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1、免疫组化IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要协助手段之二虽然免疫组化在各个试验室已常常规开展，但是由于各个试验室选择的抗体试剂厂家、抗原修纪方法、检测系统等不同，免疫组化试验技术操作方法亦不相同,染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简洁，但步骤较多1.环环相扣，而且很多因素影响着免度组化的结果，包括技术人员是否娴熟驾驭整个试验的搽作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修纪及修发液的PH值等众多因素。所以，完成张满足的免疫组化切片并非那么简洁。20世纪末，非生物素型聚合物（Po1.ymer）检测系统的出现，可以仃效
2、地防止内源性生物累的干扰，而11灵敏度高,操作使徒,已被免疫组化试脸室广泛应用。当前,免疫组化技术标准化的探讨是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并运用非生物素型聚合物检测方法的基础上而绽开的。1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败,凝固或沉淀组织、细胞内物尬,以保持组织和细胞固有形态和结构.对免疫组化而言更重嘤是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散“需高度重视的是手术或穿刺离体组织必需立刻放标本袋固定，固定后应与病理中请单刚好送交病理科.病理医生有贡任与手术送检科室进行必要的协作与沟通
3、，避开手术后的病理标本随意丢放。由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。常采纳甲醉、或二蟀、BOUin、B5等固定液。由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此举荐作为病理标本的首选固定液。应避开运用含重金属的固定剂。10%中性缓冲福尔乌林配制方法：40%甲醛100m1.磷酸二氢钠4g磷酸翅二钠6.5g蒸储水900m1.固定液的量一般为组织块总体枳的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。固定时间不宜超过24小时，以防止组织经甲酹过度固定造成的组织抗原损
4、失和抗原活性降低。（2）取材：组织标本的取材厚度一般为0.3Cm（不应0.5Cn1）,面积一般为（1.0-1.5）CmX（1.0-1.5）cm,（3）脱水：组织在脱水机中的处理需非常恰当，大员的试验室阅历公认加热抗原修狂过程中组织脱片的主要缘由是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。（4）包埋与切片：组织经过脱水、透亮及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度过高荷洁导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的勺蜡（熔点60）.（5）切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5Um之间,淋巴结/淋巴组织和肾穿组织切片应当更薄些。切片耍求完整，厚薄匀称,无纵褶无刀痕，
5、太厚会影响免疫组化染色结果和推断，还简洁在染色过程中发生脱片展片可采纳二次展片，所谓二次展片：是指在展片过程中，先将组织切片潦移在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展片，然后将切片捞起放入45-50oC的温水中进行其次次展片.此方法的优点是酒精溶液水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织接触酒精后会散开，不建议采纳此法。（6）烤片：举荐58-60。C恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片,因为在干燥的条件下加热切片可以加速组织内抗原的氧化而破坏组织中的抗原，使抗原定位不明确。（7）哲不染色切片的保存：进行免疫组化染色最好采纳新切片。在实际
6、工作中，蜡块面端可以采纳蜡封来避开抗原损失以便长期保存。假如切好哲不染色的切片，应当将切片放翼于4。C冰箱短时间保存。（8）脱蜡：免疫组化的脱蜡过程与常规HE脱蜡步豚相同。2、免疫组化抗体的选择、稀择和保存（1）选择:选择抗体应先r解其反应谱和适用条件（包括适用切片V石蜡切片或冰冻切片、稀择度及温育时间等）。运用一种新抗体时，必需首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳特异反应所需抗原的酸低浓度,或者依据有关说明书的提示.（2）稀释：一般用O.O1MPBS,PH值7.2；或用0.05MTBS,PH值76必要时可按须要加适量小牛血清清蛋白。（3）保存：合理地保存运用抗体非常重要，这样才能最
7、大限度地发挥抗体的作用，使抗体不致在短期内失去活性。浓缩型抗体：应先依据厂家供应的效价，将其分类。可按5u1.、IOUI、203等至100U1.为一单位分装入安战或0.25m1.带盖塑料齿心管中，并注明标记（批号、名称、效价、量），密封后放入-20。C-40低温冰箱中保存，用时按需用试取出，稀择后置4。C冰箱保存运用，切勿反更冻存，以免效价降低。即用型抗体可置于4。C冰箱中保存。远程运输，路途携带，邮寄抗体时，应加冰、F冰、防湿材料，以免影响效价。3、免疫组化中被测组织的抗原修更（1）组织细胞经10%中性缓冲福尔马林固定后，其切片中的抗原确定簇因解的交联作用而被封闭，抗原结构的理化性质发生显著
8、的变更，表位空间结构变更而导致很多抗原免疫活性丢失，影响了抗原的定位。目前在免疫组化试验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素之一。常用的抗原修熨方法是加热抗原修史法和施消化法。有些抗体不须要进行抗原修更，有些抗体须要的消化法，有些抗原须要加热修夏法，有些抗体则须要几种抗原修灾技术的联合应用（抗原双重修熨法），至于哪种抗体是否须要抗原修曳以及如何修复，一般试剂公司在产品书口或说明书上会予以说明。（2）前消化法：现免疫组化试验室中主要是胰的消化法和胃的消化法。胰蛋白油消化法：浓度一般是0.0501%,37。C下混育15-30分钟.胃蛋白的消化法：浓度般为0.04%,37。C下温育10-30分钟。
9、(3)加热抗原修复法：主要包括：高压法、微波法、水浴法。英战邦免疫细胞化学室间质控组织(UKNEQAS-ICC)进行过项由105家试验室参加，历时两年(1996年8月-1998年8月)的探讨对ER、PR进行8次循环反馈试脸，进行不同试脸室间试脸方法的比较的结论，就目前试脍室间ER、PR染色结果偏弱的缘由最终得出样性试验结论，即由于微波加热时间不足与试验室中操作限制不当所致,故剧烈举荐运用高压抗原修纪方法。抗原修现必需运用耐高温塑科切片架，不能运用铜染色架，以防止因修更液PH值变更抗原修更效果，修更结束后必需等修复液冷却至室温后，才能取出切片，取出后的切片须要用自来水充分洗涤，修复液的量必需保证
10、全部切片都能浸泡到，无论哪一步骤都不能使切片干燥。用过的柠椽酸修复液或EDTA修反液不建议反发运用。影响抗原修更的基本因素是加热的温度和时间以及加热处理时浸泡切片的抗原修复液的PH.(4)抗原修史液的选择：加热抗原修笑液有多种，如柠株酸修组液(PH6.0)、EDTA修复液(PH8.0-9.0).EGTA(PH9.0),TriS修复液(PH10.0),至于须要哪种修复液,应当依据试剂公司供应的产品书目或说明书上的预处理方法.4、防脱破片的制备：由于免疫组化过程长，组织切片长时间浸泡在缓冲液和试剂内经过多次冲洗浸泡和作用，尤其是在抗原修复过程中，由于高温、高压、梅射等因素的影响，极易造成脱片，因此
11、，必需在载玻片上涂上粘附剂，增加切片的粘附作用。一般采纳多聚赖氨酸(PoIy-1.-1.ysine)和APES两种枯附剂。多聚赖氨酸防脱玻片的制备多聚赖熟酸(PoIy-1.-1.ysine)1份蒸储水9份配制方法：取多聚赖氨酸1份，蒸谯水9份，置于干净的玻璃容器中，混合匀称，将充分洗净、预先干燥的玻片浸泡入稀糅好的多聚赖氨酸中5-10杪，取出放置于室温卜.晾干或60。C干燥箱内烘干备用。处理后的玻片避光干燥可长期保存、备用。浓缩多聚赖纸酸液室温(18-260C)贮存，有效期12个月。稀释后的工作液2。C-8。C冰箱保存，有效期3个月。APES坡片的制备:APES1份丙雨50份配制方法：取APE
12、S1.份，丙朋50份，置于干净的玻璃容器中，充分搅拌匀称。将洗净的玻片放入稀释好的APES液中20-30秒后取出,梢停，在放入纯丙酮液洗去多余的APES液，置通风橱中脱干即可。留意，用APES防脱破片处理破片捞片时组织应步到位，不要留有气泡。浓缩液室温（18-26oC）贮存，仃效期12个月。Po1.y-1.-1.ySine（多聚赖氨黝为目前免疫组化染色工作中最常用且效果最好的一种防脱片剂，多聚赖羽酸溶液也可按1：10稀择成工作液，适合于须要酹消化、微波、高压的防脱片处理。5、免疫组化染色：（1）内源性过氧化物院的阻断：在一些细胞中存在过氧化物酹和过氧化氢酹等，它们能使H202分解，DAB沉枳而
13、若色，最常见的是红细胞（血红蛋白），另外还有横触肌细胞（肌球蛋白）、粒细胞和总核细胞（细胞色素）、肝细胞和肾细胞（过氧化氢的），假娟不进行处理，组织中红细胞、粒细胞等会干扰染色结果的推断，消退内源性过氧化物酹干扰的方法就是将组织切片浸泡在3%的H2O2中10分钟。（2）内源性生物素的阻断：抗原修复对组织中内源性生物素受到不同程度的封闭，在加热抗原修且增加抗原表位暴露的同时，也增加了组织中内源性生物素的呈现。内源性生物素指的是组织内能够与抗生素蛋白结合的分子或基团，运用生物素链客的抗生素蛋白的结合形成足以以假乱比的阳性。周小鸽等人2002年采纳组织芯片技术对大范围的正常组织和肿痛组织进行的系统性
14、探讨显示：冰冻31织中存在生物素，经福尔马林固定石蜡包埋后的组织中生物素被封闭，加热抗原修宓可造成生物素暴露，生物素暴露的强度各不相同，强名可到强阳性（+）,生物索在组织中的分布形式，既仃散在分布也有充满分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，生物素在组织中的分布形式，特殊是腺上皮组织，包括正常组织和肿痛组织，亦存在部分非上皮组织，生物素暴露的强弱与修更液亦有关，PH9.0EGTA的暴露实力比PH8.0EDTA和PH6.0的柠椽酸更强：加热抗原修宏暴露的生物素可以被蛋清液时闭。周小鸽等人提出建议：凡采纳加热抗原修豆和生物素相关检测系统，应进行生物素常规封闭，冰冻切片做免疫组化染色时亦应进行生物素常
15、规封闭，或者采纳非生物素检测系统，如EnViSiOn等，坚持运用阴性比照。在试脸室中般凡进行加热抗原修复处理并打电运用生物於抗生亲辣根过氧化物的检测系统，免疫组化染色的组织都须要进行内源性生物素封闭处理阻断内源性生物素的方法是采纳卵白素生物素（AVidinbiotin）加以封闭，在常itt下孵育20-30分钟即可,Avidin-biotin可以与组织中内源性生物素结合，以消退影响.但最简便的方法是运用非生物素的前聚合物检测系统。（3）血清封闭：作为检测试剂的抗原蛋白带芍肯定的负电荷,免疫组化染色时.易与带正电荷的组织（特殊是纤维组织、变性和或坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等）发生静电吸引而导致非特异
16、性染色（试验室运用的封闭血清，般在加抗之前运用，选择的血清种属般与二抗的种属相同），去除这种非特异性染色最仃效的方法是，在滴加抗前，先滴加用于制备其次抗体动物的非免疫血清或滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：51：20,正常血清爱护作用时间10-20分钟。（4）冲洗缓冲液:试验室中常用冲洗缓冲液为PBS和TBS（PH7.2-7.4）,冲洗缓冲液中加入0.025%Tween-20可以增加缓冲液的效果。（5）抗孵育：即用型第抗体可依据厂家供应的试验操作条件进行试验（迈新试验室针对即用型抗体稳定性与长期石效保存条件的问题进行了长达1年时间比照追踪试验视察，结果表明:即用型抗体在
17、4。C冷敏条件下存放14个月是稳定的）；浓缩型抗体般依据家供应的建议稀择度进行成倍稀释预试验,以选择最佳稀释度。抗体的最佳稀释度是指:在无背景染色的状况下,获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度，一般染色背景深大多是抗体浓度过浓所致。抗体孵育时的温度般以25。8。C为准，在此区间内，抗的孵育时间为30-60分钟。若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当削减孵育时间，或者在4。C冰箱过夜，冰箱4。C下孵育常须要招意的是：抗体孵育应在潮湿密封闭的环境中进行，避开抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干像,致使染色背景产生。高质量的孵育盒是免疫组化的必要试疆用品.免疫组化染色过程的试剂浓度，细育时间是相关联的，浓度
18、与温度和时间基本呈反比，即浓度过高豺育，温度应越低，细育时间应当越短，反之亦然，因此，每个试验室应依据各自的状况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件。（6）常用检测系统：日前常用的检测系统为辣根过氧化物的检测系统，主要为两类：以生物素-链霉菌抗生物素蛋白链接的辣根过翻化物的IBiOtin-StrePtaVidinHRP）检测系统，如：SP.ABC、SABC等；以聚合物（Po1.ymer）链接的）根过氧化物醐检测系统,如:MaxVision.E1.ivision.EnViSiOn等,这两类检测系统都是在国内外临床广泛采纳的检测方法。非生物素型的聚合物检测系统敏感性较嬴、操作便斑、无
19、内源性生物来干扰，己成为免疫组化的常规检测系统。（7）显色系统：由于通常采纳的是辣根过氧化物的，因此选择DAB（棕色）或AEC（红色）作为旃底物显色。若采纳的是碱性磷酸的检测系统则选择BC1.P/NBT（蓝紫色）作为椀底物显色。DAB阳性部位呈棕色.殷以苏木索复染.配制DAB时应留意：1DAB具仃致癌性，可诱发皮肤痛和膀胱癌，运用过程中勿将试剂沾到皮肤、眼暗或衣服上，若发生此状况应马上用大量的水冲洗，用过的DAB应饱入清洁液中集中消加处理：v2DAB肯定要赧新配制，如有沉淀可过滤后运用，否则未溶的DAB颗粒会沉积在切片上，影响结果的视察，配制好的的溶液避光保存，30分钟内有效：3DAB的浓度不
20、宜太高，否则会增加背景染色。H2O2浓度也不宜太高，否则会加速反应，也可增加背景染色。室温下染色约为3-5分钟，可在显微镜下视察限制染色时间。DAB试剂盒冰箱4-8。C避光保存。AEC阳性部位呈红色.如以苏木累或亮绿等作为背景染色，则效果更好,配制AEC时应留意：1配制AEC过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此状况应马上用大量的水冲洗：2由于终产物溶于乙部中，不能用酒精处理，因阳性棕红色产物能溶于究酒精中，故需甘油明胶封片，不能长期保存。3若出现沉淀可过滤后运用，配制好的溶液避光存放，30分钟内有效，染色结果为红色，窒温卜染色约为8-20分钟，可在显微镜卜.视察限制染色时间。AEC试
21、剂盒冰箱4-8避光保存。显色时间不宜过长，过长可导致背景着色，但也不宜过短，过短可导致假阴性染色.（8）究染、脱水、透亮、封固免疫组化更染一般只需苏木素浅淡的染色（1-3分钟），苏木素的配方不同,但首选的是HarriS苏木素衬染。在经0.1%盐酸酒精分化，自来水篮化，常规脱水透亮后封片。6、标准化试验比照的设立免疫组化比照试验的设立在免疫组织化标准化中是极其必要的，正确设立阳性、阴性比照，才能确保免疫组化染色过程的精确性、抗体及相关试剂有效性，是对技术人员试验操作和试剂供应商供应试剂质量的验证，也是对患者的负责。比照的设立包括试剂比照和组织比照，分别作为阳性和阳性比照。（1）试剂比照：主要是为
22、J确定所运用的一抗和检测试剂盒的特异性，替代比照是运用与一抗相同种属来源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或运用PBS代替一抗进行染色“Vimentin抗体可以作为免疫组化染色中一种很有用的阳性比照试剂，在每次免疫组化染色中加入Vimentin染色作为阳性比照，可以视察甲醛固定后抗原表达的敏感性，对甲醛固定后抗原损伤的程度进行分析.（2）组织比照：组织比照试验有阳性比照、阴性比照和组织内部比照。阳性比照：比照组织中含有已知的抗原，常用的阳性比照有多组织蜡块、组织芯片等阳性比照：用确定不含有待测抗原的组织作为阴性比照组织组织内部比照：待测组织自身含有某种相关抗原，如淋巴结内肯定含有血管内皮细胞
23、，在视察外部阳性和阴性的同时，也要留意到内部的表达状况，有时候可以起到相当关键的作用。当然，有不少染色或病例缺乏内阳性比照，若对染色反应有疑问，只能选用另外的阳性比照片核实，若内（或外）阳性比照是组织免疫反应阴性，痛组织阴性则表达假阳性：瘤组织阴性则表明假阴性，只有阳性比照染色阳性，痛组织反应才属真实，除了视察内阳性比照外，还要看内阳性比照是否有非特异性反应。7、免疫组化染色结果正确判读成验室染色结果的视察、染色结果的判定须要丰宓的阅历，免疫组化染色最终是否能得到正施的结论，关键还要看对染色结果如何评价，在推断免疫组化染色结果时，为确保其精确性,必须要留意：首先应视察常规石蜡切片，形成初步诊断
24、看法，在视察免疫组化染色结果时，应以有面:义的组织/细胞为准，即主要视察有意义的组织/细胞的反应是阳性反应还是阴性反应；免疫组化染色结果必需建立在组织阳性比照和阴性比照试效仃效的基础H.这是正确推断染色结果的前提。只仃当阳性比照呈阳性反应,阴性比照呈阴性反应，且背景清楚时才能从正反两面说明抗体的稀释度和效价精的、染色方法和步骤精确无误、无交叉反应及非特异性染色：染色阳性结果应在预期的组织,细胞结构上定位清楚精确。阳性表达有强弱之分，只要在抗原的特定部位上，即使有少数细胞有抗原表达，也应视为阳性表达：阴性结果是组织细胞内预期区域中未见抗原表达：免疫组化染色结果为病理诊断协助信息，当免疫组化染色结
25、果与HE诊断不相符或发生.冲突时，应以HE诊断为标准，而不能荷洁的用免疫组化染色结果推翻、否定HE诊断，应在多做抗体标记并结合临床资料及试验室膨像学检查等全面综合分析再做出正确诊断。染色阳性的推断：特殊要留意内源性牛物素造成的非特异性染色（如在肝、肾及南含线粒体的细胞等），常常表现为非特异的胞浆阳性。总之，只仃阳性比照染成阳性,阳性比照基本阳性，这样的免疫组化染色结果才可信。一般来讲，免疫组化染色阳性结果比阴性结果更有意义，因为阴性结果可能缘于很多因素，可能抗原的确不存在，或抗原含械低，组织处理时抗原丢失，染色方法不敏感或操作有误。在免疫组化鉴别诊断过程中,大多数染色结果的判读为阳性或阴性即可
26、，但在某些特殊状况下，如肿痛组织中激素受体含量、分了靶向治疗药效，细胞增殖指数等进行免疫组化检测时，染色结果可用半定量计数法。染色强度：（一）阴性、（土）弱阳性、（+）中度阳性、（+）高度阳性；阳性细胞分布：-）阴性、（+）少数细胞阳性（+）中等细胞阳性、+）多数细胞阳性.8、免疫组化报告免疫组化试验报告已经融合在病理常规报告中，除了在本医院病理科与手术送检科室之间进行程序化的规范运用外，随着各个病理科试验室间的沟通日益广泛，标准化的免疫组化报告已成为必不行少的沟通资料。免疫组化试脸报告中包括如下内容：（1）病人的殷资料介绍：（2）免疫组化检测系统（3）注明所选择抗体的品名、克隆号、细胞定位及表达意义：（4）试验比照的设立；（5）医生对免疫组化结果的诠释。最大限度、正确地叙述待测组织中抗原表达信息是病理免疫组化报告的基本要求。在条件允许下，病理免疫组化报告单应附在免疫组化染色图片。参考书目吴秉铿，刘彦仿主编.免疫组织化学病理诊断.北京：北京科学技术出版社，2007王学民,田乃增主编.免疫组织化学和分子生物学好用技术.北京：人民卫生IH版社，2002中华医学会编著.临床技术操作规程病理学分册.北京：人民卫生出版社，2004
