点，其中A1.B、EGFR.CASP3、MAPK1和BC1.21.1为治疗的核心靶点。一般认为配受体间相互作用的亲和力越强，所需的能量就越少，其发生作用的可能性就越大。本研究分子对接的平均结合能为-4.20kca1.mo1.,表明川茸嗪与这些关键靶点蛋白均有较好的结合活性。同时，GO功能富集分析显示，川茸嗪治疗ANP的生物学过程涉及生殖结构及系统发育、对抗生素的反应、细胞对化学应激的反应和对活性氧的反应等；KEGG通路富集分析结果表明，川茸嗪治疗ANP的主要通路富集在RaS信号通路、P1.3K-Akt信号通路、柏类药物耐药、磷脂酶D信号通路和
18、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等。MAPK1又称细胞外信号调节激酶2(extraceIIu1.arsigna-reguIatedkinase2,ERK2),作为多种生物化学信号的整合点，参与多种细胞的增殖、分化、转录调控和发育等过程。有研究表明，MAPK信号通路与重症急性胰腺炎的炎症反应和氧化应激损伤密切相关，通过抑制MAPK信号通路减少肠道炎症反应和菌群失调，可减轻胰腺组织损伤。本研究结果显示，MAPK1.蛋白在ANP组大鼠中高表达，与对照组比较差异有统计学意义，而川萼嗪组MAPK1.表达则较ANP组显著降低，血清I1.-6和TNF-也显著降低，说明川茸嗪可以抑制MAPK1.的表达及下游信号转
19、导，减少I1.-6、TNF-Q等炎症因子的释放，从而减轻ANP后的炎症反应和氧化应激损伤。EGFR是ErbB受体家族的成员之一，属于受体酪氨酸激酶类。ErbB受体信号通过Akt、MAPK以及其他多种通路来调节细胞增殖、迁移、分化和凋亡。在多种类型的恶性肿瘤中，ErbB家族成员及其部分配体通常过表达、扩增或突变，这使其成为重要的治疗靶标。ANP小鼠存在着EGFR信号的过度激活，Fan等研究也发现EGFR可能在AP的发病机制中发挥着重要作用，可作为AP诊断和治疗的潜在生物标志物。EGFR配体B细胞素已被证实对AP小鼠有保护作用，雨蛙素和1.-精氨酸不能诱导过表达B细胞素的转基因小鼠引发AP。本研究
20、发现对照组大鼠EGFR蛋白表达水平最低，ANP组表达水平最高，差异有统计学意义，经过川茸嗪干预后，EGFR表达水平则较ANP组明显降低，推测川茸嗪具有类似B细胞素的作用，能够促进胰腺B细胞新生，在胰腺再生中发挥一定的作用，对ANP具有保护性作用，可作为治疗AP的常规药物。细胞凋亡参与AP感染性并发症的发生和进展，与ANP多器官功能障碍有关，因而，控制细胞凋亡可能是改善ANP临床预后的有效策略。CASP3是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡半胱天冬酶级联反应的执行阶段起着核心作用，参与细胞凋亡、细胞坏死和炎症的信号通路。BC1.21.1BcHX1.则是BC1.-2家族的一种抗凋亡蛋白，是细胞
21、凋亡的关键调节因子之一。1.oO等在研究人类多能干细胞分化为胰腺细胞的过程中观察到BcI-X1.的表达上调及CaSPaSe3的相应下调，调节BcI-X1.的表达水平可以显著改善胰腺细胞的存活率和稳定性。本研究发现ANP组大鼠CASP3蛋白表达水平较对照组显著升高，经川茸嗪治疗后，其表达水平则较ANP组显著降低；而BC1.21.1蛋白表达水平在经过川茸嗪治疗后进一步显著升高，说明川茸嗪可以促进抗凋亡蛋白BcI-X1.表达增多，抑制CaSPaSe3的水解，阻断酶解级联反应，进而对抗胰腺腺泡细胞凋亡，缓解胰腺炎的进展，并可能促进胰腺细胞再生。综上所述，川茸嗪可以通过激活EGFR、MAPK1.等多种信号通路，减轻ANP后的炎症反应和氧化应激损伤，增强诸如BC1.21.1等抗凋亡基因的表达，阻断CASP3介导的细胞凋亡半胱天冬酶解级联反应，对牛磺胆酸钠诱导的ANP大鼠胰腺组织起保护性作用，为基础研究和临床应用提供了新的思路O
