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1、RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的试验探讨RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的试验探讨RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的试验探讨作者：郑学芝，刘桂莲，李丽，孙R,念红，胡静，蔡子微【摘要】目的筛选NS基因特异性SiKNA阳性细胞克隆，探讨NS基因特异性RNA干扰对Eca109细胞株体外增殖实力的影响。方法用脂质体法将NS特异性SiRNA表达载体转染Eca109细胞，Zeocin抗生素压力筛选后用PCR方法鉴定阳性克隆;MTT法检测各组细胞的生长增殖状况，RTPCR方法检测
2、NS基因表达量的改变状况。结果与时圭照组比较，silencer组肿瘤细胞授趋于分化，细胞增殖抑制率超过80%（绐P【关键词】NUCleoStemi拄n;RNA干扰：食管癌；基因表达；细胞增殖Abstract：Objec付tiveToscreenNSge蕙nespecifiepositivecellclones,andinve梭Stigatetheeffectof份Huinanesophaguscanc珀erEca109celIsprol彩iferationinvitroby缗NSgenespecificKNA被TheNSsiRNAexpressIonvectorwastransfectedin
3、tohumanesop镯HaguscancerEca109曲CeIlSUSing1.IPOFEeT境AMINETM2000Reagent缘,andpositivec1ones廖WcrecxamincdbyPCRa敲FterstabIetransfec拇IansscreeningwithZ削eocin;detectedthe茨celIproliferationbPyMTTassayandtheleve1SofNSgeneexpre那ssionbyRTComparedwiIhthctwocontrol邺groups,thesiIencer讣groupcelIswerenear毗erdifferet
4、iation,t痰heproliferationinh腕ibiIoryratcwashigh楮erthan80%(PKeywordS：Nucleosteniin;R廉NAinterference;bEsophaguscancer；Geneexpression;Cell南proliferationO引言棵NS基因是美国国立卫生研究院的学者都MckayandTsai2002年盈新发觉的一种蛋白质核因子1,该基抹因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达于丰度很高，但在分化的成体组织中，该基灯因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质一NS来确定其细胞呸H我复制的实力，NS可能是干细胞和肿燹瘤
5、细胞通过G2/S检验点的特异性调控呕因子。本文将以人食管癌Eca109辕细胞株为试验材料探讨NS基因特异性R闽NA干扰对食管癌ECa109细胞株体外增殖实力的影响。1材料和方法材料人食管癌Eca109细胞购芸于上海细胞所：1640培育基、胎牛血钝清、胰蛋白酶为Gibco公司：PCDNA4CNSsiIencer质Z粒2：MTT、DMS0、Zeoc曲in、1.ipofectamineTM鳗2000Reagent：Invitr倡ogcn公司；RNA、DNA试剂盒；螺RTPCR试剂盒：TaKaRa公司赦;引物合成:上海申能博彩生物科技有限萌公司。方法细胞培育及NS基因祁转染人食管癌Eca109细胞培捺
6、养于含10%FBS的RPMI1640方培育基中，置于37C、5%CO2潮湿皂空气的C02培育箱内培育。脂质体法将鄢PCDNA4CNSsiIenc转er质粒及空载体PCDA4CV亥ector质粒转染Eca109细胞韩，分别命名为SiIenCer组、ve-ctor组，未转染的Eca109细帷胞记为normal组。转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继蹦续在含Zeocin抗生素的培育基中进撮行扩大培育。阳性细胞克隆的鉴定肿提取克隆细胞基因组DNA,以Zeo笏Cin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同Jr时以normal组肿瘤细胞作比照。其源引物序列为：上游引
7、物5atggc哮Caagttgaccagtge；下游焰引物为5tcagtcctgctcCtcggccaoPCR反应条件为：94预变性5min,然后94变性30sec,60C退火30sec,7焰2C延长3Osec,共30循环，最终瘦72C延长IOmin；PCR产物大小局约370bp0生长曲线的绘制3技将三组细胞传到24孔板上，每组蛇18复孔，分别于24h、48h、72mh、96h、120h、144h用计数谪板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长印曲线。细胞的形态学视察倒置显微镜下视察各组细胞形态改变状况。三MTT比色法测定细胞增殖抑制率3樱在96孔培育板上接种三组细胞，每漪组24夏孔，分别于24h
8、、48h、7都2h三个时间段进行MTT测定，以培育谷液做空白比照并调零，用酶标仪测定49谪Onm处的吸光度值，每次每组测定8熨序孔。细胞增殖抑制率=1-细胞存活率泸即细胞增殖抑制率=100%各rf组肿瘤细胞NS基因表达水平检测提取肿瘤细胞总RA,用RTPCR方防法验证各组肿瘤细胞NS基因表达状况。参照genebank中NS和GAPD慑H的基因序列及参考文献4设计引物如下:NS基因上游P1.5atgKaaaaggcctaagttaaag竦aaagc,下游P2：5gctc笛ICCaaattClCCtt.tggt模a；GAPDH上游为P3：5ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4
9、：5Itact伽CCttggaggecatgtggg争：扩增产物长度分别为570bp和28铿Obp,在同一体系内反应，PCR反应跟条件为94C预变性5min,94,C变准性30sec,50C退火30sec,旭72C延长30sec,共30循环，最痒后72C延长10min统计学分嘎析试验数据以S表示，统计学处理蛭采纳SPSS软件，进行t检验。2蟆结果PCR法鉴定阳性细胞克隆抗影Zeocin的细胞克隆部分PCR产物维琼脂糖凝胶电泳结果见图1；Silen麻cer组与vector组皆检测到Ze落ocin基因条带，而normal组无，即细胞克隆外源基因整合阳性。细署胞生长曲线的绘制各时间段Silen关ce
10、r组细胞数目低于比照vector泥组和normal组，差异具有显著性：筵细胞生长曲线见图2。各组细胞的形诙态学改变SiIenCer组细胞与对照VeCtor组和normal组相比疡体积变小并趋向于均一，多数细胞由梭形三趋向变圆，核质比变小，瘤巨细胞削减，切细胞趋于分化。MTT比色法测定细属胞增殖实力细胞培育24h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为no涡rmal组的94%和vector组的皇93%；细胞培育48h后，silen针cer组细胞增殖抑制率分别为norm我al组的80%和vector组的78咂%：细胞培育72h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为normal带组的88%和v
11、ector组的87%：细胞增殖曲线见图3。各组肿瘤细胞挥NS基因表达水平silencer组饷肿瘤细胞S基因表达水平明显低于比照牲vector组和normal组，见图跛4。3探讨NS基因走一种p53机结合蛋白，主要存在于核仁中，在核质中山也有低量表达；在干细胞处于早期多潜能鼎状态时该基因的表达丰度很高，而在分化M起先时，这个基因的表达却突然几乎完全耗消逝1。本室与中科院遗传发育探讨茎所合作证明了多种肿瘤组织中都有NS基贬因的表达5,6,运用SiRNA真捎核表达载体，使宫颈癌Uella细胞的褚增殖被抑制，细胞内NS基因的表达量下滦降7,8O本试验将PCDNA4惫/CNSsilence载体转染人食管
12、癌ECa109细胞，同步转染P瘗CDNA4Cvector空载体作桐比照。经过Zeocin抗生素压力筛选4获得阳性细胞克隆，并通过PCR方法验为证克隆细胞外源基因整合阳性。与比照组vector和normal组比较，S棚iIencer组细胞的肿瘤生物学行为清发生了显著的改变，细胞增殖明显变慢，止趋向于分化；Vn法进行细胞增殖抑制遽率测定显示silencer组细胞的增桐殖速率明显低于两比照组：细胞增殖抑制率大于80%；各组细胞RTPCR产T物电泳结果显示silencer组肿痛褚细胞中NS基因表达量明显下降。试验牍结果表明，我们构建的针对NS基因的特；异性siRNA的表达载体PCDN4潘/CNSsil
13、encer是胜利并攵有效用的，将其转染入人食管癌细胞后，为通过RNAT扰机制使部分NS基因缄默咻，从而产生了抑制Eca109细胞分浏裂、增殖的效应。同时提示调整NS基因峭活性可能对肿揄有防治作用，S基因能咳够预料肿瘤的发展趋势，有可能成为一种池新的肿痛标记物。但是NS蛋臼活动的精除确分子机制尚不完全清晰，这仍旧须要大物量的试验工作去证明。运用RNA干扰技似术对NS基因进行深化探讨可能会揭示或撰部分揭示干细胞和肿瘤细胞增殖之迷，为付肿瘤的早期诊断、基因治疗和预后及以干铺细胞为基础的组织工程等供应理论依据和孚工作基础。【参考文献】1TSaiRY,Mckaynucleol濮armechanismco
14、ntrol娶Iingcellproliferat汾ioninsIemce11sande助ancercellsJ.GeneIsDev,2002,16(23):壬29913003.2蔡子微，尢刘思金，劳为德，等.NS特异性SiR洋NA真核表达载体的构建J.牡丹江幺医学院学报，XX,24:14.筑3薛庆善.体外培育的原理与技术小境.北京：科学技术出版社，343.4刘思金，薛延，芳为德，等.人类娓骨桥蛋白在细胞增殖中的功能探讨J.高技术通讯，XX,3：2528.5刘思金，蔡子微，胡国法，等.N讣S基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾侦细胞NS基因的表达J.牡丹江医学脯院学报,XX,24：57.6鳌1.i
15、uSJ,CaiZW,1.aoWD,etofnucIeosteminin吓growthregulationof呆gastriccancer,live讳rcancerandothermal顾ignanciesj.World美JOUrnalOfgaStroCnt频erology,XX,10(9):1澡2461249.71.iuSJ莒,CaiZW,1.iuYj,etal.-1.Theeffectofknockin耐gdownNuc1eostemi11笏geneexpressionontheinvitroproIiferat蔑Ionandinvivotumori亳genesiSofHcllacel1sJ.Experimental枫CliniCaICanCerReSe烽arch,XX,23(3):207撰216.8蔡子微，刘思金，孙丽A秋，等.Nucleosteinin特异蓉性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖1335.实力的影响J.中国病理生理学杂志镁，XX.21:1331
