自由基生物学.ppt

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1、自由基生物学Free Radical Biology,前 言,1.什么是自由基生物学：是一门以现代自由基的理论、观点和方法研究自由基在生物和人体的产生、反应及其与各种生命现象相关的科学。自由基生物学是一门新兴的前沿和交叉科学，具有重要理论意义和广泛应用前景并且与人类健康密切相关。,2.自由基生物学的发展,1900年，Gomberg对甲苯基的发现揭开了自由基的首篇章。1969年弗里多维奇（Fridovich）和麦科德（McCord）发现了超氧化物歧化酶（SOD）及其重要的生物学作用是自由基生物学发展史上的里程碑。1998年，NO自由基研究获得诺贝尔生物医学奖,21世纪以来，自由基的生物学效应不断

2、被揭示，自由基与某些疾病发病学的关系也被逐渐认识。自由基生物学研究包括自由基的过量生成的因素及机体清除自由基的机制，以及相关的疾病。以及机体代谢产生的自由基各种生理生化活动等。,3.检测自由基的新技术和方法,自由基检测是研究自由基的关键。物理学发展了多种检测短寿命自由基的手段，如研制成功时间分辨的ESR技术和ESR成像仪，不仅可以检测自由基的种类和浓度，而且可以检测自由基在生物体内的空间分布。,利用这些方法系统地研究了氧自由基和一氧化氮自由基的性质、生物功能和疾病的关系，特别是在炎症、心脑缺血再灌注损伤和神经退行性疾病中的作用。,4.自由基与医学的关系,从射线产生自由基及其具有顺磁性和近年来对

3、活性氧的研究得出结论：许多病理过程，包括辐射损伤、衰老、毒物作用及心血管疾病中的一些环节等，都和自由基有关。自由基病理学就是在这一基础上发展起来的。,2007年8月5日参考消息第7版，科学技术栏，大篇幅介绍了英国剑桥大学德格雷博士的“人活千岁不是梦”的全新科学理念,老龄化并非人类身体自身条件无法避免的一个结果，而是细胞或分子长期受损造成的后果，而医学的发展可以避免这一受损过程，甚至可以完成细胞修复。让寿命以健康的方式延长，而不是脆弱地慢慢变老。细微老化工程策略：德格雷在2003年建立了“高寿鼠奖”，用300万美元奖励可以证明再生治疗法在老鼠身上可行的科学家。,6.1 自由基,定义 具有一个或几

4、个未配对电子的分子、离子或原子称为自由基 通常在其式子旁加一个黑点做为特征标记，如：OH、Cl,什么是自由基呢？自由基是含奇数电子的一群原子。奇数不成对的电子急欲寻求其他电子来配对，因此会把別的物质氧化。就像空气中的铁生锈、削好的苹果变色一样。,“基”（radical）在化学中常用来表示不同的原子团，如碳酸基、硝酸基、甲基等；自由基（free radical）是指能独立存在的，含有一个或一个以上不配对电子的任何原子或原子团；通常在其式子旁加一个黑点做为特征标记，如：OH、Cl,当化合物的共价键断裂时，成对的电子由2个原子均分，称为均裂反应，所需能量由热能、电磁辐射等提供，高温气相反应即燃烧就是

5、一种自由基过程；当共价键异裂时，一个原子接受了成对电子，如水异裂生成H+和OH-，由于都不存在不配对的电子，故不是自由基。,6.1.1 自由基的产生,自由基可以通过共价键均裂产生，也可以通过电子俘获产生。例如：CH4、CCl4共价键化合物解离有两种方式：一是异裂；二是均裂，其产物是自由基。共价键解离的供能方法：热解、光解、辐射作用、氧化还原偶联反应等。,6.1.1 自由基的产生,热解 热解是通过加热使共价键均裂产生自由基的方法。(CH3)3C-O-O-H(CH3)3C-O+OH(一般键离能越高，热解所需的能量就越大，生成的自由基也越不稳定。),6.1.1 自由基的产生,光解 光解是利用光化学反

6、应吸收光量子（在波长适当的紫外或可见光照射下）使共价键均裂产生自由基的方法。如：Cl2 Cl2*2Cl 可光解产生自由基的化合物有：卤素、R-O-O-R、R-N=N-R、R-O-Cl、酸酐、丙酮等。,6.1.1 自由基的产生,辐射分解 其能源是高能光子（X-ray）、高能电子流 氧化还原法是产生自由基的方便方法。一般有机过氧 化物与过渡金属离子发生单电子氧化还原反应时，可产生自由基。通式：Mn+R1-O-O-R2 M(n+1)+R1-O+R2O-,6.1.1 自由基的产生,例如：(1)Fe2+(CH3)3C-O-O-H Fe3+(CH3)3C-O+OH-(2)Fe2+H2O2 Fe3+OH+O

7、H-,酶促氧化还原反应也可以产生自由基。如黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生尿酸反应中产生O2-。除上述几种方法外，还有请氢键破坏等方法也可以产生自由基。,按照自由基产生的方式分为内源性自由基和外源性自由基；,内源性自由基指生物体内产生的自由基，主要是O2-与OH及其衍生物如H2O2、O2、RO、RO2、ROOH；外源性自由基指以物理或化学方法产生的自由基，有通过热解、光解、辐射分解使共价键均裂产生的，也包括使带有成对电子的物质俘获一个电子产生的自由基。,H2O HOH,带有不成对电子的基团称为自由基,自由基的反应活泼性特别强,6.1.2 自由基性质,自由基具有顺磁性特性自由基一般具有活泼的化学活性

8、与自身结构、反应物、反应条件（温度最显著）决定自由基反应的关键因素：自由基中心单电子的定域程度；反应过程中断裂的共价键和生成共价键的强度。,6.1.2 自由基性质,1、独特的物理特性顺磁性：自由基中的未成对电子，因自旋运动产生的磁距未被抵消，具有净的电子自旋磁矩。在无外加磁场时，未成对电子的自旋磁距是随机取向，处于同一个平均能量状态。当自由基置于外加恒定磁场中，电子自旋磁距就会与外磁场相互作用，其磁距方向就会沿外磁场方向排列，使含有自由基的物质表现出净的磁化强度，这种现象称之为顺磁性，顺磁性是自由基独特的物理特性。,2、活泼的化学性质,由于自由基具有未成对电子，所以大部分自由基很不稳定，具有活

9、泼的化学性质，具有极强的攻击作用。在所有分子成键过程中，电子都是倾向配对的，自由基中的未成对电子也有配对的倾向，因此大多数自由基都很活泼，反应性极强，容易反应生成稳定分子，这一重要性质导致自由基极易进攻细胞、蛋白质、酶和核酸等，这也正是自由基容易造成机体损害的直接原因。,有少数自由基化学反应性很低，如三苯甲基自由基，这是由于其空间因素和共振效应引起的。,3、绝大多数自由基半衰期短,在通常条件下很难存在，平均寿命仅有10-5s，所以不易制备，这就给自由基的分离和检测工作带来困难。,4、有些自由基如FMN或FAD具有特征的吸收光谱，有特殊的颜色，这有助于自由基的鉴别。,6.1.2 自由基性质,5、

10、自由基的稳定性是指自由基碎裂成较小碎片或通过键断裂进行重排的倾向。它与结构密切相关。R-H键的离解能越高，自由基越不稳定。有共振的自由基稳定性增加。Ph-或CH2=CH-数目增加，自由基稳定性也增加，这种稳定性增加还包括空间障碍因素。,6.1.3 自由基反应,定义：有自由基参加的化学过程分类：单分子自由基反应 自由基-分子相互作用 自由基-自由基相互作用 链式反应,6.1.3 自由基反应,1.单分子自由基反应 不稳定自由基本身发生的碎裂和重排反应，没有其他反应物参加。碎裂：自由基碎裂成一个稳定分子和一个新的自由基。重排：在环状体系中通常是临近氧的C-C键断裂生成羰基和一个异构的自由基；1,2-

11、或1,5-氢原子或氯原子转移。,6.1.3 自由基反应,2.自由基-分子相互作用 自由基与其它反应物分子间相互作用所反生的反应。包括:(1)加成(2)取代或夺取(3)和氧化剂反应,6.1.3 自由基反应,3.自由基-自由基相互作用 二聚或偶联 歧化反应 影响自由基反应的因素：位阻效应 溶剂效应,6.1.3 自由基反应,4.链式反应自由基链式反应分为引发、扩展、终止三个阶段。启动和终止阶段反应前后的自由基数目发生变化，而增长阶段反应前后自由基数目不变。以甲烷的氯代反应为例：CH4+Cl2=CH3Cl+HCl,6.1.3 自由基反应,（1）引发：通过热辐射、光照、单电子氧化还原法等手段使分子的共价

12、键发生均裂产生自由基的过程称为引发。Cl Cl 2 Cl（2）扩展：Cl+CH4CH3+HCl CH3+Cl2Cl+CH3Cl（3）终止：两个自由基互相结合形成分子的过程称为终止。Cl+ClCl2 Cl+CH3CH3Cl CH3+CH3CH3-CH3 除上述外，自由基还有这可发生裂解、重排、氧化还 原、歧化等反应。,6.1.4 自由基研究方法,1.电子顺磁共振2.脉冲射解与停流技术3.超微弱化学发光法4.O2-、H2O2的测定6.过氧化产物测定6.相关酶的活力测定（CAT、SOD）,6.1.4 自由基研究方法,电子顺磁共振（EPR）EPR方法就是利用具有未配对电子的物质在静磁场作用下对电磁波的

13、共振吸收特性来对物质进行检测与分析。EPR测量通常是固定微波频率，通过线性扫描磁场来获得信号。,6.1.4 自由基研究方法,脉冲射解与停流技术 脉冲射解法，即用一个脉冲式电离辐射源照射化合物溶液，自由基可在微秒或更长时间内产生，而许多自由基的吸收光谱与原化合物不同，可用吸收光谱进行检测。停流法，把反应物同时压到石英管中，混合后再进入收集管。控制条件可使混合液体在石英管中停留很短时间而来不及进行明显的反应。进入收集管的液体被迫突然停止后，石英管中的反应才进行直到完成，通过测量吸收光谱的变化可算出反应速率。,6.1.4 自由基研究方法,超微弱化学发光法 超微弱化学发光法，是对脂质过氧化过程中的自由

14、基反应常用研究方法。可分为自发发光和诱发发光，诱发发光可采用物理或化学诱发因子。,6.1.4 自由基研究方法,O2-、H2O2的测定 O2-的测定：O2-可使细胞色素C(CytC,max570nm)变成还原型CytC(max550nm)，测定A，根据消光系数，计算CytC还原量间接表示O2-含量。H2O2的测定：H2O2的max为240nm，根据其消光系数，无干扰物存在可直接采用紫外法测定。,6.1.4 自由基研究方法,过氧化产物测定(1)丙二醛(MDA)测定：MDA是不饱和脂肪酸过氧化产物之一，它的产量多寡可表示过氧化程度高低。(2)共轭双烯测定：MDA易与细胞内其他物质反应，仅测MDA含量

15、不足以充分反应客观自由基损伤程度。最好还测定不饱和脂肪酸发生过氧化过程中产生的共轭双烯。利用紫外法可直接测定。,6.1.4 自由基研究方法,相关酶活力测定（CAT和SOD）(1)过氧化氢酶(CAT)活力测定：分光光度法、滴定法、侧压法。分光光度法最常用，原理是CAT能催化H2O2变成H2O和O2，使H2O2在240nm处吸收值下降，测定单位时间A240nm的差值，根据H2O2的消光系数可计算CAT活力。,6.1.4 自由基研究方法,相关酶活力测定（CAT和SOD）(2)SOD(超氧化物歧化酶)活力测定：直接法，直接测SOD所催化反应底物消耗速率或产生速率。间接法，原理是有一个产生O2-的系统，

16、让O2-再产生另一个便于检测的反应，通过检测SOD对这个反应的抑制程度间接计算SOD活力。,6.2 活性氧,概念 O2的代谢产物及其衍生的活性物质，统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS或OFR)。如:、OH、H2O2、氢过氧基(HO2-)、烷氧基(RO)、烷过氧基(ROO)、氢过氧化物(ROOH)等。,氧及其衍生物,天然存在的氧分子是自由基，含有2个不配对的电子，分别位于不同的*反键轨道上，有相同的自旋量子数（自旋平行），这是氧的最稳定的状态，称为基态氧（ground state）;活泼形式的氧称为单线态氧，是基态氧接受了能转变成的，有2种形式，1gO2状态比基

17、态氧的能量高93.7kJ，1g+O2更活泼，比基态氧的能量高156.9kJ；这两种单线态氧都已不存在自旋限制，氧化能力大大增加。,由两个氧原子组成的氧分子。两侧的不成对的电子呈对称，稳定。,普遍存在的自由基。单边只有一个电子很不稳定。,单侧的电子进入到另一侧的轨道上，出现了空的轨道，很不稳定。经常发生在紫外线照射下的皮下组织里。,由两个氧原子和两个氢组成，虽然没有不对称的电子，很不稳定。常用做杀菌剂。也可杀死进入到体内的细菌。,最活跃的自由基。一个氧原子和一个氢原子形成。过氧化氢和金属离子反应时产生。,非自由基活性氧的特点是可以在自由基反应中产生，同时还可以直接或间接地触发自由基反应。一些处于

18、激发态的含氧有机物，如激发态羰基化合物和二氧乙烷及臭氧等也都属于具有生物学意义的活性氧。,在生物体系中，电子转移是一个基本的变化。氧分子可以通过单电子接受反应，依次转变为O2、HO2、HOOH、OH等中间产物。由于这些物质都是直接或间接地由分子氧转化而来，而且具有较分子氧活泼的化学反应性，遂统称为活性氧，亦称氧自由基。,6.2.1 体内活性氧的产生,O2-的产生(1)酶反应产生：需氧生物体内氧代谢过程可产生O2-。如XOD（黄嘌呤氧化酶）次黄嘌呤+2O2+H2O黄嘌呤+2O2-+2H+黄嘌呤+2O2+H2O 尿酸+2O2-+2H+NADPH氧化酶 NADPH+2O2NADP+2O2-,XOD,

19、XOD,6.2.1 体内活性氧的产生,O2-的产生(2)非酶反应产生:O2从还原剂接受一个电子转变成O2-。如：某些生物因子（还原型核黄素、半胱氨酸 等）在 O2存在下氧化时可产生O2-；氧合血红蛋白转变为高铁血红蛋白时可生成O2-；体内产生的半醌自由基与O2反应生成O2-；体内H2O2遇到过渡金属离子或其复合物时，均可产生O2-。,6.2.1 体内活性氧的产生,OH的产生(1)通过过渡金属离子（Fe3+）的催化发生Haber-Weiss反应产生OH。Mn+O2-M(n-1)+O2 M(n-1)+H2O2Mn+OH+OH-_ O2-+H2O2 OH+O2+OH-这是生物体内OH产生的主要来源。

20、,6.2.1 体内活性氧的产生,OH的产生(2)某些酶催化系统可产生OH：如前列腺素合成酶、鸟嘌呤环化酶催化反应；(3)某些生理或病理生理过程可产生OH：如嗜中性白细胞及巨噬细胞吞噬细菌时可产生OH；(4)某些药物在体内代谢可能产生OH：羟化药物（5-羟基巴比妥酸等）及具有醌型抗肿瘤抗生素（博莱霉素）进入生物体内可产生OH。,6.2.1 体内活性氧的产生,H2O2的产生 生物体内是通过酶催化反应生成H2O2,如：2O2-+2H+H2O2+O2 黄嘌呤+2O2+H2O 尿酸+2O2-+2H+线粒体与内质网产生的O2-是H2O2的主要来源，其H2O2产量约占氧耗量的1.7%,XOD,SOD,6.2

21、.1 体内活性氧的产生,1O2的产生过氧化物酶催化产生1O2：人嗜中性细胞溶酶体内富含髓过氧化物酶，它能催化反应：OCl-+H2O21O2+Cl-+H2O2某些植物和细菌的过氧化物酶催化反应也产生1O2光敏反应产生1O2：眼角膜中柱细胞的视黄醛在光敏反应中可产生1O2 脂质过氧化过程产生1O2：ROO的分子间相互作用2ROOROOR+1O2,6.2.1 体内活性氧的产生,脂质过氧化物产物的产生 生物体内O2-本身并不能使脂质过氧化，只有其质子化的产物HO2具有引发脂质过氧化作用；OH可引发脂质过氧化；1O2可在脂质过氧化过程中产生并引发脂质过氧化，但首要前提是要有其他活性物质（OH）作为最初引

22、发剂。,6.2.1 体内活性氧的产生,脂质过氧化物产物的产生 RO、RO2和ROOH是脂质过氧化产物。正常生理下，此产物含量极低且可转化为无害物质。病理条件下，外源性物质（毒物、药物等）可间接引发脂质过氧化；内源性活性氧增加则可使脂质过氧化发生或加强。其产物对机体将产生损害。,6.2.1 体内活性氧的产生,脂质过氧化物产物的产生 它由引发、增长、终止三个阶段组成。增长阶段可产生多种自由基，如脂质过氧自由基(ROO)、脂氧自由基(RO)、脂自由基(R)。终止阶段可产生多种小分子产物如丙二醛(MDA)等。,6.2.1 体内活性氧的产生,脂质过氧化物产物的产生 引发剂：光、射线或自由基链式反应：脂质

23、分子LH脱去1个氢原子形成脂质自由基L，此脂质自由基再与氧反应生成脂质过氧自由基LOO。此过氧自由基再进攻其它脂质分子，夺取其氢原子，再生成新的自由基和脂质过氧化物LOOH，此反应反复进行，从而导致脂质分子的不断消耗和脂质过氧化物的大量生成。,6.2.1 体内活性氧的产生,脂质过氧化物产物的产生终产物：最终生成小分子的醛、酮、羧酸以及烷烃和烯烃产物。在脂质过氧化过程中，过渡元素金属离子起着加速脂质过氧化作用，2LOOH LO+LOO+H2O,它由引发、增长、终止三个阶段组成。增长阶段可产生多种自由基，如脂质过氧自由基(ROO)、脂氧自由基(RO)、脂自由基(R)。终止阶段可产生多种小分子产物如

24、丙二醛(MDA)等。,6.2.2 活性氧的毒性,OH的毒性 OH是活性氧中最活泼的，几乎能与细胞中的任何分子发生反应，且反应速率极快。（1）夺氢反应：如OH与膜上的卵磷脂通过夺氢反应产生碳自由基而造成膜损伤。还有OH能攻击DNA中的脱氧核糖产生许多不同产物，其中有的具致突变作用。（2）加成反应：如OH能加到DNA碱基的双键上。（3）电子转移：OH可与无机或有机物发生电子转移。,6.2.2 活性氧的毒性,O2-的毒性 O2-对细胞损伤作用主要表现为使核酸链断裂、多糖解聚、不饱和脂肪酸过氧化，进而造成膜损伤，使某些酶失活和改变线粒体氧化磷酸化作用等。O2-在水中主要起还原剂作用，通过歧化反应生成H

25、2O2。SOD&CAT有防护作用，推测O2-不能单独造成损伤。,6.2.2 活性氧的毒性,O2-的毒性 O2-之所以有毒性主要在于它可以生成更活泼的OH，这就是Haber-Weiss反应。O2-+H2O2 OH+OH-+O2 但是机体内O2-和H2O2的浓度不可能使此反应进行，McCord等为此提出一个铁催化的H-W反应（因体内必然含有铁离子）,6.2.2 活性氧的毒性,铁催化的H-W反应Fe3+O2-Fe2+O2Fe2+H2O2 Fe3+OH+OH-(Fenton反应)O2-+H2O2 OH+OH-+O2(Haber-Weiss反应)O2-和H2O2活泼性较低，可从产生处扩散出去，在细胞其他

26、部分碰到过渡金属离子时即可生成OH。OH极活泼，立即与周围分子反应而表现出毒性。,6.2.2 活性氧的毒性,H2O2的毒性 H2O2是个强氧化剂，可使某些酶的-SH氧化而失活。H2O2常用作消毒剂，它能杀菌和损伤动物细胞。其毒性的原因可能是通过H-W反应生成OH。当H2O2与紫外线结合使用，杀菌效果更好，可能是紫外线使H2O2均裂成 OH。,6.2.2 活性氧的毒性,1O2的毒性 1O2分子中没有不成对电子，不是自由基。1O2与其它分子作用有两种方式：即化合和能量转移。有时这两个反应可同时发生。1O2可与具有C=C结构的化合物化合，这在脂质过氧化作用中十分重要。1O2可氧化色氨酸、蛋氨酸、半胱

27、氨酸、组氨酸引起蛋白质损伤。此外还可损伤DNA。,6.2.2 活性氧的毒性,脂质过氧化产物的毒性 脂质是过氧化是指脂质中不饱和脂肪酸氧化讲解的链反应过程，它由引发、扩展、终止三个阶段组成。扩展阶段产生多种自由基，如脂过氧自由基；终止阶段产生多种小分子产物，如MDA等。脂质过氧化物均有毒性，可引起多种细胞功能的损伤，且和多种疾病的发生、发展有密切关系。,6.2.2 活性氧的毒性,脂质过氧化产物的毒性 生物膜上脂质过氧化，对膜损伤是严重的，如使膜流动性下降，使膜坚固性破坏等。醛类(MDA)是脂质过氧化的终产物，能与蛋白质的-SH和-NH2作用，既可产生蛋白质分子内交联，使依赖-SH和-NH2维持活

28、性的酶失活，使激素受体受伤。,6.2.2 活性氧的毒性,脂质过氧化产物的毒性 1.脂质过氧化可使细胞的脂质受到破坏，从而影响细胞膜功能。细胞和细胞器膜由脂质（磷脂，胆固醇）和脂蛋白构成。脂质内的脂肪酸分饱和和不饱和二大类，饱和脂肪酸使膜坚硬，不饱和脂肪酸使膜柔软且富于流动性。两者比例适当才能维持细胞膜即坚又软的特性，维持细胞膜的完整和通透性。脂质过氧化消耗大量不饱和脂肪酸，产生大量的脂质过氧化物，使细胞膜流动性降低，使膜的脆性增加，线粒体膨胀，溶酶体膜通透性增强，释放溶酶体酶，导致细胞裂解、坏死。,6.2.2 活性氧的毒性,脂质过氧化产物的毒性 2.脂质过氧化的中间产物对蛋白质分子的作用 过氧

29、化过程中产生的L、LO、LOO与蛋白质分子发生夺氢反应，使蛋白质分子变为自由基，最终导致蛋白质的聚合，使蛋白质变性，酶失活。,6.2.2 活性氧的毒性,脂质过氧化产物的毒性 3.脂质过氧化产物中醛类化合物对细胞也有毒性作用如MDA是1个双功能基化合物，可作交联剂，能与蛋白质、核酸、磷脂等含氨基化合物反应，使之发生交联，丧失功能。醛类化合物还可与蛋白质的巯基反应，使其失活。,6.2.3 体内活性氧的清除,体内产生的自由基如积累，将对细胞产生损伤，必须及时将其清除，在长期进化过程中，机体内存在着完整的防御系统，它对自由基造成的损伤既有预防性质的，也有阻断性质的，还有修复性质的，其中起重要作用的是一

30、些酶类。自由基清除剂：凡能和自由基反应使之成为非自由基的化合物称为自由基清除剂。,6.2.3 体内活性氧的清除,（一）酶类抗氧化剂 酶既是自由基攻击的靶分子，又是自由基的天然清除剂。O2还原为水的过程中第一个中间产物是O2-。在体内SOD能将O2-歧化为H2O2，而CAT或GSH-Px或其它过氧化物酶可催化H2O2生成水。这是生物体内对活性氧解毒的一条及其重要的途径。如果体内产生的O2-、H2O2超出了上述酶的清除能力，则会产生毒性最强的OH，并对机体产生严重损伤。,6.2.3 体内活性氧的清除,1、超氧化物歧化酶(Superoxid Dismutase,SOD)2、过氧化氢酶（(Catala

31、se,CAT)3、硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)4、谷胱甘肽硫转移酶(Non-Se-GSHPx),6.2.3 体内活性氧的清除,1.超氧化物歧化酶（SOD）正常生物体具有维持活性氧的平衡生理浓度的能力，过多的O2依靠SOD消除；SOD由蛋白质和金属离子组成，广泛存在于自然界的动植物和一些微生物体内；催化反应：研究表明：人体的一些病变可反映在SOD与O2 含量变化上，对SOD减少或O2 增加的疾病可用SOD药物来治疗。,6.2.3 体内活性氧的清除,.过氧化氢酶（CAT）H2O2是自由基链式反应的中间产物，极易还原为化学活性很强的OH，CAT可使H2O2分解为H2O，使H2O2不致与O2

32、在铁螯合物作用下生成非常有害的OH；CAT是H2O2的特异清除剂，利用CAT可简便准确地检测出H2O2；CAT大部分局限在过氧化物酶体。,6.2.3 体内活性氧的清除,硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)是清除脂质过氧化物与H2O2的清除剂，它可使ROOH和H2O2转变为对机体无毒副作用的产物，从而终止脂质过氧化作用，防止组织中特别是不含CAT的组织（如脑）中的H2O2的损伤作用。,6.2.3 体内活性氧的清除,4、谷胱甘肽硫转移酶(Non-Se-GSHPx)主要和亲电药物结合，起解毒作用，和SeGSHPx协同起作用还原脂质过氧化物，减轻脂质过氧化对机体的损伤，但不能催化H2O2还原为H2O

33、；GSHPx包括SeGSHPx 和Non-Se-GSHPx，主要分布在胞液（75%）和线粒体基质（25%）中，GSSG积累后由谷胱甘肽还原酶还原为GSH；不同组织中GSHPx分布也不相同。,6.2.3 体内活性氧的清除,（二）非酶性防御系统（抗氧化剂）具有还原性，可抑制启动自由基链反应，阻止自由基反应传播，终止自由基反应的化合物称为抗氧化剂。,1、脂溶性（1）Vit E（2）胡萝卜素（3）CoQ(4）激素2、水溶性（1）Vit C（2）谷胱甘肽（3）尿酸3、蛋白类（1）铜兰蛋白（2）胆红素（3）其它血浆蛋白,6.2.3 体内活性氧的清除,6.2.3 体内活性氧的清除,新的抗氧化剂：多酚类物质多

34、酚是一类重要的膳食非营养成分，包括酚酸、类黄酮、木酚素、香豆素和单宁等。原花青素是多酚中的较大分子，也被称作单宁，在植物的皮、种籽核及木实质中含量较高。最早研究的目的是其抗营养性能，它能够与蛋白质、消化酶形成难溶于水的复合物，影响食物的消化吸收。花色素是植物大多数品种红、蓝、紫色的来源。,6.2.3 体内活性氧的清除,最近对于原花青素的抗氧化作用研究较多，证实具有清除体内自由基，减轻脂质过氧化；保护细胞膜和 DNA 免受氧化损伤，干扰激素结合于细胞，络合金属、诱导改变致癌性的酶；抗诱变和抗癌作用；抑制血小板聚集、消炎；抗过敏；抗衰老。,6.2.3 体内活性氧的清除,抗氧化酶及其作用机制抗氧化酶

35、指清除活性氧的酶，它具有以下特点：A、细胞含量的高度特异性，有专门的亚细胞定位，这些定位常常以互补方式重叠。B、含有专门的金属，特别是Cu，Mn，Zn，Fe，Se。抗氧化酶分布的广泛性说明它们在生物体系中，在防止自由基的损伤中具有重要的作用。,抗氧化酶在清除自由基过程中的协同作用,抗氧化剂及其作用机制 抗氧化剂和自由基是一对矛盾体。抗氧化剂的分子结构比较特殊，它的电子是单个排列的，它可以给出电子中和自由基，而自身不会形成有危害的物质，也不会发生链式反应，通过清除自由基达到抗氧化的目的。常见的抗氧化剂有VC、VE、-胡萝卜素等。,6.2.3 体内活性氧的清除,6.2.3 体内活性氧的清除,其他化

36、合物的清除作用含硫化合物：如麦角硫因、半胱氨酸，可以通过给氢过程而抑制自由基引发反应。VE和Vc：VE能抑制脂质过氧化作用，而Vc能与前面反应的自由基中间体反应使VE重新生成，反应中产生的Vc自由基可被NADH还原酶还原成Vc。-胡萝卜素与NADPH:它们均可以是CCl3O2转变成CCl3O2-，使R转变成RH，起到减轻自由基损失的作用。尿酸：是OH的清除剂,6.3 自由基的生理功能,生命过程中产生的自由基，是行使生理功能及介导其生化反应所必需的。,6.3 自由基的生理功能,体内产生自由基的主要途径白细胞和多形核白细胞在吞食外来异物和细菌过程产生呼吸爆发，释放大量活性氧，其中包括超氧阴离子自由

37、基、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等。它们既可以作为杀伤外来入侵者的有力武器，在炎症和免疫方面发挥着巨大作用，但是也可以对正常细胞膜及其他细胞成分产生损伤作用。,6.3 自由基的生理功能,体内产生自由基的主要途径 线粒体的正常功能是通过氧化磷酸化在呼吸链上将氧气还原成水，合成ATP，为细胞提供能量。但有1-3的氧气生成自由基。这些自由基如果泄漏出来，就会造成严重的细胞损伤。,6.3 自由基的生理功能,1.吞噬作用 吞噬细胞碰到侵入病菌时，细胞膜凹陷，然后把整个病菌包围并形成吞噬体再转入细胞质内。质膜的表面成了吞噬体的内表面，膜上的NADPH氧化酶产生氧自由基，并进入吞噬体内杀灭细菌。氧在吞噬细

38、胞杀菌时必不可少，要利用它来形成各种有杀菌能力的活性氧。,6.3 自由基的生理功能,2.在生物合成中的作用 一些物质的生物合成过程中有氧自由基参与，如：在凝血酶原前体生成凝血酶原过程中，维生素K是不可缺少的因子。,6.3 自由基的生理功能,胶原蛋白的生成胶原蛋白是体内含量最多的蛋白质，约占蛋白总量的1/41/3。胶原蛋白的前体为原胶原蛋白，原胶原蛋白转化成胶原蛋白的关键步骤是羟化作用，羟化过程需要自由基的参与。,6.3 自由基的生理功能,脯氨酸（Lys)羟脯氨酸(羟赖氨酸）在胶原蛋白结构中具有羟脯氨酸、羟赖氨酸、半乳糖基羟赖氨酸和葡萄糖基半乳糖基羟赖氨酸都由羟化作用形成。这些酶促反应都需要O2

39、，OH，H2O2，1O2参与。,6.3 自由基的生理功能,凝血酶原的合成 凝血酶原是由凝血酶原前体转变而来，当凝血酶原氨基端10个Glu残基经羧化转为-羧基谷氨酰残基后便形成凝血酶原，在羧化过程中，O2-是必不可少的。,6.3 自由基的生理功能,3.解毒作用 机体对外来毒物的解毒作用主要在肝脏中进行，其解毒作用实际上是有肝微粒体细胞色素P450催化使外来毒物羟化的过程。对象可以是抗生素、麻醉剂等各种药物、各种致癌物。,6.3 自由基的生理功能,4.其他方面植物对创伤的响应 植物组织受伤时可促发一系列反应形成脂质过氧化物和它们的终产物，这些物质在杀死进入伤口的病菌方面起重要作用。,6.3 自由基

40、的生理功能,排除多精受精 海胆受精作用与活性氧有关。受精作用进行时诱导氧消耗突发并在卵表面形成一层膜，该膜含有交联酪氨酸残基。膜形成可以阻止更多精子进入，故而排除多精受精现象。,6.3 自由基的生理功能,一氧化氮自由基在脑的发育过程起着重要作用，它是神经传导的逆信使，在学习和记忆过程中发挥着重要作用。植物中叶绿体光合作用产生大量自由基，甚至在一些植物抗病、感病和免疫过程中自由基也发挥着重要作用。,6.4 自由基与癌症,1.自由基与致癌物活化 化学致癌剂（多环芳烃、芳胺、硝基和亚硝基化合物）须经过一个代谢或体外活化阶段，从分子状态改变成自由基后才致癌。体外经光、电、辐射或燃烧可活化形成自由基。体

41、内活化主要在肝、肾的微粒体和消化道菌落中进行，它是被NADPH-细胞色素P450系统催化的一系列氧化还原过程。,6.4 自由基与癌症,2.自由基与诱癌和促癌作用 细胞发生癌变须经历诱发和促进两步。诱发阶段，人成纤维细胞在荧光诱发下发生染色体断裂和交换是由于产生了H2O2和OH自由基破坏碱基，使DNA链断裂或交联，引起染色体异常，最终导致细胞突变。脂质过氧化物既能致癌又能致突变。,6.4 自由基与癌症,2.自由基与诱癌和促癌作用促癌阶段，自由基参与促癌过程的根据为：多种促癌剂本身能产生自由基典型的促癌剂刺激氧自由基产生，且它的促癌能力与其产生自由基能力相平促癌剂抑制抗氧化防御机制许多抗氧化剂（V

42、e、Vc等）能抑制促癌剂的促癌作用，也能抑制自由基产生,6.4 自由基与癌症,3.自由基与抗癌作用 活性氧有杀伤正常细胞能力，癌细胞内抗氧化酶普遍下降，活性氧对癌细胞杀伤力更大。一些抗肿瘤抗生素（道诺霉素、阿霉素）含有醌式结构，它们可通过半醌自由基与氧生成O2-。（醌类抗癌药物共同机理）其它许多抗肿瘤抗生素（黑孢霉素、博莱霉素等）也都与自由基有关。,6.5 自由基与衰老,衰老的自由基学说1956年由Harman提出的，认为随着年龄增大的退行性变化是有自由基引起的组织随机毒害的结果。正常情况下，机体内自由基的产生与清除处于动态平衡。当自由基产生增高或自由基清除减弱，过量的自由基对巨细胞的重要生物

43、大分子化学结构产生破坏。,6.5 自由基与衰老,自由基的损伤作用1.脂质过氧化和生物膜的损伤 自由基对细胞膜的损伤是作用于细胞膜及亚细胞器膜上的多聚不饱和脂肪酸，使其发生脂质过氧化反应，一方面自由基与膜上的酶或/和受体共价结合，改变膜成分的活性及其结构，另一方面膜上巯基被氧化，造成膜运动过程紊乱，导致膜流动性下降，膜脆性增加，细胞内外离子交换障碍。,6.5 自由基与衰老,自由基的损伤作用2.核酸的损伤这是造成生理紊乱并加速衰老的一个重要因素。其中DNA的损伤占重要地位。最普通类型有:无碱基位点：核苷酸尤其嘌呤上会发生N-核糖键断裂碱基-核苷酸变更嘧啶二聚体：双链DNA单股上相邻两个相同嘧啶碱基

44、能形成二聚体。,6.5 自由基与衰老,自由基的损伤作用3.胶原蛋白的变化 胶原蛋白是结缔组织和细胞外间质的主要成分，它的溶解度随着年龄增加而降低，老年时胶原蛋白多肽链间共价交联（由赖氨酸氧化酶引起）程度增加，各种氧自由基水平升高易促使交联，进而导致结缔组织理化性质改变并影响其机能。,6.5 自由基与衰老,防衰老1.抗氧化能力与衰老和寿命关系 根据实验发现，不同的哺乳动物血清的过氧化物生成量随可期寿命的增大而降低；不经温育直接测量不同哺乳动物的血清的过氧化物含量，其量与可期寿命呈强负关系。由此说明，不同物种其抗氧化能力越强则寿命越长。,6.5 自由基与衰老,防衰老2.防衰老 生物组织总抗氧化能力

45、是一种可代偿的稳态，不受个别抗氧化剂的消长的影响。降低代谢能减缓衰老，延长寿命。包括人类在内的许多动物总是雌性寿命较长。X染色体带有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，该酶在生成NADPH中起关键作用。NADPH可使自由基清除剂GSH维持在还原型。,6.5 自由基与衰老,防衰老2.防衰老 限食是延长寿命最有效的手段之一。在保证营养下，从幼年起即减少2/3左右的食量，可明显延长哺乳动物寿命，使体重和代谢下降，肝、肾细胞体积变小，单位重量细胞数增多，每个细胞耗氧量减少，故而活性氧也变少，线粒体少受到活性氧攻击，生物膜过氧化反应减弱。,6.6 自由基与其他疾病,自由基还与不少疾病有关，比如：老年性白内障、自

46、身免疫性疾病、缺血-重灌流损伤、精神病等有关。,6.7 自由基与植物逆境生理,植物产生O2-的方式有二：氧化酶催化反应中伴生O2-。这类酶有硝基丙烷双氧化酶、半乳糖氧化酶、过氧化物酶类等。还原态化合物与氧气作用生成O2-。这类化合物有黄素、铁氧还蛋白、二元酚、喋啶等。光合作用也产生还原态物质。这是植物体内产生O2-的重要途径。,6.7 自由基与植物逆境生理,植物体防御自由基系统既有抗氧化酶系（如SOD、CAT等），又有自由基清除剂（如GSH、Vc、Ve等）。此外有些生理反应也有利于防止自由基产生，如光呼吸可通过消耗NADPH，有利于还原态铁氧还蛋白将电子传给NADP+，而不利于生成O2-。植物

47、处于逆境（如强光、干旱等），体内会产生过量的氧自由基，如不能及时清除则对机体产生损伤。,6.7 自由基与植物逆境生理,SO2的损伤作用 SO2是空气中的主要污染物之一。它能侵入植物产生多种自由基损伤机体。高浓度的SO2使植物发生缺绿病、坏死或过早脱叶。过氧化酶是对SO2最敏感的酶之一。其活性的增加是植物对SO2胁迫的保护反应，因为它可使毒性较高的SO32-氧化成毒性较低的SO42-。,6.7 自由基与植物逆境生理,光氧化作用 一个分子吸收光能后跃迁成短寿命的单线激发态，寿命为10-9-10-6s，在这极短时间内或释放激发能弛豫成基态S0，或经能量系统间转换变成寿命较长的三线态3S(10-3-1

48、01s).,6.7 自由基与植物逆境生理,光氧化作用 3S寿命较长，来得及在弛豫前与分子作用，可使附近的分子A变成半还原态A+，A+极易被氧化：3S+AS-+A+A+O2 AO2 S-+O2 S0+O2-A+O2-AO2 3S+O2 S-+O2-S-+A S0+A+光敏反应中也产生1O2，它同样能氧化基质：3S+O2 S0+1O2 1O2+A AO2,6.7 自由基与植物逆境生理,光氧化作用 概括的说，生物系统或细胞在染料和氧气的参与下，受特定波长光照射后产生损伤或死亡，此反应称为光敏反应。必要条件：氧、敏化剂和能被敏化剂是吸收的光 天然敏色素有叶绿素、海棠素、卟啉、香豆素。植物生理学中的光氧

49、化作用就是光敏作用，指的是植物绿色组织在强光下，形成过量的O2-和1O2，超出了叶绿体防御系统的负荷，诱发了脂质过氧化，对膜系统造成伤害。,6.7 自由基与植物逆境生理,干旱 耐旱植物在干旱时能提高SOD和CAT活性，抑制脂质过氧化，防止膜损伤；而干旱敏感植物不能控制脂质过氧化反应，使得膜损伤并导致细胞死亡。可见植物的耐旱能力与抗氧化性酶的活性及对脂质过氧化反应的控制能力密切相关。,6.7 自由基与植物逆境生理,综上，当植物处于逆境条件下，体内自由基产生和清除的平衡遭到破坏，过量的自由基可使膜脂质过氧化而损伤膜功能，表现为膜通透性增大，离子泄漏；同时也可使叶绿素、蛋白质等氧化；严重时可造成植株

50、死亡。在轻微逆境条件下生长的植物有一定的适应作用，表现为一些防御性酶活性增高，自由基清除剂含量增多。因此，常用自由基防御性酶活性高低做为对逆境耐受力的指标或抗性锻炼的指标。,6.8 一氧化氮自由基,NO的性质 在NO分子轨道上含有一个未配对电子，所以它是自由基，故特采用NO表示。物性：气体，难溶于水（1mmol/L），具脂溶性 化性：活泼，与Fe2+有很高亲和力，能与Cu、Mg发生反应。与O2极易生成NO2(也是自由基)。NO可与O2-生成过氧亚硝基阴离子（ONOO）质子化后很快分解成OH和NO2。还可相互作用生成一系列有重要生物功能的自由基和硝基化合物。,6.8 一氧化氮自由基,体内NO的生